宿主细胞膜骨架蛋白在病毒感染复制中作用的研究进展

病毒与宿主细胞之间相互关系的研究不仅具有重要的理论意义,也是重大的医学实践课题.病毒可以与宿主蛋白相互作用并改变细胞的正常功能,从而促进病毒的感染与复制.宿主细胞膜骨架蛋白在病毒的生命周期中起着重要作用,研究表明细胞膜骨架蛋白参与了病毒的感染及复制,尽管许多精细机制尚不清楚,但这扩展了人们对细胞膜骨架蛋白功能的理解.本文重点介绍宿主细胞膜骨架蛋白如肌动蛋白、血影蛋白在病毒进入、细胞内运输、组装和释放等病毒感染复制过程中的作用.     

重组腺病毒载体表达的α干扰素对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的抑制作用

目的:研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)新的防治方法.方法:利用表达猪α干扰素的重组腺病毒(rAd-IFNα),通过病毒滴度、间接免疫荧光试验和实时定量RT-PCR检测,在Marc-145细胞上观察其对高致病性PRRSV SY0608株的复制抑制作用.结果:将rAd-IFNα接种细胞后24h,再感染PRRSV,可以有效阻止PRRSV造成的细胞病变,PRRSV滴度和mRNA水平明显降低;该抑制作用随rAd-IFNα接种剂量的增加而增强,但随病毒培养时间延长而逐渐减弱.此外,将PRRSV感染细胞后24h,再接种rAd-IFNα,仍可以有效降低PRRSV滴度和mRNA水平,并且rAd-IFNα对PRRSV传统毒株S1株同样具有明显的抑制作用.结论:rAd-IFNα可以有效抑制PRRSV在Marc-145细胞上复制,为PRRSV的防治提供了理论依据.     

植物多酚对5型腺病毒感染后宿主细胞膜流动性的影响

目的:观察两种植物多酚EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)、单宁酸对5型腺病毒感染后宿主细胞膜流动性的影响,初步探讨植物多酚抑制病毒作用机制。方法:利用DPH为荧光探针,以荧光偏振法观察5型腺病毒感染对宿主细胞膜流动性的影响,EGCG、单宁酸在此过程中对宿主细胞膜流动性改变的干预作用,结合CPE法测定的EGCG,单宁酸抑制5型腺病毒感染药效试验结果,以Spearman秩相关计算EGCG,单宁酸对宿主细胞膜流动性干预作用与其抑制病毒感染作用间的关系。结果:腺病毒感染细胞可提高宿主细胞膜流动性,滴度为100TCID50病毒可使293A细胞膜流动性提高15.34%。EGCG、单宁酸可抑制宿主细胞膜流动性,高浓度下分别可使宿主细胞膜流动性下降32.61%、25.75%。在病毒吸附前、吸附后、吸附同时,以EGCG、单宁酸处理宿主细胞,均发现宿主细胞膜流动性的干预作用与其抑制病毒感染效果高度相关(相关系数均0.900,P0.01)。结论:5型腺病毒感染会提高宿主细胞膜的流动性,而EGCG、单宁酸在干预腺病毒感染过程中对宿主细胞膜流动性的干预作用可能是其抑制腺病毒感染的机制之一。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和盖他病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用

盖他病毒(Getah virus,GETV)可感染猪并引起和猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)相类似的临床表现,且两者可混合感染而难以区分。我国检测PRRSV和其他诸多病毒的多重PCR文献已比比皆是,但尚无同时检测PRRSV和GET V方法的报道。为此,作者根据GenBank中公布的PRRSV和GETV全基因序列,设计了两对分别扩增PRRSV ORF7基因和GETV Cap基因片段的引物,通过反应条件的优化及特异性、灵敏性和重复性试验,首次建立了可同时检测PRRSV和GETV的双重RT-PCR方法。结果显示,该方法可以同时扩增出PRRSV 633 bp和GETV 316 bp的特异性片段,而对猪瘟病毒等其他相关病毒扩增结果均为阴性。对GETV和PRRSV的cDNA最低检测量分别为2.48×10~(-4)ng和2.50×10~(-5)ng。用建立的双重RTPCR方法对河南15个地市92个猪场的136份临床疑似PRRS发病猪样品进行检测,共从58个猪场检出PRRSV单一阳性样品44份,阳性率为32.4%;GETV单一阳性样品7份,阳性率为5.15%;GETV和PRRSV混合感染样品8份,阳性率为5.88%。检测结果与单一RT-PCR结果吻合率达100%。该方法为GETV和PRRSV的快速检测、鉴别诊断和分子流行病学研究等提供了新的技术手段。     

