ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中靶基因CYP450和FG的表达

【目的】本研究旨在通过饲喂ame-miR-79的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减,探究ame-miR-79对幼虫肠道内靶基因表达的调控作用。【方法】通过分子克隆与Sanger测序验证意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的序列真实性。通过饲喂mimic-miR-79和inhibitor-miR-79对意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减。采用相关生物信息学软件进行ame-miR-79的靶基因预测与分析。通过RT-qPCR检测ame-miR-79的过表达和敲减效果及过表达和敲减ame-miR-79后靶基因的相对表达量。【结果】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在。与无义模拟物(nonsense mimic, mimic-NC)组相比,mimic-miR-79组的4-6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量皆极显著上调;与无义抑制物(nonsense inhibitor, inhibitor-NC)组相比,inhibitor-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量显著下调,6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量极显著下调。ame-miR-79共靶向303个基因,涉及27个GO条目和179条KEGG通路。相较于mimic-NC组,靶基因细胞色素P450基因CYP450在mimic-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内均极显著下调表达,而在6日龄幼虫肠道内上调表达;靶基因fringe糖基化转移酶(fringe glycosyltransferase, FG)基因在4日龄幼虫肠道内下调表达,在5日龄幼虫肠道内显著下调表达,而在6日龄幼虫肠道内上调表达。相较于inhibitor-NC组,CYP450在inhibitor-miR-79组的4日龄幼虫肠道内极显著上调表达,在6日龄幼虫肠道内上调表达,而在5日龄幼虫肠道内下调表达;FG的表达水平在4日龄幼虫肠道内显著上调,在5和6日龄幼虫肠道内极显著上调。【结论】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在;通过饲喂模拟物和抑制物能分别实现意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的有效过表达和敲减;ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内CYP450和FG的表达。     

ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道发育过程的调控作用

【目的】本研究旨在揭示ame-miR-14在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道发育过程的调控作用。【方法】通过Stem-loop RT-PCR和Sanger测序分别验证ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂6日龄幼虫肠道中的表达和序列真实性。饲喂ame-miR-14的模拟物(mimic-ame-miR-14)和抑制物(inhibitor-ame-miR-14)及其相应的阴性对照mimic-NC和inhibitor-NC对ame-miR-14分别进行过表达和敲降,利用RT-qPCR检测意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中ame-miR-14的表达量。利用生物信息学软件预测ame-miR-14的靶基因并进行相关分析。利用RT-qPCR检测ame-miR-14的过表达和敲降后其靶基因FoxO和Hedgehog在4-6日龄幼虫肠道中的相对表达量。【结果】ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂6日龄幼虫肠道中真实存在和表达。相较于饲喂mimic-NC,饲喂mimic-ame-miR-14后ame-miR-14表达量在意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中均为显著上调;相...     

意大利蜜蜂幼虫肠道的miRNAs的生物信息学预测及分析

【目的】蜜蜂肠道是食物消化和营养吸收的主要部位,同时也是抵御病原侵染的重要场所。本研究旨在对意大利蜜蜂Apismelliferaligustica(简称意蜂)幼虫肠道的microRNAs(miRNAs)及其靶基因进行深入分析,进而解析miRNAs在幼虫肠道发育和生长过程中的作用。【方法】利用small RNA-seq(sRNA-seq)技术对意蜂4、5和6日龄幼虫肠道进行测序,通过相关生物信息学软件对意蜂幼虫肠道的miRNAs进行预测及分析。利用TargetFinder软件预测miRNAs的靶基因,然后将靶基因通过BLAST软件进行GO和KEGG数据库的功能注释。利用Cytoscape软件构建miRNAs与其靶向结合的mRNAs的调控网络。【结果】意蜂幼虫肠道样品的测序共获得96 329 456条有效标签序列(Clean tags),预测出560个miRNAs,包括45个novelmiRNAs。上述miRNAs的长度主要分布在17-27nt之间,且不同长度的miRNAs的首位碱基偏向性具有明显差异。表达量聚类分析结果显示,331个miRNAs为4、5和6日龄幼虫肠道所共有且表达量较为稳定,随着发育时间延长,特有miRNAs的表达水平呈总体增加的趋势。利用TargetFinder软件共预测出16479个意蜂幼虫肠道的靶基因,其中有8132和3361个可分别注释到GO和KEGG数据库,进一步分析发现有224个靶基因注释在Wnt信号通路,分别有2个和27个靶基因与保幼激素和蜕皮激素的调控密切相关。【结论】本研究在全基因组水平对意蜂幼虫肠道的miRNAs进行预测和分析,研究结果不仅丰富了意蜂的miRNAs信息,也为深入研究意蜂幼虫肠道的生长发育机理打下了初步基础。     

