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1.
产生免疫原性的残基都是位于蛋白表面的暴露残基,为了消除鼠抗体对人的免疫原性,利用表面再塑方法对本室克隆的鼠抗人纤维蛋白抗体单链Fv片断进行了人源化分子设计。首先确定了鼠及人Fv表面残基,在此基础上分析了鼠与人Fv间表面残基的差异,将有差异的鼠表面残基换成人的。提出了残基最高频率人源化及最相似链人源化两种人源化方案。人源化后鼠抗人纤维蛋白抗体单链Fv的结构经Profile-3D验证是合理的,置换的表面残基溶液可及性未变,且未影响CDRs的结构,应不会影响与纤维蛋白的亲和力,为鼠抗体人源化实验研究奠定了基础。 相似文献
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鼠抗人纤维蛋白抗体单链Fv片段的人源化分子 总被引:1,自引:0,他引:1
产生免疫原性的残基主要是位于蛋白表面的暴露残基,为了消除鼠抗体对人的免疫原性,利用表面再塑的方法对本室克隆的鼠抗人纤维蛋白抗体链Fv片段进行了人源化分子设计。首先确定了鼠及人Fv片段的表面残基,在此基础上分析了鼠与人抗体Fv表面残基的差异,将存在差异的鼠抗体表面残基换成人的,从而实现鼠抗体的人源化。 相似文献
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人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的体外分子进化 总被引:4,自引:1,他引:4
以人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的5株CDR3突变体为基础,利用致错PCR和DNA重排方法对其进行了突变和重排,然后克隆重组装的突变单链抗体至载体pHB-1HSCFV而构建了库容为10^5的抗体库,利用噬菌体表面呈现技术对构建的人源化抗体突变库进行了富集,并利用单链抗体-碱性磷酸酶系统进行了阳性克隆的筛选和鉴定。随后以鉴定的5株阳性克隆为基础进行了第二轮的致错PCR、DNA重排、抗体库的构建和富集,并筛选到4株亲和力较亲本鼠抗体All更好的人源化抗体,该研究为研制低免疫原性的导向溶栓制奠定基础。 相似文献
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人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体-尿激酶融合蛋白在大肠杆菌中的功能性表达 总被引:8,自引:0,他引:8
尿激酶是目前临床上广泛使用的一种有效的溶栓制剂 ,但由于尿激酶缺乏对血栓的特异亲和性 ,导致临床上尿激酶的使用剂量较大 ,容易出现全身性出血等副作用。因而开发对血栓特异的导向溶栓制剂是目前溶栓药研制的一个重要方向。本实验室在以前的工作中 ,利用噬菌体表面呈现技术 ,筛选到一种对人纤维蛋白特异的鼠单链抗体[1 ] ,在对该鼠抗体可变区进行结构模建的基础上[2 ] ,对其进行了人源化改造和体外亲和力成熟 ,得到亲和力和特异性较鼠抗体更好的人源化单链抗体[3 ] 。为研制导向溶栓制剂 ,本实验室构建了人源化单链抗体 低分子量尿激酶的… 相似文献
5.
单克隆抗体以其特异性强、均~性好的特点在疾病治疗中已显示了良好的应用前景,但由f目前所用单抗多为鼠源性抗体,进行治疗时,由f多次使用或多剂量使用,会刺激人体产生抗鼠抗体(HAMA)的排斥反应,这不仅减弱了单抗的治疗效果,而且还会使人体产生其它副反应,从而阻碍了单抗治疗的进程。抗体工程技术的发展,使人们可以利用分子生物学手段对抗体进行人源化改造,这不仅降低了抗体中的鼠源成份,可以使鼠源抗体的免疫原性减弱,有利于抗体的临床应用。本文利用表面重塑法对抗乙脑抗体可变区基因进行了人源化改造。1材料与方法工.三… 相似文献
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以抗体阻断血管生成信号来治疗实体肿瘤显示了很好的前景,但鼠源抗体首先必须经人源化改造以降低其免疫原性才能应用于人体。本研究以同源模建预测了一体人血管内皮生长因子(VEGF)特异性鼠源单链抗体E11的三维结构,以结构数据为基础并采取单个最相似框架区替代法对其进行人源化设计;合成并组装了人源化单链抗体基因并在大肠杆菌中表达,包含体形式的产物以凝胶柱色谱法复性,经ELISA检测表明,人源化后的单链抗体保持了与天然VEGF结合的活性,表明采取的人源化路线具有可行性。 相似文献
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为探讨肝癌特异性鼠源及其人源化单链抗体基因的表达策略并比较二者的结合能力,在3种载体中分别以融合、分泌及胞内表达的方式进行了研究;对复性后的单链抗体以抗原捕获ELISA法进行检测。结果表明,在3种载体中表达的鼠源及人源化单链抗体都是包含体,诱导物浓度及培养温度不影响表达形式;抗原捕获细胞ELISA表明人源化的单链抗体和鼠源单链抗体有相近的抗原结合能力。结论是:在大肠杆菌中表达的基因工程单链抗体的可溶性可能主要由自身氨基酸一级序列决定;先前的设计所采取的人源化方案没有影响到鼠源抗体的CDRs的天然构象,表达的人源化单链抗体提供了免疫原性评价及临床应用的基础。 相似文献
9.
