优化硝酸银染色在心肌线粒体蛋白双向电泳后凝胶染色中的应用

蛋白组学研究中双向电泳(2-DE)后的SDS-PAGE凝胶染色存在灵敏度和质谱兼容性问题。线粒体中存在大量微量蛋白,对于这类亚细胞器蛋白质2-DE后的凝胶染色,这两种特性显得尤为重要。经典的硝酸银染色虽灵敏度高,但之后的质谱鉴定兼容性欠佳。因此,该研究通过优化硝酸银染色方法观察大鼠心肌线粒体蛋白质2-DE后的凝胶染色效果,挖取部分蛋白质斑点酶解后行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定,验证优化硝酸银染色与质谱鉴定的兼容性。结果表明,优化后的硝酸银染色方法灵敏度高,与MALDI-TOF-MS兼容性好,是一种线粒体蛋白质2-DE后染色的理想方法。     

原子力显微镜检测过表达α-突触核蛋白引起的线粒体结构变化

目的：利用原子力显微镜等方法,明确α-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）过表达对线粒体的影响。方法：将腺相关病毒（AAV）载体介导表达的α-syn (AAV /α-syn)病毒包装颗粒,给大鼠脑内黑质区定位注射,建立α-syn过表达的大鼠模型,并以AAV介导表达的报告基因LacZ (AAV/LacZ)为动物对照组。提取大鼠黑质脑组织的线粒体,并通过JC1染色检测线粒体膜电势（ΔΨ）变化和Western Blot检测线粒体中α-syn蛋白量的变化;采用原子力显微镜观测线粒体表面结构的变化。结果：实验组大鼠黑质脑组织过表达α-syn基因,第16周时,Western blot显示线粒体中α-syn蛋白量增加约2倍;JC1染色发现ΔΨ下降;原子力显微镜观测可见线粒体体积增大,线粒体膜表面出现较多孔道样改变。结论：大鼠黑质脑组织过表达α-syn基因,第16周时,可导致α-syn蛋白在线粒体积聚;并可引起线粒体增大、膜形成孔道样改变、ΔΨ下降。     

细胞周期蛋白依赖激酶Roscovitine诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡及其机制的研究

目的：探讨细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）抑制剂Roseovitine（Ros）诱导非小细胞肺癌（NSCLC）A549细胞凋亡及其作用机制。方法：以不同浓度Ros（101．1M、20yM、40μM）处理细胞24h,采用AnnexinV-PI染色以流式细胞仪检测细胞凋亡,Westernblot法检测胞浆中和线粒体促凋亡蛋白Bax和Bad的表达,流式细胞仪检测线粒体膜电位（脚）变化。结果：Ros以剂量依赖的方式诱导A549细胞凋亡,同时Bad和Bax在胞浆的含量随着Ros剂量的增加而减少,而在线粒体中却出现相反的结果,线粒体膜电位随Ros剂量的增大而降低。结论：Ros可通过促进Bax和Bad由胞浆向线粒体易位,诱导NSCLCA549细胞由线粒体途径发生凋亡。     

异氟醚经Pink1/Parkin信号通路激活线粒体自噬对小鼠心肌缺血再灌注的保护作用

目的 探究异氟醚（isoflurane, ISO）通过Pink1/Parkin信号通路对小鼠心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion,IR）损伤中线粒体自噬的影响。方法 本研究建立小鼠心肌IR模型,并将24只小鼠分为4组：假手术（Sham）组、假手术+异氟醚（Sham+ISO）组、缺血再灌注（IR）组、缺血再灌注+异氟醚（IR+ISO）组。通过HE染色评估心肌组织损伤,利用TUNEL染色观察心肌细胞凋亡,通过Western blot检测心肌细胞线粒体自噬相关蛋白（包括Pink1、parkin、Beclin、P62和LC3）的表达,并使用相关试剂盒测定心肌细胞线粒体内膜电位及ATP含量。结果 与Sham组相比,IR组的心肌细胞损伤更为严重,心肌组织损伤评分增加,细胞凋亡率升高。线粒体自噬相关蛋白表达紊乱,线粒体内膜电位和ATP含量显著下降。值得注意的是,在ISO处理的IR小鼠中,IR损伤导致的心肌组织损伤评分和心肌细胞凋亡率明显减轻;线粒体自噬相关蛋白的表达部分恢复,线粒体内膜电位和ATP含量的降低也得到了显著改善。结论 ISO可以通过Pink1/Parkin信号通路抑制...     

