人DAF基因在转基因小鼠中的遗传与表达

为研究人ＤＡＦ基因在小鼠体内遗传与表达的规律,从质粒ｐＳＦＦＶ－ＤＡＦ分离出一段包含人ＤＡＦ基因的ＤＮＡ片段。采用受精卵显微注射法建立转人ＤＡＦ基因小鼠。提取出生小鼠的染色体ＤＮＡ,经Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ与Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ杂交相结合确定首建转基因小鼠,并经Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ杂交研究人ＤＡＦ基因在转基因小鼠体内的遗传特征,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交确定其表达情况。小鼠受精卵经基因导入后,共生出２４只小鼠,其中４只被确定为首建转基因小鼠,整合率为１５％,在首建转基因小鼠两两交配生出的Ｆ１代小鼠中分别有７０％和７５％继续携带人ＤＡＦ基因。首建转基因小鼠中有１只小鼠在ＲＮＡ水平表达了人ＤＡＦ基因。可见,人ＤＡＦ基因整合入小鼠基因组中,并能够稳定遗传及表达。     

基因定位新技术

最近,美国加州伯克利劳伦斯(LBL)实验室的科学家,创立了一种新的染色体基因定位法。研究者将该项新技术称为“随机-断裂定位法”。声称对标定染色体端部以里的DNA序列快速方便。该研究室细胞分子生物学组的Game博士认为,这项技术在只知DNA序列所在染色体情况下尤为有用。虽只适用于重复序列较少的DNA序列,但应能包括需进行定位的多数基因。染色体断裂设想只发生一次断裂的染色体,可帮助理解随机-断裂定位法。因为一个发生一次断裂的染色体,包含     

分泌抗脊髓灰质炎 Ⅱ型病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系

许多年来细胞生物学家进行了很多有关细胞杂交的实验研究,将具有不同遗传特性的两种动物细胞进行融合,形成一种新的杂交细胞,用来进行特定基因在染色体上的定位、基因表达以及动物细胞其它遗传特性的变化等方面的研究。为了观察免疫球蛋白产生的遗传控制,许多实验室进行了小鼠骨髓瘤细胞与其它细胞系之间相互融合的试验。在这样的研究中,Khletr和Milstein 1975,1976)证明,培养的小鼠骨髓瘤细胞能够同用羊红血球免疫了的动物脾细胞发生融合,从中选择出少量的杂交瘤细胞,它可在体     

对ERP非专业成员有用的遗传术语词汇表（2）

基因型 动物的基因组成。 基因分型 通过可见表型（动物的外观,如小鼠皮毛颜色标记）或活组织DNA分析,确定动物基因型。 生殖细胞 精子或卵子（卵母）细胞及它们的前体。生殖细胞只含有一套染色体,体细胞（及其他细胞）含有两套染色体。 生殖细胞系 动物体内可以产生生殖细胞的细胞。     

通过微型细胞转入外源染色体的研究

通过微型细胞与整个细胞融合的方法,将小鼠B82HTQ_2细胞(TK~-)的三条染色体导入到小鼠PG19细胞(HGPRT~-)中去,被导入的X染色体使PG19细胞恢复了HGPRT功能。经过连续6个月的体外培养和小鼠体内接种实验证明,这三条外源染色体在宿主PG19细胞里是相当稳定的。用细胞分类器进行的荧光抗体分析表明,杂交细胞M_(?-1)没有亲本B82HTQ_2细胞特有的膜表面抗原H-2~k,这就证明了用微型细胞作为媒介物,可以在不引入外源主要组织相容性抗原基因(MHC)的情况下,实现基因的互补和导入新的遗传物质。本文还介绍了诱导产生B82HTQ_2微核化细胞的最适宜条件、微型细胞的制备和纯化系统以及对微型细胞表面结构的扫描电镜观察结果,并对M_(?-1)细胞的致癌性进行了初步的讨论。     

应用荧光原位杂交技术检测人β^E珠蛋白基因小鼠染色体上的整合状态

为将荧光原位杂交技术应用于基因定位研究中,探讨一种能有效地检测转基因动物染色体上外源基因整合状态的实验方法,对小鼠腹腔注射秋水仙素后,取转基因小鼠骨髓制备中期染色体,将传统的FISH方法加以改进,检测外源基因在转基因小鼠染色体上的整合状态。检测结果表明,外源人β^E珠蛋白基因已稳定地整合于小鼠染色体上,FISH能直观地反映外源基因在转基因动物染色体上的整合状态,该方法可对转基因动物及基因转移研究中的外源基因整合反进行染色体定位检测。     

