肠道病毒71型外壳蛋白VPl在Pichia pastoris酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增肠道病毒7l型(EV71)外壳蛋白VPl基因,经序列测定证实后,构建重组表达质粒pPIC9K／VPl,转化Pichia pastoris酵母宿主菌GS115,甲醇诱导表达。SDS-PAGE分析显示：表达产物的分子量约为34kD,与天然VPl大小一致。凝胶薄层扫描分析显示：目的蛋白表达量占培养上清总蛋白的60％以上。ELISA实验表明,重组蛋白VPl具有较好的抗原性。使用饱和硫酸铵分级沉淀法初步纯化的表达产物,能够较特异性地与EV7l感染者血清中的抗体产生反应,而且与抗柯萨奇病毒A16特异性抗体不产生反应。通过利用表达产物作为抗原,对156份血清的检测初步证实,重组蛋白VPl可以作为检测EV7l感染的的检测用抗原。     

肠道病毒71型外壳蛋白VP1全长在大肠杆菌中的高效表达及初步活性测定

目的:重组表达肠道病毒71型(EV71)外壳蛋白VP1全长,用于研制血清学检测试剂和疫苗研发。方法:在获得EV71全长基因并测序正确的基础上,将外壳蛋白VP1全长基因克隆到表达载体pET28a(+)上,构建重组表达质粒pET28a(+)/VP1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用双抗原夹心检测技术评价重组抗原与27份EV71抗体阳性血清和18份阴性血清的反应情况。结果:重组EV71-VP1蛋白在大肠杆菌中诱导6 h后可获得高效表达,能与27份EV71抗体阳性血清中的21份发生阳性反应,EV71双抗原夹心检测与中和血清测试结果具有很好的一致性(P0.05)。结论:实现了肠道病毒71型外壳蛋白VP1的高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定了基础。     

柯萨奇病毒A组16型衣壳蛋白VP1的原核表达及初步活性测定

目的:原核表达柯萨奇病毒A组16型(CVA16)衣壳蛋白VP1,以便于研制血清学检测试剂。方法:在基因库中钓取CVA16-VP1的全长序列,采用PCR逐步合成法合成其全长基因,测序正确后克隆到表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)/VP1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化;建立捕获免疫酶联法检测IgM抗体,检测20份手足口病阳性血清和30份阴性血清,评价重组抗原的灵敏度和特异性;采用CVA16全病毒免疫的抗小鼠血清进行Western印迹。结果:重组CVA16-VP1蛋白在大肠杆菌中获得高效表达;用重组蛋白抗原检测,20份手足口病患儿阳性血清中有4份阳性,其中1份同时为肠道病毒71型(EV71)VP1阳性,30份阴性血清无反应。结论:实现了CVA16-VP1的高效表达,初步结果显示重组蛋白具有较好的抗原性,为柯萨奇病毒A组16型诊断试剂的研究奠定了基础。     

EV71类病毒颗粒的表达和免疫原性的初步评价

目的:运用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建EV71类病毒颗粒,并对形成的类病毒颗粒的免疫原性进行初步评价。方法:构建重组杆状病毒表达载体Bacmid-P1-3CD,转染昆虫细胞sf9细胞系,获得携带EV71病毒结构基因P1和3CD蛋白酶基因的重组杆状病毒AcMNPV-P1-3CD。采用免疫荧光、Western blot及电镜观察等方法检测重组病毒表达产物及形态学特征。表达产物免疫动物后用ELISA、中和试验的方法对其免疫效果进行初步评价。结果:免疫荧光证明有特异性表达产物,Western blot结果可见大小约为39kDa的VP1特异性条带。电镜结果可观察到大小约为27nm的颗粒。免疫动物的血清ELISA抗体效价为1:776,中和抗体效价为1:588。 结论:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统能共表达EV71的P1和3CD基因,并能形成EV71类病毒颗粒。 经初步评价,形成的EV71 类病毒颗粒具有较好的免疫原性。     

肠道病毒71型北京分离株VP4基因序列及蛋白抗原性分析

为探讨肠道病毒71型(EV71)VP4基因序列与手足口病(HFMD)不同临床类型之间的关系,分析重组蛋白EV71 VP4的抗原性,并初步探讨其与柯萨奇病毒A16(CA16)重组蛋白VP4是否存在交叉反应性,对2007~2009年从北京患HFMD儿童标本分离到的10株EV71的VP4基因进行克隆测序,运用生物学软件对测序结果进行比较分析,并选择其中1株与1株同期分离的CA16的VP4分别进行原核表达;用表达产物对189份正常体检的成人及来首都儿科研究所就医的非HFMD患儿血清中的IgG进行Western Blot检测,并分析14份确诊为EV71感染和12份CA16感染患者急性期血清中的IgM抗体。分析表明这10株EV71 VP4基因核苷酸同源性为94.20%~100.00%,所推导的氨基酸序列则完全相同,从重症与轻症患儿分离的毒株之间VP4的核苷酸序列未见一致性的差异,基于EV71 VP4基因核苷酸序列的进化树分析表明2007~2009年北京地区所流行的毒株均属于C4亚型;本研究中EV71和CA16的VP4核苷酸序列的同源性为69.60%,所推导的氨基酸序列的同源性为78.60%,在运用Western Blot检测189份血清中的VP4特异性IgG时,EV71 VP4的血清阳性率为38.10%,说明其具有良好的抗原性,CA16 VP4的血清阳性率为58.20%,两者差别具有显著统计学意义(2χ=15.30,P<0.01),提示EV71 VP4与CA16 VP4没有交叉反应性;在用表达的VP4检测已确诊为相应病毒的特异性IgM时,两者皆为阴性,提示感染后机体对VP1和VP4产生不同的反应。     