介绍一种简便而灵敏的DNA染色法

介绍一种简便而灵敏的ＤＮＡ染色法过去在光学水平对ＤＮＡ进行特异性染色大多用孚尔根（Ｆｅｕｌｇｅｎ）染色法,此法特异性高,染色后颜色鲜艳,但染色程序繁杂,而且难以对微量ＤＮＡ进行精确定位。如线粒体、质体的ＤＮＡ。在此介绍一种近年才发展起来的能精确定位微...     

活体染色观察线粒体的方法

线粒体普遍存在于各种动、植物的需氧氧化细胞。它在活体细胞中是可见的,并有特殊的染色性。因此利用活体染色的方法,观察线粒体的形态,是比较简便而生动的方法之一。我们根据线粒体的活体染色原理进行了一些改进,取得了较好效果。     

孔雀草花冠腺毛是观察线粒体的好材料

孔雀草花冠腺毛是观察线粒体的好材料高震（上海教育学院生物系,２００３３３）用孔雀草筒状花冠的腺毛水封片,不用染色,先低倍后高倍镜检细胞线粒体,其数量及布朗运动明显,因线粒体一般在分泌及巨长旺盛的细胞特别多,腺体毛细胞生长旺盛,分泌大量分泌液需要线粒体...     

α-生育酚对脑皮层神经元线粒体的保护作用

目的探讨α-生育酚对神经元线粒体的保护作用。方法将神经元细胞进行分组,分为：（1）正常对照组,（2）单纯氧自由基损伤组,（3）α-生育酚保护组。利用Fenton反应造成神经元细胞氧自由基损伤,用激光共聚焦显微镜观察各组神经元JC-1染色结果,并检测各组神经元琥珀酸脱氢酶（SDH）和细胞色素氧化酶（CCO）活性。结果（1）JC-1染色结果分析：α-生育酚保护组神经元线粒体功能强于单纯氧自由基损伤组。（2）SDH和CCO酶活性分析：α-生育酚保护组神经元SDH和CCO酶活性高于单纯氧自由基损伤组。结论α-生育酚可以有效对抗氧自由基对神经元线粒体的损伤。     

线粒体基因组靶向编辑研究进展

线粒体作为细胞中重要的细胞器,其携带有自身的基因组。线粒体基因组发生突变后,可能导致人类疾病。开发靶向线粒体基因组的新型基因编辑工具在疾病治疗和疾病模型构建中具有重要意义。该文总结了线粒体基因编辑领域的进展,特别是近期以DdCBE和TALED为代表的重大进展;同时,也指出目前线粒体基因编辑工具仍然有一些缺点。该文拟为新型线粒体基因编辑工具的研发提供参考。     

外源H2O2对湖北海棠根系线粒体膜透性和细胞核DNA的影响

用0．024％（V／V）H2O2处理湖北海棠（Malus hupehensis Rehd．）实生苗根系,30min后,根系线粒体膜通透,陛明显增大,线粒体膜电位（△ψm）和线粒体内Cyt c／a吸光度比值下降;60min后,根系细胞核DNA发生片段化降解。经荧光染料吖啶橙染色后,可见H2O2处理60min以上的根系压片中出现了清晰致密的黄绿色荧光宽,呈现出细胞程序,陛死亡（PCD）的特征。     

四季海棠成熟胚珠的组织化学及超微结构的初步研究

应用四季海棠的胚珠,进行石蜡切片,做PAS反应、苯胺兰黑染色等组织化学染色;又做超薄切片,进行超微结构观察。PAS反应:胚囊内染色深,珠被浅,各处均有红色淀粉粒。苯胺兰黑染色;显示胚囊内蛋白质丰富,卵核质兰色,核仁深兰,反足细胞更深。在超微结构中:珠被细胞中见到细胞核、线粒体、质体、内质网、同心圆潴泡、液泡等,近珠孔处珠被细胞内线粒体较多。珠心细胞内可见微管及其它细胞器。胚囊内助细胞可见丝状器。见到卵核、极核、线粒体、内质网、液泡、质体(其中未见淀粉粒)等。     