导入小鼠L细胞的人α干扰素基因的调控转录

用无性繁殖的人染色体干扰素-α_1基因转化小鼠细胞,此基因同疱疹胸苷激酶基因连接作为筛选标记。13~*个细胞系中的8个含有人干扰素基因。用新城病毒侵染来刺激人干扰素mRNA的合成--此合成过程与内源的小鼠干扰素基因合成mRNA同时进行。     

胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠的建立及鉴定

组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠是进行组织特异性基因剔除研究的重要工具。为了建立胰腺组织特异性Cre转基因小鼠,我们通过PCR克隆了大鼠胰岛素基因启动子,并用它指导Cre基因在胰岛细胞中的特异性表达。在Cre重组酶基因5′端添加了真核核糖体结合序列和核定位序列以使Cre重组酶能穿越核膜在细胞核中发挥功能;同时,在Cre基因3′端添加了含内含子的3′端人生长激素基因。表达载体经显微注射导入小鼠受精卵以建立转基因小鼠。PCR检测显示共获得7只Cre整合阳性的转基因首建者小鼠;RTPCR结果表明其中1只首建者小鼠的子代鼠在胰腺中转录了外源基因,进一步的Southern杂交结果表明,该转基因小鼠能够在胰腺中表达有功能的Cre重组酶。      

小鼠染色体畸变类型研究

世界卫生组织对人体细胞染色体分析方法作了详细的规定,使各实验室的结果便于比较。小鼠是遗传学研究的常用动物,但迄今关于小鼠体细胞、生殖细胞染色体畸变分析方法尚无统一规定。小鼠的染色体属端着丝粒染色体,其结构畸变与人类的染色体结构畸变类型     

用DNA分子杂交研究两种人体胸苷激酶基因间的同源性

本实验从人体细胞质胸苷激酶(TK-C)基因分离出不含Alu重复顺序的3个DNA片段,分别次级克隆在质粒pBR322上,定名为pRR0.92,pXR1.5和pHK1.25。用pXR1.5和pHK1.25为探针,作Southern印迹杂交分析,都不能与小鼠细胞Ltk、CD-1、A9和BALB/c的DNA杂交。但是pXR1.5能与中国仓鼠细胞E36 DNA 23kb Bam HI片段杂交,出现信号很弱的杂交带.这提示以TK-C基因来说,人同中国仓鼠间的同源程度似大于人同小鼠的同源程度。在降低杂交严紧度的条件下,pHK1.25能与含人体16号染色体而不含17号染色体的人鼠杂种细胞DNA杂交,只是杂交信号极弱。我们推测人体TK-C基因(位于17号染色体)与人体TK-M基因(位于16号染色体)可能有某种程度的同源性,pHK1.25对进一步克隆TK-M基因也许是有用的。     

四细胞杂交克隆的NORs活性和均染区的巨染色体

通过聚乙二醇使3个小鼠细胞与1个中国仓鼠骨髓细胞融合,获得四细胞杂交克隆。在第6世代,该杂种细胞含有100条小鼠染色体和5条仓鼠染色体。本文报道在杂种细胞中双亲NORs活性均受抑制,不仅73.2％的仓鼠NORs活性被抑制,而且还有18.3％的小鼠NORs失去了活性。由于在杂种细胞中,仓鼠第3号染色体上的NORs活性仍保留它原来的91.2％,因此我们的结果表明:不同染色体上18s和28s rRNA基因的转录活性可有明显的差异,这可能与它们所在的染色体结构有关。我们首次报道了杂种细胞中所出现的均染色区巨染色体,并对这条巨染色体进行了G-带、C-带和Ag-NORs的分析。对这条巨染色体与18s和28srRNA基因扩增的关系进行了初步讨论。     

