苯丙酮尿症分子遗传学研究进展

苯丙酮尿症是由于苯丙氨酸羟化酶基因突变引起的常染色体隐性遗传病。文章综述了苯丙酮尿症中的苯丙氨酸羟化酶基因的定位、结构、突变、调控以及突变基因的体外表达和苯丙氨酸羟化酶的三维结构特点等分子遗传学进展,阐述了苯丙氨酸羟化酶基因的突变对苯丙氨酸羟化酶的体外表达及其三维结构的影响, 以及部分基因型与表型相关的分子机制。 Abstract: Phenylketonuria(PKU) is one kinds of autusomal recessive disease caused by phenylalanine hydroxylase(PAH) gene mutation. This article reviews the recent molecular heredity progress on the phenylalanine hydroxylase gene’s orientation、structureand gene mutation and gene regulation. At same time, mutation gene in vitro expression and the character of 3D structure of PAH in PKU are involved. In this paper, also discussed the inflence of vitro expression and 3D protein structure by gene mutations and the molecular mechanism of the relationship between genotype and phenotype in PKU patient.     

《自然-化学生物学》：苯丙酮尿症具淀粉样变病特征

据近日《自然-化学生物学》（Nature Chemical Biology）的一项报告显示,科学家发现症状表现为苯丙氨酸浓度升高的代谢疾病——苯丙酮尿症（PKU）具有淀粉样变病的显著特点,包括有毒蛋白纤维的增加。     

中国北方人苯丙氨酸羟化酶基因外显子7内新突变的鉴定

应用ＰＣＲ－单链构象多态性分析及ＤＮＡ直接测序,对４５例中国北方苯丙酮尿症（ＰＫＵ）患者苯丙氨酸羟化酶（ＰＡＨ）基因外显子７内突变进行了鉴定。共检出６种错义突变及一种静止突变：Ｒ２４３Ｑ．Ｒ４１Ｈ,Ｇ２４７Ｖ．Ｌ２４９Ｈ．Ｐ２５４Ｉ．Ｇ２５７Ｖ和Ｖ２４５Ｖ。经与国际ＰＡＨ基因突变数据库比较,确认Ｇ２５７Ｖ．Ｐ２５４Ｉ和Ｌ２４９Ｈ为国际上首次发现的突变。结果揭示,中国人与其他种族及中国北方与南方人群ＰＡＨ突变特点不同。明确了中国北方人群中ＰＡＨ基因外显子７基因突变分布,有助于提高ＰＫＵ的基因诊断率,对基因的起源、进化研究有参考价值     

用基因芯片研究高苯丙氨酸诱导神经元基因表达谱的改变

为深入了解苯丙酮尿症患者高苯丙氨酸损伤神经元的可能机制,我们将体外培养3d的胚鼠神经元随机分为两组：高苯丙氨酸组和对照组。高苯丙氨酸组加入0．9mmol/L苯丙氨酸诱导12h,对照组加入等体积的培养液,抽提RNA,与大鼠神经生物学芯片U34杂交,检测胚鼠原代神经元高苯丙氨酸作用下表达谱的改变,并用实时荧光定量聚合酶链式反应方法验证基因芯片的结果。发现芯片上1323条总探针组合数中有167条基因表达增加(12．6％),表达下调的已知基因数为7条,占总探针组合数的0.5％。按基因功能,表达上升的基因可分为信号转导相关基因、神经元相关基因、细胞骨架基因、代谢相关基因、离子通道基因、转录相关基因、细胞因子基因、凋亡相关基因等。研究结果证实了以前的报道,如Na^ 、K^ -ATP酶、凋亡、氧化应激、NMDA受体、Ca^2 参与了高苯丙氨酸对神经元的损伤过程。结果还显示,在高苯丙氨酸环境下,CaMKⅡ、Ras、P38、钙通道基因表达上升,部分与囊泡形成、神经递质释放有关的基因表达增强,与神经递质谷氨酸有关的受体和转运体基因表达上升。我们推测高苯丙氨酸可能激活轴NMDR Ca^2 -CaMKⅡ-Ras-P38,引起神经元突起异常;高苯丙氨酸环境下,神经递质释放可能异常：兴奋性神经递质谷氨酸可能参与了高苯丙氨酸引起的神经元损伤。高苯丙氨酸对神经元的损伤是多因素作用。     