利用噬菌体展示技术筛选特异性人源抗ICAM-1单链抗体(Anti-human ICAM-1 scFv)并进行生物学活性鉴定。应用Tomlinson I+J噬菌体抗体库,以P1抗原肽为包被抗原,经过4轮“吸附-洗脱-扩增”进行亲和富集筛选。以PCR反应、ELISA抗原交叉反应和Dot blotting实验进行阳性克隆的鉴定。scFv经原核表达和分离纯化后,以Western blotting实验、竞争ELISA实验和细胞黏附抑制实验对其生物学活性进行初步鉴定。Tomlinson I+J噬菌体抗体库经4轮亲和富集筛选,利用ELISA方法成功筛出4株阳性克隆。通过PCR鉴定反应、ELISA抗原交叉反应和Dot blotting实验,最终获得了1株既能与P1抗原肽特异结合又能与人ICAM-1抗原特异结合的阳性克隆J-A1。对scFv进行原核表达和亲和层析后获得了高纯度的目的蛋白。竞争ELISA实验和细胞黏附抑制实验证实纯化的scFv具有良好的亲和活性和抗细胞黏附活性。文中成功利用噬菌体展示技术筛选到特异性人源抗ICAM-1 scFv,为进一步探索该抗体在炎症相关性疾病治疗中的应用奠定了基础。 相似文献
10.
构建人源抗TNF-α单链抗体基因,并尝试其在E.coli中的表达和纯化,采用人工接头,按VH-linkerVL的结构将人源抗TNF-a的VH,VL基因拼接成单链抗体(ScFv)基因,并将构建好的ScFv基因插入表达载体pQE30,转染E.coli M15,以IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂纯化表达产物,构建的ScFv基因长723bp, 列分析表明,该序列拼接正确,SDS-PAGE显示,用重组的pQE30转化的M15菌经诱导后,有相对分子质量(M)约为52000的外源蛋白表达,Ni-NTA树脂纯化的表达产物纯度大于90%,因此,成功地构建了人源抗TNFa的ScFv基因,并在E.coli DH5a中表达和纯化的该基因的产物。 相似文献
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抗SARS 人源单链抗体H12的表达及复性 总被引:1,自引:1,他引:1
从SARS免疫抗体库获得的一株抗SARS-CoV人源单链抗体H12,亟待鉴定.为了快速制备大量具有生物活性的单链抗体H12,构建了pET28a-H12原核高表达载体,表达量占菌体总蛋白质30%以上.采用稀释复性和分子筛柱复性两种方法对包涵体蛋白进行复性与纯化,结果显示两种方法都能使得单链抗体复性.与稀释复性法相比,柱复性效果更好,其抗原结合活性是稀释复性法的1.51倍.柱复性后的单链抗体亲和力测定的解离常数Kd为73.5nmol/mL.为进一步研究单链抗体H12的功能奠定了基础. 相似文献
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应用噬菌体抗体库技术制备特异抗人纤维蛋白鼠单链抗体 总被引:4,自引:0,他引:4
应用Pharmacia公司的重组噬菌体抗体系统,从经过人交联纤维蛋白特异抗原D二聚体(DD)免疫过的鼠脾细胞mRNA中构建出组合单链抗体(ScFv)cDNA文库。文库cDNA克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E,转化大肠杆菌TG1,得到2.5×10~5个氨苄抗性菌落。通过噬菌体表面呈现,用DD对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行三轮亲和富集获得一株特异抗DD的噬菌体单链抗体(ScFvA11)。经Phage-ELISA鉴定,呈现在噬菌体表面的ScFvA11与DD结合的ELISA阳性滴度小于10~7tfu/ml,而与人纤维蛋白原结合的ELISA滴度大于10~(10)tfu/ml,两者相差1000倍以上。表明ScFvA11具有较好的DD结合特异性。经序列分析,ScFvA11cDNA全长729bp,其中Vh基因354bp,编码118个氨基酸;Vl基因327bp,编码108个氨基酸;Vh与Vl之间为(Gly_4Ser)_315个氨基酸连接肽。 相似文献
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人源抗HBsAg单链抗体在巴氏毕赤酵母中的表达 总被引:6,自引:0,他引:6
在P.pastoris中分泌表达非融合抗HBsAg单链抗体(HBscFv)。设计引物从pGEMHBscFv上扩增目的基因,亚克隆至P.pastoris表达载体pPICZαA中,线性化后转化P. pastorisGS115;转化子经菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定后,甲醇诱导目的蛋白表达。结果发现,重组HBscFv可以在α因子的引导下,分泌至培养基中,产量为80mg/L;分泌至培养基中的HBscFv具有结合HBsAg活性,活性总量在诱导培养72h后达最高峰,在诱导培养后期,HBscFv活性下降;PAS糖显色结果表明,酵母表达HBscFv是一种低糖基化蛋白或非糖基化蛋白。 相似文献