单宁酸体外抑制痘苗病毒感染活性的效果分析

目的:观察单宁酸体外抑制痘苗病毒(VACV)感染的效果,探讨单宁酸干扰病毒入侵宿主细胞膜脂的效应机制。方法:基于痘苗病毒细胞感染模型,在病毒吸附前、吸附后和吸附同时3种情况下分别添加单宁酸,采用中性红比色法检测单宁酸对VACV的抑制作用,利用荧光偏振法和流式细胞术分别测定VACV对细胞膜流动性和膜电位的影响及单宁酸的干预作用。结果:单宁酸以病毒吸附后及病毒吸附同时2种方式加入时可抑制VACV感染,半数抑制浓度(IC50)分别为8.7和13.1μg/m L,治疗指数(TI)分别为9.3和6.2;VACV感染可增加细胞膜流动性,单宁酸在病毒吸附后作用,可显著降低细胞膜流动性;VACV感染使细胞膜电位绝对值增大,单宁酸对VACV感染引起的细胞膜超极化状态没有明显影响。结论:单宁酸具有明显的体外抑制VACV感染宿主细胞的作用,其机制可能与拮抗因病毒感染所致的细胞膜流动性升高的膜脂干扰效应有关。     

脂筏在病毒感染中的作用

脂筏是细胞膜上富含鞘脂和胆固醇的微区结构,广泛分布于细胞的膜系统.脂筏中含有诸多信号分子和免疫受体,在细胞的生命活动中扮演非常重要的角色.更为重要的是,脂筏为细胞表面发生的蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂类分子间的相互作用提供了平台.研究表明,很多病毒可以利用细胞膜表面的脂筏结构介导其侵入宿主细胞,一些病毒可以借助脂筏结构完成病毒颗粒的组装和出芽.本文将综述不同类型的病毒如SV40、HIV等借助脂筏完成入侵以及流感病毒等利用脂筏完成组装和出芽的证据及机理,并概述目前研究病毒与脂筏相互作用的方法及存在的问题.深入研究脂筏在病毒感染中的作用,将有助于对病毒与宿主细胞的相互作用的理解,从而可能发现新的、有效的对抗病毒的方法。     

体内外感染PRRSV处理下仔猪脾淋巴细胞增殖活性的变化

为了探讨体内或体外感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的仔猪脾淋巴细胞在体外培养的增殖能力,本研究将PRRSV-GXA分离株经Marc-145细胞大量增殖培养,然后体内感染仔猪,接种病毒后分别于第11天、第14天和第21天从活体猪收获脾脏,分离脾淋巴细胞后用ConA和LPS于体外进行诱导增殖.研究结果显示第11天收获的T淋巴细胞增殖能力高于对照组,而B淋巴细胞增殖能力明显下降;第14天收获的T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖能力均极显著低于对照组;第21天收获的B淋巴细胞增殖能力略高于对照组,T淋巴细胞增殖能力略低于对照组.同时,用不同滴度的PRRSV体外感染PRRSV阴性的猪脾淋巴细胞,经ConA和LPS诱导增殖后,发现病毒滴度在103~106 TCID50/mL范围内,能明显提高脾淋巴细胞的体外增殖能力;而病毒滴度在100~102 TCID50/mL范围时,脾淋巴细胞增殖能力低于对照组.本研究结果说明PRRSV体内或体外感染对仔猪脾淋巴细胞增殖活性均有显著的影响,将为临床上PRRS的综合防治提供理论依据.     