东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-12220及其靶基因的表达谱

东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染成年蜜蜂导致蜜蜂微孢子虫病。本研究旨在验证东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-12220的存在和表达,并检测nce-miR-12220及其靶基因在病原侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica (简称意蜂)工蜂过程的表达谱。Stem-loop RT-PCR和Sanger测序结果显示nce-miR-12220真实存在和表达。靶向预测结果显示nce-miR-12220共靶向KRAB-A和γ tubulin等15个基因。上述靶基因可注释到19个GO条目和3条KEGG通路。RT-qPCR结果显示,相较于接种后1 d (1 day post infection,1 dpi),nce-miR-12220在2 dpi上调表达,而在3-12 dpi阶段总体表现出显著下调表达的趋势。类似地,与1 dpi相比,靶基因KRAB-A在2 dpi上调表达,而在3-12 dpi阶段总体呈下调表达的趋势。另外,与1 dpi相比,靶基因γ tubulin在2-12 dpi阶段总体表现出显著下调表达的趋势。上述结果表明nce-miR-12220与KRAB-A和γ tubulin之间存在潜在的靶向结合和正向调控关系;东方蜜蜂微孢子虫通过下调表达nce-miR-12220抑制KRAB-A的表达进而促进增殖;意蜂工蜂可能通过抑制东方蜜蜂微孢子虫的γ tubulin表达抵御病原侵染。研究结果明确了nce-miR-12220及其靶基因KRAB-A和γ tubulin在东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂工蜂过程中的动态表达规律,为深入探究nce-miR-12220在病原侵染中的功能及调控机制提供了理论和实验依据。     

意大利蜜蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的差异表达微小RNA及其靶基因分析

【目的】蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis(简称球囊菌)是一种特异性侵染蜜蜂幼虫肠道的致死性真菌病原。微小RNA(microRNA,mi RNA)是一种在转录后水平对m RNA进行负调控的关键调控因子。本研究旨在对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称意蜂)幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的差异表达mi RNAs(DEmiRNAs)及其靶基因进行深入分析,为揭示DEmiRNAs在胁迫应答中的作用提供重要信息。【方法】利用small RNA-seq(s RNA-seq)技术对正常及球囊菌侵染的意蜂6日龄幼虫肠道(分别表示为Am CK和Am T)进行测序,通过相关生物信息学软件对DEmiRNAs进行预测和分析。利用TargetFinder软件预测DEmiRNAs的靶基因,然后利用Blast软件对靶基因进行GO和KEGG数据库的功能注释。通过Cytoscape软件构建DEmiRNAs与其靶m RNAs的调控网络。通过茎环实时荧光定量PCR(stem-loop RT-qPCR)验证测序数据的可靠性。【结果】Am CK和Am T的测序分别得到9 230 496和10 823 667条有效序列标签; Am CK vs Am T比较组中包含15个上调和6个下调mi RNAs,分别结合3 503和3 252个靶基因,它们可分别注释到40和39个GO terms以及104和99条代谢通路;进一步分析发现调控网络中的17个DEmiRNAs靶向结合116个与丝氨酸蛋白酶相关的m RNAs,14个DEmiRNAs靶向结合54个与泛素介导的蛋白水解相关的m RNAs。Stem-loop RT-qPCR验证结果显示随机选择的4个DEmiRNAs (mi R-251-x,mi R-9277-y,mi R-1672-x和mi R-4968-y)的表达量变化趋势与测序结果一致,表明测序数据真实可信。【结论】本研究率先对意蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的DEmiRNAs及其靶基因进行预测与分析,提供了mi RNAs的表达谱和差异表达信息。ame-miR-927b,mi R-429-y和mi R-8440-y等DEmiRNAs可能参与对丝氨酸蛋白酶的调控和对泛素介导的蛋白水解的调控,DEmiRNAs与靶基因之间存在复杂的调控网络关系。DEmiRNAs可参与到意蜂幼虫肠道与球囊菌间的互作。     