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人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv抗体的生物学特性研究 总被引:4,自引:0,他引:4
对抗狂犬病毒scFv进行稳定性改构 ,纯化制备有活性的人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv抗体片段 (dsFv) ,然后对其生物学活性进行研究。将dsFvVH 、VL 基因在原核表达系统pET22b(+) BL21(DE3)中表达 ,将其包涵体分别在变性缓冲液中溶解 ,稀释后加入折叠缓冲液使其折叠形成有活性的dsFv抗体片段 ,上Ni-NTA柱进行纯化。然后以其亲本scFv作为对照 ,对dsFv的亲和力、稳定性以及体外中和活性进行评价。结果显示 ,与其母本抗体scFv相比 ,改构后的抗狂犬病毒dsFv保持了对狂犬病毒Vero疫苗的特异性识别能力 ,而且其亲和力明显提高 ;抗狂犬病毒dsFv在血清和BSA中的稳定性有明显的改进 ,而且其热稳定性和抵抗尿素化学变性的能力亦大大改进 ;蚀斑减少中和实验显示 ,抗狂犬病毒dsFv抗体片段能特异中和狂犬病毒 ,阻止狂犬病毒对Vero细胞的吸附 ,抑制狂犬病毒对靶细胞的感染 ,从而导致蚀斑减少甚至消失 ;scFv抗体片段仅可部分抑制蚀斑的形成 ,但不能全部抑制。这为进一步研究抗狂犬病毒dsFv基因工程抗体的免疫保护作用及其在临床的应用奠定了基础。 相似文献
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汉坦病毒核蛋白在病毒各个基因组片段核糖核蛋白(RNP)复合物的形成,以及RNP复合物装配入病毒颗粒中发挥重要作用。体外研究表明,核蛋白与病毒RNA的特异性结合结构域位于第175—217个氨基酸残基,羧基端其它部分为非特异性结合结构域。为了在细胞内病毒复制的正常过程中研究核蛋白的功能,应用噬菌体表面呈现技术,分别从鼠杂交瘤细胞和人外周血淋巴细胞天然抗体库中,筛选出两株不同抗原结合位点的抗汉坦病毒核蛋白抗体L13 F3和H34Fab抗体,并在大肠杆菌中进行表达。L13 F3 Fab抗体的抗原结合位点位于核蛋白氨基端25—65个氨基酸之间,H34的抗原结合位点位于核蛋白的羧基端的一半。分别使重链可变区羧基端与轻链可变区氨基端通过9个氨基酸寡肽连接起来,构建成单链抗体,并在大肠杆菌内进行表达。通过酶联免疫吸附试验(EL-SIA)、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot检测,确定所构建单链抗体与母抗体的抗原结合特性无差别。单链抗体分子量小,易于操作并保留了全部的抗原结合活性,是在细胞内探索汉坦病毒核蛋白功能的良好工具。 相似文献
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全人源化抗结肠癌单链抗体基因的克隆和表达 总被引:4,自引:0,他引:4
分离大肠癌患者外周血单个核细胞 (PBMC) ,在体外用灭活的大肠癌细胞再次致敏后 ,经EBV转化 ,然后用有限稀释法克隆分泌抗大肠癌细胞抗体的B细胞 ;多次PCR扩增和克隆其抗体可变区基因 (VH/VLcDNA) ,并用编码 (Gly4Ser)3 的互补序列连接成ScFvcDNA(VH linker VL) ,经酶切克隆入载体fUSE 5RF ,使之呈现于噬菌体表面。通过用 3轮肿瘤细胞和正常人PBMC淘选后 ,ELISA检测 80%的单克隆噬菌体抗体显示了很强的阳性反应。以上结果初步说明 :联合应用体外致敏、EBV转化、PCR扩增和噬菌体呈现技术制备高亲和力全人源化的抗肿瘤抗体是可行的. 相似文献
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人源抗狂犬病毒单克隆抗体Fab段基因的获得和表达 总被引:2,自引:2,他引:2
运用噬菌体表面呈现(phage display)技术获得了人源抗狂犬病毒糖蛋白基因工程单克隆抗体Fab段基因及其表达。从狂犬病毒PM株Vero细胞疫苗免疫的人抗凝血中分离获得外周淋巴细胞,提取细胞总RNA,通过RTPCR方法,用一组人IgG Fab基因4特异性引物,从合成的cDNA中扩增了一组轻链和重链Fab段基因,将轻链和重链Fab段基因,将轻链和重链先后克隆入噬菌体载体pComb3,成功地建立了抗狂犬病毒抗原的方法,对此抗体库进行富积筛选表达,成功地获得了抗狂犬病毒的人源单抗Fab段基因及其在大肠杆菌中的有效表达,对其中一株单抗G10进行了较为系统的分析,发现它与一株鼠源中和性狂犬病毒糖蛋白特异性单抗存在竞争,证实该单抗能识别狂犬病毒糖蛋白,其序列资料分析表明,该单抗为一株新的抗狂犬病毒人源基因工程抗体。 相似文献