小鼠β-酪蛋白基因序列调控人t-PA突变体基因在小鼠乳腺的表达

为验证克隆的小鼠β－酪蛋白基因序列调控外源基因表达的能力,将人人t-PA突变体基因的信号肽－前肽编码序列用小鼠β－酪蛋白的信号肽编码序列替换,人t-PA突变体成熟肽cDNA融合到小鼠β－酪蛋白基因的第2外显子中,从而构建成旨在应用小鼠β－酪蛋白基因序列调控人t-PA突变体基因在小鼠乳腺中表达的载体。融合基因经显微注射到小鼠的受精卵中,285枚注射的受精卵移植到13只受体小鼠,经PCR和Southern杂交鉴定,42只出生小鼠中有12只为转基因阳性鼠。7只转基因阳性鼠乳汁中表达人t-PA突变体,最高表达水平为3．6593μg/ml,证明小鼠β－酪蛋白基因序列能够调控人t-PA突变体基因在转基因小鼠的乳汁中表达出具有生物活性的人t-PA突变体,为进一步制备了人t-PA突变体基因敲入小鼠模型提供了理论和实验依据。     

淋巴因子和干扰素

852451小鼠a千扰素基因在染色体中的定位[英〕/Lovett,M.…了EMBOJ一1984,3(7)一1643~1646〔译自DBA,1984,3(18),84一08593〕 鉴于小白鼠是研究千扰素抗病毒、抗肿瘤和其他生物调节作用的一个重要模型,所以了解小鼠干扰素基因的结构、数目和定位是很重要的。小鼠a一干扰素结构基因在染色体中的定位是采用中国地鼠x小鼠体细胞的杂交细胞的DNA与同位素标记的小鼠a一干扰素的cDNA的杂交试验来确定的。杂交细胞是用小鼠脾细胞或腹腔巨噬细胞与中国地鼠细胞系380一6经聚乙二醇融合而获得的。从杂交细胞和小鼠脾细胞分离的高分子量DN-A用H…     

转基因动物研究现状

导言 1980年Gordon等人将疱疹病毒胸苷激酶基因和SV40早期基因启动子重组到质粒pBR322中,再由显微注射植入小鼠受精卵原核,获得第一只转基因小鼠。原理上任何克隆基因都能永久并入哺乳动物胚胎基因组。显微注射后,外源DNA整合进细胞,随后繁衍成种系。因此通过选育能永久建立携带一个或多个新基因的动物谱系。“转基因”(Transgenic)一词应运而生。在此之前,Jaenisch(1976)观察到逆转录病毒(又称逆病毒)感染小鼠胚胎,使单个前病毒DNA插入小鼠染色体DNA。而后含异源基因的重组感染性逆病毒系统的发展导致了用     

snthr-1Bao稀毛小鼠突变基因的精确定位及克隆鉴定

snthr-1Bao稀毛小鼠足本实验室培育的呈单基因隐性遗传的突变系小鼠,突变基因已被初步定位于第9号染色体末端;为了精确定位并鉴定snthr-1Bao稀毛小鼠的突变基因,将(C57BL/6Jxsnthr-1Bao)F1代互交繁殖F2代小鼠4400余只,其中稀毛小鼠1100只,并在2个微卫星、35个可能的简单序列重复标记(simple sequence repeat,SSR)及3个酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequences,CAPS)标记中找到4个合适的基因组标记.利用这些标记及F2代稀毛小鼠将突变基因精确定位到第9号染色体距着丝粒117.763 kb及119.129kb之间1.367Mb的范用内,在其问的21个基因中确定Plcdl为稀毛突变的强力候选基因.通过对基因组的直接测序,发现snthr-1Bao稀毛小鼠基因组上有一个14883bp的缺失,这一缺失包含了Plcd1基因的4-15号外显子及Vill基因的10-19号外显子.推测极可能是Plcdl基因缺失导致snthr-1Bao小鼠出现稀毛表型.     

snthr^-1Bao佃彻稀毛小鼠突变基因的精确定位及克隆鉴定

snthr^-1Bao稀毛小鼠是本实验室培育的呈单基因隐性遗传的突变系小鼠,突变基因已被初步定位于第9号染色体末端;为了精确定能并鉴定snthr^-1Bao稀毛小鼠的突变基因,将（C57BL／6J×snthr^-1Bao）F1代互交繁殖F2代小鼠4400余只,其中稀毛小鼠1100只,并在2个微卫星、35个可能的简单序列重复标记（simplesequence repeat,SSR）及3个酶切扩增多态性序列（Cleaved amplified polymorphic sequences,CAPS）标记中找到4个合适的基因组标记。利用这些标记及F2代稀毛小鼠将突变基因精确定位到第9号染色体距着丝粒117．763kb及119．129kb之间1．367Mb的范围内,在其间的21个基因中确定Plcdl为稀毛突变的强力候选基因。通过对基因组的直接测序,发现snthr^-1Bao稀毛小鼠基因组上有一个14883bp的缺失,这一缺失包含了Plcdl基因的4-15号外显子及Vill基因的10—19号外显子。推测极可能是Plcdl基因缺失导致snthr^-1Bao小鼠出现稀毛表型。     

