霍乱毒素B亚单位基因分泌型表达载体的构建及转化烟草的研究

为了探索利用植物分泌特性来表达重组蛋白的可行性,先构建了含钙网蛋白信号肽的植物双元载体pBIcal,再向该载体中插入霍乱毒素B亚单位编码基因,最后得到表达载体pBIcal—ctb。通过根癌农杆菌介导,该表达载体转化烟草,在卡那霉素抗性培养基上筛选,得到30棵抗性植株。经PCR鉴定,霍乱毒素B亚单位基因已经整合到烟草基因组中。初步表达分析表明,转基因烟草中含有具生物活性的霍乱毒素B亚单位蛋白。     

利用转基因技术生产可预防霍乱的可食性番茄疫苗

TrangenicResearch 2 0 0 2年 1 0月 1 1卷 5期 4 47～ 4 5 4页报道 :霍乱是一种由霍乱弧菌 (Vibriocholerae)引起的烈性传染病。霍乱弧菌所分泌的毒素可导致严重腹泻。霍乱毒素由 1个A单位和 5个B单位组成。五聚B部分是有效的免疫辅剂。目前正在研制霍乱疫苗。已研制成功了由霍乱毒素亚单位B(CTB)与灭活的霍乱弧菌细胞混合而成的口服疫苗 ,可预防霍乱 (Sanchez等 ,1 993)。但由于CTB的造价太高 ,故不适于发展中国家生产疫苗使用。为此 ,近年来已开始利用转基因植物生产用于防治疾病的蛋白 (例如Fischer等 ,2 0 0 0 )。由于将抗原表达…     

霍乱毒素B亚单位与胰岛素B链融合基因的克隆及原核表达分析

构建了霍乱毒素B亚单位(choleratoxinBsubunit,CTB)与胰岛素(insulin)B链的融合基因CTB-INSB,将该融合基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pETCIB;并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中;重组菌株经IPTG诱导后的表达产物经15％SDS-PAGE分析表明可以表达融合蛋白,其分子量约为15.4kDa,且主要以包涵体形式存在,约占全菌蛋白的30％。含CTB-INSB重组蛋白的包涵体经变性和复性后,可在体外自组装成五聚体结构。Westernblotting分析结果显示CTB-INSB可分别被霍乱毒素的抗体和胰岛素的抗体识别,表明该蛋白具有霍乱毒素B亚单位与胰岛素的双重抗原性。同时GM1-ELISA分析结果表明CTB-INSB在体外可与神经节苷脂GM1(monosialoganglioside)特异结合,进一步证实了它能够形成类似CTB五聚体的高级结构,具有生物活性。     

冻干口服霍乱rBS-WC菌苗安全及效率评价的小鼠模型探讨

我们构建了高产、分泌霍乱毒素B亚单位的工程菌株E.coli MM2,并用该菌株生产的重组霍乱毒素B亚单位(rBS)与灭活霍乱弧菌菌体制成冻于口服rBS-WC菌苗。这一菌苗的实验室动物研究亦已进行,肯定其在多种动物安全、有效。目前已能较大量地生产rBS,正在探索放大与工业化生     

B型肉毒毒素重组Hc亚单位疫苗的免疫原性研究

目的:用大肠杆菌表达重组B型肉毒毒素受体结合区Hc抗原(BHc)作为亚单位疫苗,并研究其免疫原性。方法:构建pTIG-Trx-BHc原核表达载体,用大肠杆菌表达并纯化重组BHc抗原;免疫BALB/c小鼠以研究它的免疫原性。结果:大肠杆菌表达并纯化获得了重组BHc抗原,免疫小鼠后能刺激机体产生高效价的抗BHc抗体和保护性免疫反应。该重组BHc亚单位疫苗1μg剂量2次免疫小鼠即可产生对104LD50剂量B型肉毒毒素攻毒的完全保护,血清中和效价可达1.33 IU/m L。结论:大肠杆菌表达的重组BHc抗原具有良好的免疫原性,能够有效地保护小鼠抵抗B型肉毒毒素的攻击,该BHc抗原能够作为亚单位候选疫苗预防B型肉毒毒素中毒。     