猪肺泡巨噬细胞感染PRRSV进程中差异表达基因及基因功能富集分析

猪呼吸和繁殖综合症病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染猪后会引起妊娠母猪严重繁殖障碍和仔猪呼吸困难及高死亡率,给养猪产业造成了巨大经济损失,因此挖掘PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞进程中差异表达的基因及机理有重要意义。本研究对来自GEO数据库的PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞sage表达谱数据GSE10346进行后续挖掘。先用sage软件处理,经sagemap注释得到上调已知基因49个,下调已知基因41个。利用AgBase网站上的GORetriever工具和GOSlim Viewer工具进行细胞组分(cellular component)、分子功能(molecular function)及参与的生物过程(biological process)分类后发现有4个基因与病毒的复制相关:其中IL8已有报道认为与抗PRRSV相关;TNF-α能够抑制PRRSV复制;PPIA可能与GP5蛋白胞外区中和决定簇与抗体发生作用的24位脯氨酸有关;ICAM-1在嗜中性粒细胞的产生中起关键作用,与病毒吸附相关。这4个基因与PRRSV的致病机制相关,可望用于抗PRRSV研究。进一步利用David在线工具进行基因功能富集分析后,发现几个免疫通路,如趋化因子通路,Toll-like受体信号通路和NOD-like受体信号通路具有检验显著性,这些免疫通路在PRRSV感染过程中起着一定作用,有望成为抗PRRSV的靶通路。     

海马神经细胞胆固醇含量降低对其电压依赖钾电流的上调作用

胆固醇普遍存在于细胞膜中,其含量在细胞增殖、生长及各种疾病条件下会发生改变,这暗示胆固醇对细胞功能的调节起着重要的作用。运用全细胞膜片钳技术研究了胆固醇含量变化对海马神经细胞电压依赖钾电流的影响。实验观察到神经细胞经胆固醇去除剂β-甲基环化糊精(MβCD)处理后,胆固醇含量的减少促进了延迟整流钾电流IK的增加,且延缓了瞬间失活钾电流IA的失活。更进一步,延迟整流钾电流IK和瞬间失活钾电流IA分别经TEA和4-AP阻断后,MβCD对两种电流成分的影响显著降低。这一结果进一步表明胆固醇去除剂对电压依赖钾电流的上调是通过作用于IK和IA电流而共同实现的。基于电压依赖钾通道在神经细胞功能中的重要作用,实验结果暗示神经细胞胆固醇含量变化可对神经细胞的兴奋性起调节作用。     

硫酸乙酰肝素与口蹄疫病毒感染

受体是病毒宿主嗜性和致病机制的主要决定因素.硫酸乙酰肝素(HS)是一种多聚阴离子碳水化合物,广泛存在于真核细胞的细胞膜和细胞基质.HS是许多病毒在细胞膜上的特异受体或辅助受体.目前发现口蹄疫病毒可利用HS和整联蛋白(ανβ3、ανβ6、ανβ1、ανβ8)作为病毒受体.口蹄疫病毒可能在不同的感染阶段利用不同类型的受体与宿主细胞相互作用中.研究病毒受体的结构和功能对理解病毒与宿主细胞的关系具有重要意义.本文主要论述了HS的生物学特性及其与口蹄疫病毒感染的关系.     

植物乳杆菌ST-Ⅲ菌株降胆固醇作用的研究

ST-Ⅲ菌株是经体外体内实验证实的具有降低胆固醇功能的一株植物乳杆菌,本实验对其体外降胆固醇机理进行了研究.结果表明,植物乳杆菌ST-Ⅲ菌株是通过同化作用和沉淀作用来共同降低胆固醇,其中同化作用为主导作用,可降低胆固醇76.38ug/mL(25.5%);沉淀作用为辅助作用,可降低胆固醇44.62ug/mL(14.85%);并且沉淀作用和pH值具有相关性,在控制pH6.0和不控制的条件下,分别为29ug/mL,与41ug/mL,这表明在酸性条件下ST-Ⅲ菌株的沉淀作用更易发生.在抗超声破碎实验中发现添加有胆固醇培养的ST-Ⅲ株抗超声能力明显高于对照的ST-Ⅲ菌株,这有可能是胆固醇进入到细胞膜中改变其结构增强韧性所致;在细胞荧光标记检测实验中也发现了胆固醇能改变细胞膜的组成成分,导致通透性变化,添加有胆固醇培养的ST-Ⅲ菌株荧光强度为106.22,仅为对照组的15.1%.     