中国人苯丙氨酸羟化酶基因的一个新的切接位点突变的鉴定

本文鉴定了苯丙氨酸羟化酶基因355位密码子上的一个新的错义突变Q355 H, 此突变异致谷氨酰胺变成了组氨酸。此突变位点恰位于外显子10和内含子11的交界处, 因此将引起mRNA形成过程中的剪接错误而产生异常的mR NA。Q355H的鉴定为一例苯丙酮尿症胎儿的产前诊断提供了理论依据。 Abstract:A novel missense mutation at code 355 of phenylalanine hydroxlase gene was identified,this mutation caused the substitution of Gln 355 for His 355.The mutant site was at the boundary of exon 10 and intro 11 and might cause splicing errors during RNA processing,Which could result in abnormal mRNA.Identification of Q355H provided a theortic evidence for prenatal diagnosis of a fetus with PKU.     

欧芹苯丙氨酸脱氨酶cDNA在乳酸乳球菌中的表达研究

将欧芹（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍｃｒｉｓｐｕｍ）苯丙氨酸脱氨酶（ＰＡＬ）ｃＤＮＡ亚克隆到组成型表达载体ｐＭＧ３６ｅ启动子Ｐ３２下游,电穿孔法转化乳酸乳球菌,获得有ＰＡＬ表达活性的乳酸乳球菌工程菌（ｐＭＧ３６ｅＰＡＬ／Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３）。通过递归ＰＣＲ合成了一段１２０ｂｐ的调控片段,用以将ｐＭＧ３６ｅ改造为分泌型表达载体ｐＸＨＳ,以翻译偶联的方式表达ＰＡＬ,可使ＰＡＬ的Ｎ末端带上ｕｓｐ４５信号肽,结果亦检测到ＰＡＬ酶活性。自行分离克隆了乳酸乳球菌热休克蛋白基因ｄｎａＪ的启动子区域,构建了热诱导表达载体ｐＸＨＪ,获得ＰＡＬ热诱导表达工程菌（ｐＸＨＪＰＡＬ／Ｌ．ｌａｃｔｉｓＩＬ１４０３）,经３０℃至３７℃热诱导,可使ＰＡＬ表达活性提高至２倍。本文还就乳酸乳球菌ＰＡＬ工程菌在经典型苯丙酮尿症防治中的应用进行了分析和讨论     

苯丙酮尿症常用筛查方法的比较

苯丙酮尿症是一种由于体内缺乏苯丙氨酸羟化酶所引起的遗传性代谢异常疾病,如果能够做到早诊断、早发现、早预防和早治疗,就可以避免患儿以后出现智能发育障碍,因此开展新生儿的筛查工作十分重要。简要介绍了苯丙酮尿症的基本情况以及目前应用于临床的常用筛查方法,如细菌抑制法、荧光法等,并从筛查原理、主要优缺点等方面进行了简单的比较。     

苯丙氨酸脱氨酶在乳酸乳球菌NICE系统的高效表达及其实验动物研究

为构建苯丙氨酸脱氨酶的一种更新更高表达的基因工程菌,取得治疗高苯丙氨酸血症大鼠的更佳疗效。将欧芹PAL cDNA重组到质粒pNZ8048中,构建翻译融合载体和转录融合载体,分别转化乳酸乳球菌NZ9000。对两种高效表达菌株的酶活性差异进行比较,观察Nisin诱导的动态进程,并利用新鲜培养的p(NZ8048-PAL)₁/NZ9000工程菌进行了高苯丙氨酸血症大鼠(称PKU动物模型)的治疗实验。结果表明：（1）翻译融合型菌株具有更高的酶活性;（2）当Nisin的诱导时间达6h时, 产物肉桂酸生成量基本达到峰值;（3）给高苯丙氨酸血症大鼠灌喂新鲜培养的p(NZ8048-PAL)₁/NZ9000工程菌（翻译融合型）, 观察到该工程菌能显著降低模型动物血中Phe浓度,从而取得了更好的疗效。       

苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因外显子7及其两侧内含子的突变研究

为探讨中国苯丙酮尿症（PKU）人群中苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因外显子7的突变特征,对147例PKU患儿的294个PAH基因外显子7以及两侧部分内含子序列,应用PCR－单链构象多态性（SSCP）分析及基因序列分析的方法进行了筛查和确定。共发现13种突变基因：G239D、R241C、R241fs、R243Q、G247S、G247V、R252Q、L255S、R261Q、M276K、E280G、P281L、Ivs7+2T>A,其中7 种突变基因在中国PKU人群首次发现：G239D 、R241fs 、G247S 、E280G、L255S、R261Q、P281L,前4种在国际上尚未见到报道,并已提交到国际PAH突变数据库（www.pahdb.mcgill.ca）。突变基因的总频率为30.61%（90 /294）。突变涉及了错义、缺失、移码和剪接位点4种突变类型。结果明确了PAH基因外显子7的突变种类和分布等特征,表明外显子7是中国人PAH基因突变的热点区域。 Abstract: To study mutation in exon 7 of the gene for the phenylalanine hydroxylase（PAH）, the mutations in exon 7 and flanking sequence of PAH gene were detected by means of SSCP analysis and DNA sequencing, in 147 unrelated Chinese children with phynelketonuria and their parents. Thirteen different mutations, including 11 missense, 1 deletion and 1 splice mutation, were revealed in 90/294 mutant alleles (30.61%). The prevalent mutations were R243Q (22.8%) and Ivs7nt2t->a (2.38%). Seven novel mutations were identified: G239D, R241fsdelG, G247S, E280G, L255S, R261Q, P281L. These new mutations have not been described in Chinese PKU population and the first 4 mutants have not been reported and thus been submitted to www.pahdb,mcgill.ca. The missense was the most common type. The deletion and frameshift mutations were detected for the first time in Chinese PKU population. This study showed the mutation characteristics and their distribution in exon 7 of PAH gene and proved that the exon 7 was the hot region of PAH gene mutation in Chinese PKU population .     

三种婴儿代谢遗传缺陷病及其哺乳对策

三种婴儿代谢遗传缺陷病及其哺乳对策李光秀（福建省松溪县医院妇产科３５３５００）１苯丙酮尿症（ＰＫＵ）该症是一种人们最早认识的较常见的氨基酸代谢遗传缺陷病。大约在１万人中可以发现１个人肝内缺乏苯丙氨酸羟化酶（即苯丙氨酸个单加氧酶），使苯丙氨酸降解为酪氨...     

串联质谱技术应用于新生儿遗传代谢病筛查,以甘肃省为例

为了明确甘肃省新生儿遗传代谢病的患病情况及分布情况。2017年1月1日至2018年10月31日期间,本研究应用串联质谱技术对41 232例甘肃省新生儿进行遗传代谢病筛查。研究显示,所有筛查的新生儿中,共有67例确诊为遗传性代谢病,患病率为16.25/10 000。疾病类型主要包括3大类,即氨基酸代谢病(苯丙酮尿症,高甲硫氨酸血症,高苯丙氨酸血症)、有机酸代谢病(甲基丙二酸血症,β-酮硫解酶缺乏症,异戊酸血症)和脂肪酸代谢病(脂肪酸氧化代谢障碍、原发性肉碱缺乏症)。苯丙酮尿症的患病例数和患病率为最高,其次为甲基丙二酸血症。此外,阳性率和确诊率在不同性别、出生体重、出生季度和分娩方式亚组中无显著差异(p0.05)。然而,在出生孕周亚组中,足月儿的阳性率和确诊率显著低于早产儿和过期产儿(p0.05),提示孕周可能是遗传代谢病患病的重要影响因素。     

苯丙氨酸的脱氨酶法测定

方法的原理是：由某些微生物所产生的苯丙氨酸脱氨酶能使苯丙氨酸分子氧化脱氨,生成相应的苯丙酮酸。在合适的反应体系中,苯丙酮酸与三氯化铁反应生成的化合物呈蓝绿色,这种颜色的深浅与苯丙氨酸含量成正比,制备的标准曲线有良好的线性。因而可借此法对测试样品中的苯丙氨酸含量     