小鼠一个新基因mLPTS的克隆、表达及亚细胞定位

利用EST拼接技术,RT－PCR及DNA序列测定,首次成功克隆了小鼠新基因mLPTS。获得的mLPTS基因片段长1244bp,编剧了一个由332个氨基酸组成的蛋白质。该蛋白质与人的LPTS蛋白有78％的同源性,LPTS基因是本实验室通过定位候选克隆策略获得的一个新的肝癌相关基因。它在肝癌组织中不表达或低表达,并参与细胞生长的负调控。小鼠mLPTS基因在小鼠的各个组织中都有表达,与人LPTS基因的表达组织分布相同。分析比较了LPTS蛋白在不同物种间的序列同源性,发现LPTS在进化上是高度保守的,是一个具有重要功能的基因。将mLPTS基因与绿色荧光蛋白EGFP融合构建真核表达载体,在中国仓鼠卵CHO细胞中表达,发现mLPTS基因表达产物位于细胞核仁中,为进一步研究该基因的功能及作用途径提供了重要信息。     

小鼠在Ⅱ型细胞角蛋白基因CK-4和CK-8定位于第15染色体

用人的CK(细胞角蛋白)cDNA片段为探针,与小鼠-中国仓鼠杂种细胞DNA作Southern印迹杂交,将小鼠CK-4和CK-8基因定位在第15染色体。     

Stra 8基因的激活与精原干细胞的特异性分化研究

视黄酸对维持正常的雄性睾丸结构和功能起着重要的作用。近来的研究发现,在雄性生殖腺发育过程中有一组基因,它们可以被视黄酸特异性的诱导活化,称为Stra(Stimulated by Retinoic Acid)基因。从鼠源分离得到的Stra8基因编码一种细胞质蛋白,该基因只特异性的在成熟雄性生殖细胞中表达,其功能被认为与精子形成有关。为研究Stra8基因的表达特性,我们从小鼠的基因组中克隆了Stra8基因的启动子序列(1.4kb)。将Stra8基因的1.4kb启动子序列克隆到pEGFP-1载体的EGFP基因之前,构建成由Stra8基因1.4kb启动子序列调控表达绿色荧光蛋白的pStra8-EGFP载体。将其分别转化到不同类型的细胞中,如小鼠ES-129细胞、人胎儿胰腺干细胞、小鼠骨髓间充质干细胞和小鼠精原干细胞等,通过荧光显微镜观察发现,绿色荧光蛋白只在小鼠精原干细胞中表达,表明Stra8基因是组织特异性表达的基因。将pStra8-EGFP转化小鼠骨髓间充质干细胞,经G418筛选2周后,用视黄酸诱导,12h培养后,有一部分转化pStra8-EGFP载体的细胞表达绿色荧光蛋白。RT-PCR证明这些细胞中有精原干细胞特异表达基因Stra8的转录,还有生殖细胞特异表达基因CyclinA8和Oct4的转录,这些结果说明小鼠骨髓间充质细胞经视黄酸的诱导可以向生殖细胞方向分化。     

外源性人TIMP-1基因在转基因小鼠染色体上的整合及定位

为探讨外源基因人基质金属蛋白酶组织抑制物-1（human tissue inhibitor of metalloproteinase-1, hTIMP-1）基因在转基因小鼠家系染色体上的整合和精确定位,应用Southrn印迹检测外源基因在染色体上整合的位点及拷贝数.结果表明,外源基因是以单拷贝、单位点形式整合;应用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）技术检测F4～F20代转基因小鼠中外源基因的整合.结果证明,该家系转基因小鼠自F4代起是纯合子,外源基因整合在17号染色体E区;反向PCR法（Inverse PCR, IPCR）克隆出约3.8 kb外源基因整合位点处的侧翼序列.分析表明,外源基因整合在17号染色体E1.3区,ALK（anaplastic lymphoma kinase, ALK）基因第23个内含子区域.结果提示,获得的转基因小鼠为纯系,外源基因hTIMP-1已稳定整合在转基因小鼠染色体上,并能遗传给后代.