精液源性病毒感染增强因子SEVI-HIV性传播中的重要因素

精液源性病毒增强因子(Semen-derived enhancer of viral infection,SEVI)是前列腺酸性磷酸酶(Prostatic acidphosphatase,PAP)位于PAP248-286的多肽片段,可增强人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)的感染性。SEVI促进HIV感染的作用机制包括:①富含阳离子氨基酸残基的SEVI能通过静电作用降低HIV病毒颗粒与靶细胞之间的静电排斥;②SEVI在人体液中呈无序状态,利于病毒与靶细胞膜相互作用;③SEVI直接捕获HIV颗粒,提高病毒在靶细胞表面沉降速度,促进病毒与靶细胞的吸附和融合。目前已发现能抑制SEVI活性的物质包括:绿茶来源的EGCG(没食子儿茶素没食子酸酯)、氨基喹啉类小分子化合物Surfen、ThT类似物BTA-EG6等,能通过阻断HIV与SEVI结合或阻止其淀粉样纤维的形成,降低SEVI的病毒感染增强作用。研究SEVI的生物学特性及作用机制对防治HIV感染具有较为重要的指导意义。     

猪NF-κB p65/p50亚基的原核表达及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响

为了研究经原核表达的猪细胞核转录因子NF-κB p65/p50融合蛋白对猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)体外增殖影响,本文采用RT-PCR技术扩增出编码成熟p50区和p65开放阅读框(ORF),将其克隆至pET21a(+)中,转化至Rosetta感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和蛋白免疫印迹法(Western-blot)对表达产物进行鉴定;纯化复性后添加到DMEM细胞维持液中,观察p65/p50对Marc145细胞毒性,确定最佳使用浓度;探讨最佳浓度的p65/p50对PRRSV体外感染增殖活力的影响,通过实时荧光定量PCR方法研究PRRSV感染时相,绘制PRRSV增殖曲线。成功构建了大量以包涵体形式表达Mr均约为70kD的p65/p50融合蛋白的p65/p50-pET21a(+)原核表达载体;Western-blot显示p50和p65重组蛋白可分别与兔抗人p50多克隆血清、兔抗人p65纯化抗体反应。确定p65/p50最佳添加浓度为0.4μg/mL。通过实时荧光定量PCR技术研究PRRSV感染时相,结果表明NF-κB p65/p50可促进PRRSV感染Marc-145CPE出现及病毒早期增殖;但CPE出现后,病毒增殖受到抑制,病毒滴度水平显著降低(P<0.05)。该结果为进一步研究PRRS的发病机理及治疗策略提供了新思路。     

猪源Viperin蛋白抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染MARC-145细胞

为了研究干扰素刺激基因Viperin对猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗病毒作用,本研究构建了猪源Viperin基因(sViperin)pCI-sVIP表达载体,并在MARC-145细胞上观察了其对PRRSV复制的抑制作用。结果为:过表达sViperin蛋白可以抑制PRRSV在MARC-145细胞上的复制,且具有剂量依赖作用。sViperin蛋白抑制了病毒的入胞,但其对病毒的装配和释放没有影响作用。共聚焦实验证明sViperin蛋白主要定位于内质网等细胞器。sViperin蛋白和PRRSV GP5、N蛋白在细胞内存在共定位现象。CO-IP实验证明sViperin蛋白可以和PRRSV N蛋白存在相互作用。该研究为该病毒新型抗病毒药物研究奠定了重要基础。     

EB病毒潜伏膜蛋白1调节EGF受体核移位

EB病毒编码的病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)是重要的致瘤蛋白, 一直以来是EB病毒致瘤机制的研究核心. 传统的受体学说认为, 细胞膜受体作为第一信使, 在细胞膜上与其配体结合发挥生物学效应. 但近年来, 对EGFR家族成员受体核移位在基因表达调控中意义的研究, 拓宽了人们对细胞膜受体生物学功能的认识. 利用我们建立的Tet-on系统调控LMP1表达的细胞系, 采用Western blot和激光共聚焦显微镜等技术证实, LMP1可调控EGFR的核移位, 并呈一定的剂量效应. 通过GFP与EGFR及不同突变体的融合蛋白在细胞内的表达发现, EGFR的核定位信号在其核移位过程中起着一定的作用, 并初步发现LMP1调控EGFR核移位为配体非依赖性.     