过表达和敲减ame-miR-13b对意大利蜜蜂幼虫肠道内基因表达的影响

【目的】微小RNA(microRNAs, miRNAs)在昆虫的繁殖、发育和免疫等重要生命活动的调控过程中扮演关键角色。本研究旨在探究在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫个体水平过表达与敲减ame-miR-13b对其靶基因表达的影响,为深入探究ame-miR-13b调控意大利蜜蜂幼虫肠道发育的分子机理提供理论和实验依据。【方法】根据ame-miR-13b的核苷酸序列设计合成相应的模拟物mimic-ame-miR-13b和抑制物inhibitor-ame-miR-13b及其对照mimic-NC和inhibitor-NC,混入饲料后饲喂意大利蜜蜂3日龄幼虫,每12 h更换一次饲料,连续饲喂6次,以分别过表达和敲减ame-miR-13b;通过RT-qPCR检测过表达和敲减ame-miR-13b后意大利蜜蜂幼虫肠道中ame-miR-13b及其靶基因Ecr, Egfr和P450 18a1的表达量。【结果】与mimic-NC饲喂组相比, mimic-ame-miR-13b饲喂组中ame-miR-13b在意大利蜜蜂4和6日龄幼虫肠道中均显著上调表达;与饲喂inhibitor-NC组相比,inhibitor-ame-miR-13b饲喂组中ame-miR-13b在4日龄幼虫肠道中下调表达,在5和6日龄幼虫肠道中显著下调表达。与mimic-NC饲喂组相比,过表达ame-miR-13b组中意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道中Egfr的表达量显著降低,而Ecr和P450 18a1的表达量均显著升高。与inhibitor-NC饲喂组相比,敲减ame-miR-13b组中意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道中Egfr上调表达但不显著,Ecr显著上调表达,而P450 18a1显著下调表达。【结论】通过饲喂法在意大利蜜蜂幼虫个体中成功实现了miRNA的过表达和敲减;ame-miR-13b与Egfr之间存在潜在的负调控关系。     

过表达和敲减ace-miR-3720对中华蜜蜂工蜂幼虫肠道的靶基因表达和重量的影响

【目的】本研究旨在明确ace-miR-3720在中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂幼虫肠道发育中的功能,并为进一步探究ace-miR-3720调控肠道发育的分子机理提供理论和实验依据。【方法】根据ace-miR-3720的核苷酸序列设计合成相应的模拟物mimic-miR-3720和抑制物inhibitor-miR-3720,通过饲喂中华蜜蜂工蜂幼虫对ace-miR-3720分别进行过表达和敲减。采用RT-qPCR检测过表达和敲减ace-miR-3720后4-6日龄幼虫肠道内ace-miR-3720及其靶基因CKⅠ,MAPK1和βGBP1的相对表达量;使用分析天平称重过表达和敲减ace-miR-3720后的幼虫肠道重量。【结果】相较于无义模拟物(nonsense mimic, mimic-NC)组,mimic-miR-3720组中ace-miR-3720表达量在中华蜜蜂4和5日龄幼虫肠道中均极显著上调,在6日龄幼虫肠道中显著上调;相较于无义抑制物(nonsense inhibitor, inhibitor-NC)组,inhibitor-miR-3720组中ace-miR-3...     

意大利蜜蜂工蜂幼虫nkd基因的生物信息学分析及功能研究

【目的】意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)是西方蜜蜂(Apis mellifera)的亚种之一。蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)侵染意蜂幼虫导致白垩病。本研究对西方蜜蜂裸表皮蛋白(naked cuticle, Nkd)进行保守基序预测和系统进化分析,并通过RNAi明确nkd基因对意蜂工蜂幼虫体重及宿主响应蜜蜂球囊菌胁迫的免疫应答的影响,以期丰富西方蜜蜂基因nkd的信息,并揭示意蜂幼虫nkd的功能。【方法】通过MEME软件预测西方蜜蜂和其他9个物种Nkd蛋白的保守基序。采用MEGA X软件对西方蜜蜂及其他9个物种的Nkd蛋白进行系统进化分析。通过饲喂dsRNA对意蜂幼虫肠道内的nkd进行RNAi。使用电子天平对幼虫进行称重。利用RT-qPCR检测nkd基因的干扰效率及免疫基因的相对表达量。【结果】西方蜜蜂与东方蜜蜂、柑橘凤蝶、家蚕和金凤蝶的Nkd蛋白均含有3个保守基序(motif 1、motif 2 和motif 3),说明上述5个昆虫物种的Nkd具有较高的保守性。西方蜜蜂与东方蜜蜂的Nkd蛋白聚为一支,说明二者的亲缘关系近。与dsRNA-egfp组相比,dsRNA-nkd组5日龄和6日龄幼虫肠道内nkd的表达量均极显著下调(P<0.001),干扰效率分别为49.60%和56.40%。另外,dsRNA-nkd组幼虫体重较dsRNA-egfp组显著下降,说明nkd显著影响幼虫体重。RT-qPCR结果显示,4日龄幼虫肠道内abaecin、apidaecin、birc5、defensin-1和PGRP-S2均被激活表达;5日龄幼虫肠道内abaecin、apidaecin、birc5和defensin-1均被激活表达,PGRP-S2的表达受到抑制;6日龄幼虫肠道内abaecin被激活表达,而apidaecin、birc5、defensin-1和PGRP-S2的表达均受到抑制,说明上述5个免疫基因在宿主响应胁迫的过程中呈不同的表达趋势,均参与宿主的免疫应答,nkd与abaecin和apidaecin的表达存在负向调控关系。【结论】西方蜜蜂的Nkd蛋白含有3个保守基序(motif 1、motif 2和motif 3),西方蜜蜂与东方蜜蜂的Nkd蛋白亲缘关系最近,通过饲喂dsRNA能有效干扰意蜂工蜂幼虫肠道内nkd表达,nkd影响意蜂工蜂幼虫体重及宿主对蜜蜂球囊菌胁迫的免疫应答。     