霍乱毒素B亚单位与胰岛素原融合基因的克隆、表达及重组蛋白特性分析

构建了霍乱毒素B亚单位 (CholeratoxinBsubunit,CTB)与胰岛素原 (Proinsulin)的融合基因CTB -PROIN ,将该融合基因克隆到大肠杆菌表达载体pET 30a(+)中 ,获得重组质粒pETCPI,并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中 ;重组菌株经IPTG诱导后 ,其表达产物经过 15 %SDS PAGE分析表明该菌株可以表达融合蛋白 ,其分子量约为 21.6kD ,且主要以包涵体形式存在 ,约占全菌蛋白的 25%。含CTB-PROIN重组蛋白的包涵体经过变性和复性后 ,CTB-PROIN可以在体外自组装成五聚体结构。Westernblotting分析结果表明重组CTB PROIN蛋白可分别被霍乱毒素的抗体和胰岛素的抗体识别 ,说明该蛋白具有霍乱毒素和胰岛素的双重抗原性。同时在体外 ,CTB PROIN蛋白可与神经节苷脂GM1(monosialoganglioside)特异性结合 ,表明了该融合蛋白在体外具有生物活性。这些研究结果为利用原核生物表达系统研制廉价、高效的I型糖尿病口服疫苗奠定了基础。     

工程菌产霍乱肠毒素B亚单位的纯化

 本实验室使霍乱肠毒素(CT)B亚单位基因在大肠杆菌中获得表达,并能分泌到胞外。将该菌株培养物上清经过超滤浓缩后,用偶联上霍乱毒素IgG的CNBr-Sepharose 4B进行亲和层析,得到表达产物霍乱毒素B亚单位纯蛋白。经PA-GE、HPLC及琼脂免疫扩散等方法鉴定证明该蛋白与天然霍乱肠毒素B亚单位完全相同。     

表达霍乱CT-B和LPS-O抗原的鼠伤寒菌苗株的构建

编码霍乱CT—B和LPSO抗原的基因与载体质粒pYA248重组后,转入△cya△crp △ asd减毒鼠伤寒疫苗株x4072,构建成无药物抗性、带双价抗原的工程菌株x4072(pMG306)。该菌株能分泌表达特异的霍乱CTB抗原,并且在菌体表面同时表达霍乱和鼠伤寒的。抗原。小鼠腹腔免疫和攻击试验表明该菌苗株对霍乱毒株的攻击具有良好的保护作用。本研究为新型霍乱／鼠伤寒双价口服活疫苗的构建打下了基础。     

预防仔猪腹泻无抗性基因工程菌株的构建

以原来含热不稳定肠毒素B亚单位基因质粒DNA为载体,插入lacZ基因,构建了一个既能表达LT-B亚单位又能表达B-半乳糖苷酶的含四环索抗性基因的重组体。在该重组DNA的四环素抗性基因内再插入K 88粘附因子抗原基因,从而灭活了四环素抗性基因。经测定该重组体能表达LT－B和K88两种抗原,lacZ基因取代四环素抗性基因,成为良好筛选标记。所构建的重组质粒能稳定存在。     

HPV16重组减毒沙门氏菌表达质粒的构建及其诱导免疫

将人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)16 L1E7基因插入携带霍乱毒素基因的pET-CTA2B载体,获得HPV16L1E7与CTA2B融合表达质粒pET-L1E7CTA2B.在此基础上,通过PCR基因克隆技术,将pET载体的T7启动子与pTETnir15载体的大肠杆菌硝酸盐还原酶基因B启动子nirB进行分割重组,将nirB启动子的厌氧调控元件和启动子基本元件FNR-TATA盒与T7启动子的核糖体结合位点(SD)序列融合,形成nirB-T7杂合启动子.最后获得HPV16重组减毒沙门氏细菌疫苗表达载体pNir-16L1E7CTA2B,并进一步构建对照质粒pNir-16L1E7.Western blot结果证实以上质粒nirB-T7杂合启动子能够在沙门氏细菌中表达L1E7融合蛋白.口服免疫接种小鼠可成功诱导小鼠生殖道产生HPV16特异性粘膜免疫,且霍乱毒素CTA2B可以增强粘膜免疫诱导能力,为开发廉价有效的HPV16预防性疫苗打下了基础.     