膜胆固醇对重组创伤弧菌溶细胞素活性的影响

研究膜胆固醇对重组创伤弧菌溶细胞素(recombinant Vibrio vulnificus hemolysin,rVvhA)生物学活性的影响,以进一步明确rVvhA的分子致病机制。利用甲基-β-环糊精(MβCD)可以去除细胞膜上胆固醇的能力,rVvhA作用细胞之前,细胞预先经5 mmol/L MβCD处理。测定MβCD预处理组和未处理组(即rVvhA直接作用组)细胞的存活率、细胞内钙离子浓度、培养上清中钾离子浓度及细胞凋亡与坏死情况。结果显示MβCD预处理组的细胞存活率较rVvhA直接作用组高、rVvhA引起的钙离子内流和钾离子释放受到抑制、细胞凋亡率也明显降低。结果表明,在rVvhA活性发挥中细胞膜上的胆固醇是必须存在的,胆固醇的降低会抑制rVvhA的活性。     

硫酸乙酰肝素与口蹄疫病毒感染

受体是病毒宿主嗜性和致病机制的主要决定因素。硫酸乙酰肝素(HS)是一种多聚阴离子碳水化合物, 广泛存在于真核细胞的细胞膜和细胞基质。HS是许多病毒在细胞膜上的特异受体或辅助受体。目前发现口蹄疫病毒可利用HS和整联蛋白(αvβ3、αvβ6、αvβ1、αvβ8)作为病毒受体。口蹄疫病毒可能在不同的感染阶段利用不同类型的受体与宿主细胞相互作用。研究病毒受体的结构和功能对理解病毒与宿主细胞的关系具有重要意义。本文主要论述了HS的生物学特性及其与口蹄疫病毒感染的关系。     

猪CD151转基因PK-15细胞系构建及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒的易感性

[目的]建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)易感的猪CD151转基因PK-15细胞系,研究CD151分子在PRRSV感染猪源细胞中的作用.[方法]用RT-PCR从猪肺泡巨噬细胞中扩增CD151全长cDNA,测序正确后克隆人真核表达载体pcDNA3;用重组载体pcDNA-CD151转染PK-15细胞,经G418抗性筛选获得转基因细胞系PK15-CD151,用RT-PCR和免疫荧光试验检测CD151表达;用VR-2332株PRRSV分别感染PK-15细胞、PK15-CD151细胞、MARC-145细胞和3D4-CD163细胞,定期观察细胞病变,用RT-PCR和免疫荧光试验检测病毒RNA基因组和病毒抗原,用半数组织细胞感染剂量测定病毒滴度.[结果]从猪巨噬细胞中克隆得序列正确的猪CD151 cDNA;从重组载体转染的PK-15细胞培养中筛选得G418抗性细胞克隆,并能正确表达猪CD151分子;在PRRSV感染后,PK15-CD151细胞虽然不表现明显的细胞病变,但能检测到病毒RNA基因组和病毒抗原,并能产生较高滴度的感染性病毒;该细胞系已在体外传30代以上,第10、20、30代细胞的PRRSV滴度无明显变化.[结论]猪CD151基因转染能使非易感PK-15细胞获得对PRRSV的易感性,提示猪CD151参与PRRSV感染猪源细胞.     

核型多角体病毒的增殖与棉铃虫血淋巴酯酶的变化

核型多角体病毒(NPV)对同源棉铃虫有很强的毒杀作用,是重要杀虫资源.病毒感染导致宿主代谢紊乱,引起一系列生化反应的变化,可通过一定方法观察到其表征,此为病毒感染的病理生化特征.昆虫血淋巴对于病毒感染引起的全身症状具有重要作用,并影响宿主物质和能量代谢的性质与水平,反映出病毒-宿主的互作关系.本文以血淋巴酯酶同工酶(EST)为感病指标,对其感染变化进行研究.     

肌动蛋白在AcMNPV向细胞外运输过程中作用的初步研究

本实验利用AcMNPV(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)的bac-to-bac系统构建了两种重组病毒,即含GFP-actin融合基因的重组病毒AcMNPV-GFP-actin和含GFP基因的重组病毒AcMNPV-GFP.用这两种重组病毒分别感染Sf9细胞,以AcMNPV-GFP感染的Sf9细胞为对照,用共聚焦激光扫描显微镜观察了绿色荧光在病毒感染过程中的分布情况.由于肌动蛋白和绿色荧光蛋白是共定位的,所以绿色荧光的分布情况就是肌动蛋白的分布情况.实验中观察发现,AcMNPV-GFP感染的Sf9细胞中的绿色荧光,在整个感染过程中是弥散分布的,而AcMNPV-GFP-actin感染Sf9细胞后24-72h这段时间内,肌动蛋白最初聚集在细胞核内,随后逐渐由细胞核向细胞质转移,最后完全聚集于细胞膜.根据实验结果,推测肌动蛋白可能参与了AcMNPV出芽型病毒粒子(BV)由细胞核向细胞质运输以及从细胞膜排出的过程.