甘蓝型油菜线粒体功能未知基因 ORF 117的载体构建与转化

本研究克隆了甘蓝型油菜线粒体功能未知基因 ORF 117,构建了带有线粒体转运信号肽序列（TP ）的植物过表达载体35S ∷TP-ORF117、35S ∷TP-EGFP 和35S ∷TP-ORF117-EGFP ,转化野生型拟南芥并进行抗除草剂筛选,共获得纯合的转基因拟南芥株系62个。qPCR 表明,ORF 117在转基因材料中得到高效过表达。用转35S ∷TP-EGFP 、35S ∷TP-ORF117-EGFP 拟南芥制备原生质体,经线粒体特异染料染色,在激光共聚焦显微镜下做线粒体、GFP 共定位检测,GFP 蛋白和 ORF117-EGFP 融合蛋白被准确定位到了线粒体。     

人外周血树突状细胞亚型的形态学观察

Ｓ１００ 蛋白染色是鉴定树突状细胞（ＤＣ） 的一种重要而可靠的方法。本文采用Ｓ１００ 蛋白免疫细胞化学方法及电镜观察, 对人外周血树突状细胞的亚型进行研究。结果表明： 人血ＤＣ在形态学上分为两个亚型－ Ⅰ型中等淋巴细胞大小, 线粒体少, 核内异染色质多; Ⅱ型胞体较大, 线粒体丰富, 异染色质少     

天竺葵质体和线粒体双亲遗传的细胞学机理——雄性和雌性配子超微结构和DNA荧光的研究

天竺葵（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｈｏｒｔｏｒｕｍ Ｂａｉｌｅｙ）生殖细胞和精细胞在发育中始终存在质体和线粒体。在精细胞中,质体的体积大、数量多,具基质浓厚和在切面上多为环状的特点。线粒体在生殖细胞和精细胞中没有差异,体积较质体小得多,球形或杆状,边缘染色较深。在卵细胞中质体的含量比线粒体丰富,这两种细胞器的结构形态与精细胞的有明显的差异。细胞的质体多呈不规则的棒状和含淀粉粒。线粒体比精细胞的大２—３ 倍,许多为环状。ＤＮＡ 荧光的检测证明了在生殖细胞、精细胞和卵细胞中存在质体和线粒体类核。卵中的环状线粒体类核的形态在精细胞中是不存在的。本研究确定了雄性和雌性配子的质体和线粒体在结构形态上各具特点,可作为鉴别它们的标记,从合子中查明雄性质体和线粒体是否传递,以及在胚胎发育的早期雌雄亲本来源的细胞器的动态     

异丙肾上腺素导致大鼠心肌损伤的酶组织化学及超微结构观察

健康成年Ｗｉｓｔａｒ大鼠５０只,雌雄各半,体重２１０±２０ｇ。正常对照组１０只,实验组４０只,每只大鼠皮下注射盐酸异丙肾上腺素（ＩＳＰ）５．０ｍｇ／ｋｇ,在注射后４、１２、２４、４８小时,分别处死１０只大鼠,取出心脏,进行（１）ＨＥ染色,（２）组化染色,按Ｐｅａｒｓｏｎ法显示ＳＤＨ,用物镜测微网计算每组ＳＤＨ活性产物的缺失面积;（３）超微结构观察,按立体学图像分析原理,用《多功能医学图像处理系统》微机计算各组电镜片中线粒体体密度值。本实验的观察表明：心肌细胞ＳＤＨ在注射ＩＳＰ后显示出不同的阶段性变化;ＳＤＨ的活性产物缺失部位与ＨＥ染色的心肌坏死部位一致;心肌ＳＤＨ的活性变化与线粒体的损伤同时出现,并与线粒体的破坏程度密切相关。     

热休克对于高粱细胞质雄性不育系线粒体数目及其育性的影响(英文)

对高梁雄性不育系 ３ １９７Ａ（３Ａ）及其保持系 ３ １９７Ｂ（３Ｂ）均分别进行热激处理,以常温处理为对照,以处于花粉母细胞期的小穗为材料提取其线粒体,首次采用流式细胞仪测量线粒体的数量。首次观察到：经热激处理后,不育系 ３Ａ线粒体的数目增加约 ３．５倍;相反,保持系３Ｂ在常温时,线粒体数量为３Ａ的３．５５倍,热激后却无明显变化（Ｆｉｇ．１）。同时取热激处理及常温下３Ａ及３Ｂ的花药淀粉粒作碘化钾染色,结果表明：热激后３Ａ花药中出现饱满淀粉粒（Ｆｉｇ．２）;对其细胞色素氧化酶和过氧物酶同功酶的研究表明,热激后３Ａ电泳酶谱中有新条带出现,而且与３Ｂ的带型一致（Ｆｉｇ．３）。     