临床试验评估口服肠毒原性大肠杆菌原型疫苗的安全和免疫原性

作者开发了一种新的抗肠毒原性大肠杆菌（ETEC）腹泻的口服疫苗,这种疫苗含有表达水平提高的ETEC定居因子（CFs）和重组蛋白（LCT-BA）,即大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位与霍乱毒素B亚单位的重组蛋白的灭活重组大肠杆菌。作者进行了随机、双盲有对照的I期临床试验,60名瑞典成人志愿者参与了此项研究,观察了这种原型疫苗的安全性和免疫原性,并与以往开发的口服ETEC疫苗的结果进行比较,以往开发的疫苗为口服ETEC疫苗,这种疫苗含有CTB和灭活的表达CFA／I的野生型ETEC菌株（参考疫苗）。志愿者分组接受2剂或者是原型疫苗或者是参考疫苗。原型疫苗以相同剂量或者以4倍的剂量（与参考疫苗相比）进行投递。     

安全的霍乱活菌苗?

<正> 当前使用的霍乱菌苗有两大类,一是由全菌体加或不加毒素B亚单位组成的死菌苗,给苗途径可肠道外或口服;二是口服活菌苗,由霍乱弧菌基因工程减毒株或由表达霍乱抗原的异源载体菌(即伤寒Tyzla)组成。前一类费钱效果不理想,后一类有反应原性、变异性和稳定性方面的问题。 最近,我们鉴别出了菌毛定居因子(协同调节的毒素菌毛( toxin coregulated pil-usTCP),它可能是审定菌苗可否应用的一种重要的新免疫原。本文介绍TCP菌毛应用于霍乱菌苗研究中的一些初步结果。     

霍乱cT-B和LPs-o双价抗原工程菌苗株的构建

作者将霍乱弧菌O抗原及毒素B亚单位基因片段,经DNA体外重组技术,得到了能表达双价抗原的工程菌株1046(pMG305)。经GM1-ELISA分析表明该菌株能够表达特异的霍乱CT-B抗原,且能分泌到胞外,通过菌体凝集,全细胞O抗原酶联分析和血凝抑制试验表明在1046(pMG305)菌体表面表达了霍乱的O抗原,它的脂多糖O抗原通过SDS-PAGE电泳分析,显示它表达了霍乱LPS的特征区带。小鼠腹腔免疫后用霍乱弧菌毒株攻击表明,有良好的保护作用,因此1046(pMG305)可望成为霍乱活疫苗的候选株。     

HPV16重组减毒沙门氏菌表达质粒的构建及其诱导免疫

将人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)16 L1E7基因插入携带霍乱毒素基因的pET CTA2B载体,获得HPV16L1E7与CTA2B融合表达质粒pET L1E7CTA2B。在此基础上,通过PCR基因克隆技术,将pET载体的T7启动子与pTETnir15载体的大肠杆菌硝酸盐还原酶基因B启动子nirB进行分割重组,将nirB启动子的厌氧调控元件和启动子基本元件FNR TATA盒与T7 启动子的核糖体结合位点(SD)序列融合,形成nirB T7 杂合启动子。最后获得HPV16重组减毒沙门氏细菌疫苗表达载体pNir 16L1E7CTA2B,并进一步构建对照质粒pNir 16L1E7。Western blot结果证实以上质粒nirB T7杂合启动子能够在沙门氏细菌中表达L1E7 融合蛋白。口服免疫接种小鼠可成功诱导小鼠生殖道产生HPV16 特异性粘膜免疫,且霍乱毒素CTA2B可以增强粘膜免疫诱导能力,为开发廉价有效的HPV16预防性疫苗打下了基础。     

大肠杆菌热稳定肠毒素表位与霍乱毒素B亚单位的重组与表达

霍乱毒素B亚单位(CTB)是半抗原的良好载体,选择CTB基因的翻译调控元件,实现了串联重复的突变型大肠杆菌热稳定肠毒素(ST)表位与CTB的重组,在大肠杆菌中高效分泌表达,经过亲和层析获得了高纯度的重组蛋白,ELISA表明重组蛋白仍保留与神经节苷脂GMl的结合能力和CTB的免疫原性。     