兔抗肠道病毒71型截短VP1抗体的制备及鉴定

目的制备兔抗肠道病毒71型(EV71)截短VP1多克隆抗体,为EV71基础研究奠定基础。方法 RT-PCR扩增EV71VP1-N160基因(480 bp),以p GEX-6p-1为表达载体,构建重组表达质粒p GEX-6p-1-VP1-N160,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-VP1-N160融合蛋白,并对其进行纯化。以纯化的GST-VP1-N160融合蛋白作为免疫原,经背部皮下免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,ELISA检测多克隆抗体效价,间接免疫荧光法和免疫印迹检测抗体特异性。结果经双酶切鉴定,表明重组表达质粒p GEX-6p-1-VP1-N160构建正确;GST-VP1-N160融合蛋白相对分子质量为35 000~55 000,主要为不可溶性包涵体形式,其在大肠杆菌中高效表达;纯化后目的蛋白纯度约为95%,蛋白质量浓度1.9 mg/m L;免疫家兔后,免疫血清效价可达1012,抗VP1-N160多克隆抗体可以识别EV71原核表达的重组蛋白及天然病毒抗原中的VP1,特异性好。结论成功制备了抗EV71截短VP1多克隆抗体。     

Ⅲ型脊髓灰质炎病毒抗原表位嵌合蛋白的免疫学研究

目的:对以轮状病毒(RV)重组VP6蛋白为载体插入Ⅲ型脊髓灰质炎病毒(PV3)VP1蛋白上1个抗原表位(VP1的91~102、254和168位氨基酸残基)所构建的嵌合蛋白6F/PV3N1进行体外免疫学研究。方法:利用分子克隆和基因重组技术将PV3抗原表位插入RV载体蛋白,构建重组抗原表位嵌合蛋白表达质粒,转染大肠杆菌后表达重组蛋白,经SDS-PAGE确认表达产物,再通过Western印迹分析嵌合蛋白的抗原反应性。结果:用载体蛋白VP6F、轮状病毒Wa病毒株免疫的豚鼠血清抗体分别都能与VP6F和6F/PV3N1产生特异性结合;PV3免疫的豚鼠血清抗体只能与6F/PV3N1产生特异性结合,不能与VP6F产生特异性结合;PV1免疫的豚鼠血清抗体则不能与6F/PV3N1和VP6F产生特异性结合。结论:PV1、PV3之间不存在交叉反应现象,以RV VP6为载体构建的嵌合蛋白6F/PV3N1具有较好的免疫原性,为研发RV/PV3嵌合疫苗提供了基础。     

猪细小病毒VP2蛋白的主要抗原表位基因的原核表达及检测应用

将构建好的重组质粒PET-VP2Ⅰ转化宿主菌BL21,利用IPTG(1mmol/L)诱导实现了PET-VP2Ⅰ蛋白主要抗原域VP2Ⅰ融合蛋白的高效表达。通过Western-blot检测证明表达的重组蛋白具有良好的免疫学活性。表达产物经HisBind层析柱纯化后作为诊断抗原初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。结果表明:抗原的最佳包被浓度为3.5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶40,待检血清阳性标准初步定为OD490>0.51,且待检血清的OD490值与阴性血清的OD490值的比值大于2.1。     

鸭病毒性肝炎病毒VP1基因表达及其抗体检测ELISA方法的建立

[目的]研究DHV VP1基因在大肠杆菌中的表达,并以纯化的重组蛋白为抗原建立鸭病毒性肝炎抗体检测ELISA方法.[方法]采用RT-PCR技术,扩增VP1基因,与Pmd18-T载体进行连接,构建DHV VP1基因克隆重组质粒.然后定向插入到Pet-32a( )表达载体,筛选原核表达载体Pet-32a-VP1,进行ITPG诱导表达分析.以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并初步应用于临床.[结果]DHV VP1基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达.Western blot检测表明,表达的重组蛋白能与鸭肝炎阳性血清发生特异性反应.确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为5 ug/孔,血清最佳稀释度为1:100,临界值为OD450值≥0.302,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性.通过对80份血清样品的检测表明,该方法与中和试验的符合率为97.5%,初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测.[结论]以大肠杆菌表达的DHV VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可用于鸭病毒性肝炎抗体的检测.     

人类肠道病毒71型亚单位疫苗壳聚糖佐剂作用的研究

为了解人类肠道病毒71型(EV71)重组保护性衣壳蛋白(rVP1)亚单位疫苗壳聚糖佐剂的作用,本研究利用rVP1蛋白与壳聚糖佐剂制备的疫苗口服免疫新西兰白兔,通过ELISA方法检测兔血清、粘膜洗液(小肠、鼻腔和肺)及粪便中特异性IgG、IgA抗体水平,中和试验检测血清中和抗体滴度,并通过抗原刺激体外培养的兔脾淋巴细胞分泌细胞因子(IFN-γ、IL-4)的水平评价rVP1口服免疫效果。结果显示,单纯口服rVP1蛋白仅可诱导产生较低水平的血清IgG和粘膜IgA抗体,而含佐剂疫苗组与单纯抗原免疫组差异显著,并可诱导产生中和抗体。细胞免疫检测结果显示rVP1含佐剂组兔脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4水平明显高于未加佐剂组。本研究为研制EV71VP1口服疫苗奠定了基础。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。     

青蒿素生物合成机理研究现状

本文总结了目前有关青蒿素生物合成机理方面的研究,主要包括青蒿素生物合成中生理因子的影响,青蒿素生物合成中间体及前体,青蒿素生物合成细胞定位等。指出了存在的一些问题及今后的研究发展前景。