热休克对于高粱细胞质雄性不育系线粒体数目及其育性的影响

对高粱雄性不育系3197A（3A）及其保持系3197B（3B）均分别进行热激处理,以常温处理为对照,以处于花粉母细胞期的小穗材料提取其线粒体,首次采用流式细胞仪测量线粒体的数量。首次观察到：经热激处理后,不育系3A线粒体的数目增加约3．5倍;相反,保持系3B在常温时,线粒体数量为3A的3．55倍,热激后却无明显变化（Fig.1)。同时取热激处理及常温下3A及3B的花药淀粉粒作碘化钾染色,结果表明：热激后3A花药中出现饱满淀粉粒（Fig.2);对其细胞色素氧化酶和过氧物酶同功酶的研究表明,热激后3A电泳酶谱中有新条带出现,而且与3B的带型一致（Fig.3)。     

冰冻切片染色方法的改进

冰冻切片染色方法的改进熊正文,胡海霞,苏红,商磊岩（张家口解放军二五一医院病理科,０７５０００）冰冻切片是肿瘤病理快速诊断不可缺少的手段,目前,常用的固定染色方法存在着对组织结构、核染色质颗粒不清晰等缺点,针对上述缺点,经参考有关文献,对ＡＡＦ液进行...     

超微结构研究中的铀-铅-铜染色方法

本文介绍了超微结构研究中的铀-铅-铜技术。铀-铅-铜方法能选择性地染色细胞内的线粒体、内质网和高尔基体,细胞的其他部分一般不染色,从而使这些细胞器在细胞内的分布非常突出。利用这一特点,可在透射电镜下观察半薄切片,研究线粒体、内质网和高尔基体的三维结构以及细胞器之间的相互关系。     

TREM1对软骨细胞线粒体动力学及细胞凋亡的影响

摘要 目的：探讨髓系细胞表达激发受体分子1(triggering receptor expressed on myeloid cells 1,TREM1)对软骨细胞线粒体动力学及细胞凋亡的影响,以期为骨关节炎治疗提供新的研究方向。方法：使用白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）刺激ATDC5小鼠软骨细胞以模拟骨关节炎软骨细胞炎症,qPCR检测白介素-6（IL-6）表达以验证炎性软骨细胞诱导情况,同时检测目标基因TREM1的表达。为观测抑制TREM1对炎性软骨细胞的影响,将细胞分为对照组、IL-1β组及IL-1β+LR12（TREM1抑制剂）组,分别通过Mito-Tracker染色、TUNEL染色观察三组细胞的线粒体动力学和凋亡情况。接着探究过表达TREM1对正常ATDC5软骨细胞的影响,设置空载质粒组、TREM1过表达组及过表达TREM1+LR12处理组,使用Mito-Tracker染色及TUNEL染色检测三组细胞线粒体动力学和凋亡情况。此外,PCR Array检测过表达TREM1对软骨细胞代谢的影响。结果：与对照组相比,IL-1β组IL-6基因表达增加,表明炎性软骨细胞造模成功;TREM1在IL-1β处理后的骨关节炎细胞中表达升高,使用TREM1抑制剂（LR12）处理可有效抑制TREM1的表达,且能明显抑制软骨细胞的炎性因子IL-6的表达。IL-1β组软骨细胞的线粒体动力学失衡和凋亡增加,而IL-1β+LR12组上述情况得到改善。另外,与空载质粒组相比,过表达TREM1组出现线粒体动力学失衡和凋亡增加,但在TREM1+LR12组软骨细胞中线粒体失衡和凋亡增加得到缓解。此外,PCR Array发现过表达TREM1可引起ATDC5细胞的代谢紊乱。结论：TREM1可一定程度损害软骨细胞线粒体动力学平衡及促进细胞凋亡,靶向TREM1可能为骨关节炎治疗提供新的方向。