表达霍乱CT-B和LPS-O抗原的鼠伤寒菌苗株的构建

将编码霍乱ＣＴ－Ｂ和ＬＰＳ－Ｏ抗原的基因与载体质粒ｐＹＡ２４８重组后,转入△ｃｙａ△ｃｒｐ△ａｓｄ减毒鼠伤寒疫苗株ｘ４０７２构建成无药物抗性,带双价抗原的工程菌株ｘ４０７２（ｐＭＧ３０６）。该菌株能分泌表达特异的霍乱ＣＴ－Ｂ抗原,并且在菌体表面同时表达霍乱和鼠伤寒的Ｏ抗原。小鼠腹腔免疫和攻击试验表明该菌株对霍乱毒株的攻击具有良好的保护作用。本研究为新型献计霍乱／鼠伤寒双价口服活疫苗的构建打下了基础     

幽门螺杆菌HspA融合蛋白口服疫苗的构建

构建表达幽门螺杆菌的保护性抗原分热休克蛋白A亚单位(HspA）和霍乱毒素B亚单位（CtxB）的重组融合蛋白的生物工程菌株,以此制备幽门螺杆菌的口服疫苗。用PCR方法扩增hspA和ctxB两个目的的基因片段,将它们分别克隆至pSK（＋）质粒上,然后插入含T7启动子ET－22b（＋）的表达载体中,构建嗓基因的表达质量pET－hct,转化E.coliBL21(DE3）,经IPTG诱导表达融合蛋白HCT。经测序,hspA-ctxB(hct)融合基因片段由726bp组成,可以编码242个氨基酸残基的多肽。经SDS－PAGE和免疫印迹分析检测发现,融合基因表达的蛋白质相对分子质量约为30kD。融合蛋白经镍离子柱纯化、复性后,和HspA共同标记同位素^125I,然后给小鼠灌胃,结果观察到HCT组小鼠血清中的^125I的放射量要明显高于HspA组（P＜0．001）,且吸收峰值时间明显提前。融合蛋白中的CtxB可明显促进小鼠对HspA的吸收,HCT融合蛋白可以作为预防和治疗幽门螺杆菌感染的侯选口服疫苗。     

霍乱毒素B亚单位基因在鼠伤寒沙门氏菌中的表达

本工作成功地将霍乱毒素B亚单位(ctx B)基因插入到带有天门冬氨酸β-半醛脱氢酶基困(asd+)的pYAZ48质粒中,并将它转化至天门冬氨酸β-半醛脱氢酶突变(asd-)鼠伤寒沙门氏菌中。实验结果表明,ctx B亚单位基因能在鼠伤寒沙门氏菌中高效表达,并且表达的蛋白能分泌到细胞外。动物实验结果也表明：该疫苗菌株能在肠粘膜细胞定居;口服及全身免疫均能产生较高的抗体,并能增强动物细胞的免疫功能;对伤寒、霍乱有毒株的攻击有良好的保护效果。该系统的应用为疫苗基因工程提供了一个新的途径。     

染色体整合系统在多价疫苗构建中的应用研究

通过同源重组将编码异源抗原的DNA整合到减毒的鼠伤寒沙门氏菌的染色体上,获得了表达霍乱毒素B亚单位（CTB）的双价活疫苗候选株。该系统包括两个步骤：首先将GisOG缺失突变的DNA片段整合进鼠伤寒沙门氏菌疫苗候选株SL3261的染色体上,得到His营养缺陷型。然后,用带有CTB抗原基因的完整HisOGDNA片段置换HisOG缺失的DNA片段,获得表达CTB的His回复的SL3261菌株（命名为TT201）。Southern杂交证明,TT201菌株的染色体带有CTB抗原基因。Westernblot分析表明,TT201菌株能表达CTB,且具有很好的稳定性。用重组菌株口服免疫接种小鼠,能够激发抗CTB抗体的产生。TT201菌株是一种潜在的双价疫苗候选株。     

恶性疟原虫子孢子CS抗原融合基因的表达及其生物活性

采用遗传工程技术获得了含有恶性疟原虫子孢子CS抗原融合基因的重组质粒pMC055－CS的工程菌株,能高效分泌CS抗原的融合蛋白至胞外,可达25mg／L．具有霍乱毒素B亚单位（CT－B）和子孢子CS的抗原性．将纯化的融合蛋白免疫C57纯系小鼠,免疫后抗CT－B抗体滴度可达1：3200～6400,抗CS抗体滴度可达1：320～640．免疫小鼠采用约氏疟子孢子腹腔攻击,保护率达34～45％．