参与调控意大利蜜蜂工蜂中肠基因表达的东方蜜蜂微孢子虫miRNA的组学解析及其调控网络

[目的]本研究结合前期已获得的miRNA和mRNA组学数据对东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae 的差异表达 miRNA(differentially expressed miRNA,DEmiRNA)靶向意大利蜜蜂 Apis mellifera ligustica 工蜂中肠的 mRNA 和差异表达 mRNA(d...     

三种微小RNA在意大利蜜蜂工蜂蛹期发育过程中的表达谱及潜在功能

[目的]意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica是生产性能优良的西方蜜蜂Apis mellifera亚种.本研究旨在利用分子生物学手段揭示3种微小RNA(microRNA,miRNA) ame-miR-13b,ame-miR-100和ame-miR-bantam调控蛹期变态发育的分子机理.[方法]通过...     

转录组分析揭示东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂的分子机制

【目的】本研究旨在通过差异表达基因(differentially expressed gene, DEG)分析以及毒力因子和其他侵染相关因子分析,在转录组水平揭示东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的分子机制。【方法】基于前期已获得高质量的东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子(NcCK)及侵染意大利蜜蜂工蜂7和10 d的东方蜜蜂微孢子虫(分别为NcT1和NcT2)转录组数据,根据P≤0.05且|log₂(Fold change)|≥1的标准,通过比较分析筛选出NcCK vs NcT1, NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2比较组的DEG。通过相关生物信息学软件对上述DEG进行Venn分析、GO分类和KEGG代谢通路富集分析。根据Nr和KEGG数据库注释信息和相关文献进行对东方蜜蜂微孢子虫的毒力因子和侵染相关因子的统计和分析。通过RT-qPCR验证转录组数据及DEG表达趋势。【结果】从NcCK vs NcT1, NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2比较组分别鉴定出1 397, 1 ...     

低温胁迫下意大利蜜蜂预蛹的差异表达基因趋势分析

【目的】蜜蜂是典型的具有发育狭温性的全变态昆虫。本研究以对低温最敏感的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica预蛹为研究对象,通过低温胁迫不同时间的差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)趋势分析,探讨低温胁迫对蜜蜂发育影响的关键基因。【方法】对3日龄意大利蜜蜂封盖子预蛹进行20℃低温胁迫18 h(T18)和36 h(T36),以未经低温胁迫的预蛹为对照(CK),通过Illumina HiSeq^TM平台进行转录组学测定。利用Short Time-series Expression Miner(STEM)软件对2个处理组与对照组比较共有的差异表达基因进行趋势分析,再进一步对显著富集趋势模式中富集的差异表达基因进行GO分类和KEGG pathway分析。利用RT-qPCR对随机挑选的5个DEGs的表达模式进行验证。【结果】对检测到1 062个T18 vs CK和T36 vs CK共有的DEGs进行趋势分析,发现3个显著的基因表达模式,包括2个上调表达模式(Profile 6,有539个基因;Profil...     

Regulation of larval cuticle protein gene expression in Drosophila melanogaster

Genes that encode 3rd instar larval cuticle proteins (LCP's) of Drosophila melanogaster are located in at least two chromosomal sites. The genes encoding four of the five predominant LCP's are located in a cluster at the chromosomal region 44D. They are organized in pairs that are transcribed divergently, and expressed with different timing during the third larval instar. Towards understanding the basis of gene regulation within the 44D cluster, we have analyzed genetic variants, including the 2-3 variant, which has an insertion of a copia-like transposable element, H.M.S. Beagle, within the 44D cluster. The Beagle element appears to inactivate the LCP-3 gene by inserting into its TATA box, but also may cause the precocious expression of two other LCP genes, LCP-1 and LCP-f2, in the cluster. The long terminal repeat (LTR) of the Beagle element apparently contains a sequence, perhaps an enhancer-like element, which causes altered expression of these genes. We have also investigated the cis-regulatory elements involved in expression of the LCP-2 gene in wild-type larvae. We have identified two upstream regions that may contain separate cis-regulatory elements. The region between -252 bp and -515 bp may be essential for any expression of LCP-2. Additionally, the region between -515 bp and -795 bp appears to be required for the normal level of expression of the LCP-2 gene.