使用偏爱密码子大幅度提高苯丙氨酸脱氨酶在食品级乳酸乳球菌中的表达

为获得苯丙氨酸脱氨酶(PAL)在食品级乳酸乳球菌中的高效表达,将欧芹palcDNA(palnat)及根据乳酸乳球菌偏爱密码子设计人工合成的pal基因(palart)重组并转化到两种乳酸乳球菌NICE诱导表达系统中,测定基因工程菌表达PAL酶的量及活性,对比分析密码子偏爱性对乳酸乳球菌表达外源蛋白的影响。结果表明在两种乳酸乳球菌NICE表达系统中,使用偏爱密码子均可显著提高PAL酶的表达效率,使NZ9000/pNZ8048表达系统表达量提高22.23倍,NZ3900/pNZ8149系统提高35.90倍。此研究获得了安全高效表达PAL,可用于治疗苯丙酮尿症的基因工程菌。     

苯丙酮尿症患者的血清氨基酸测定

本文使用日立835—50型高速氨基酸分析仪,测定了两例苯丙酮尿症患者的血清中游离氨基酸浓度,结果发现:8个月患儿的血清苯丙氨酸浓度比我国报道的7—13个月正常儿血浆中苯丙氨酸值高10倍,而孕妇患者比我市近年来测定的正常孕妇血清中苯丙氨酸高23倍多。这种测定对优生优育具有积极意义。     

我国自行构建的L-苯丙氨酸工程菌株发酵产酸率达国际先进水平

福建省发展和改革委员会于2009年1月17日对福建省麦丹生物集团有限公司和福建沙县侨丹实业有限公司共同承担的"L-苯丙氨酸高产基因工程菌的构建和应用"项目进行科技成果鉴定,由中国工程院院士、浙江工业大学原校长沈寅初教授和清华大学曹竹安教授等专家组成的鉴定委员会,对该项目给予很高的评价,认为所构建的工程菌株ES-4573-2其产酸率达国际先进水平,并足以形成具有自主知识产权的科技成果,使我国L-苯丙氨酸生产进入国际先进行列.L-苯丙氨酸是人体和动物不能在体内自行生物合成的必需氨基酸之一,广泛应用于食品、饲料、医药和日用化工等领域.尤其是低热量、高甜度的二肽甜昧剂-阿可斯巴甜的主要原料,市场需求量大.为进一步提高L-苯丙氨酸产酶产酸水平,增强我国L-苯丙氨酸在国际市场中的竞争力,该项目在两位国家级专家施巧琴教授和吴松刚教授的直接领导下,该课题组在国内外首次应用分子定向协同共进化技术对L-苯丙氨酸代谢途径关键酶基因进行整体改造,构建成突变库,筛选出具有高产酸水平的突变株,取得了显著成效.采用上述技术,工程菌株ES-4573-2经小试、中试进入试产,在采间歇式补料及发酵优化控制的基础上,产酸率较酪氨酸缺陷型宿主菌株提高了292％,取得了重大突破.目前,该工程菌株已在大生产中使用,生产性能稳定,对提高L-苯丙氨酸的产量和质量起了重要的作用,为我国发酵工业的发展作出了贡献.     

Henna基因突-变是导致北京紫眼果蝇眼部蝶呤含量减少的重要原因

苯丙氨酸羟化酶被认为参与黑腹果蝇眼部蝶呤代谢,但是始终都缺乏有力证据．Henna是苯丙氨酸羟化酶的编码基因,“北京紫眼”果蝇（Hnbp）是Henna基因的一个隐性突变体,Hn^bp突变形成的原因是Henna基因的第二外显子上具有插入片段．在Hn^bp中,其编码产物的Biopterin—Hydroxyl功能域中增加了15个氨基酸残基．蛋白预测结果显示,插入的残基改变了原有的蛋白结构,这种变化很可能降低了苯丙氨酸羟化酶与四氢生物蝶呤结合的能力．为了恢复突变表型,利用UAS—GAL4转基因体系使野生型Henna基因在Hn^bp的背景下表达．在双拷贝的转基因系GMR—GAL4 UAS—Henna／UAS—Henna;Hn^bp／Hn^bp中,突变表型得到完全恢复：果蝇的眼色由突变体的紫色恢复到野生型的红色,蝶呤含量也从突变体的30％升至98％,与野生型差异不显著（P〉0．05）．上述实验结果充分说明,Henna基因突变是导致Hn^bp突变体眼部喋呤含量降低的重要原因,为苯丙氨酸羟化酶参与果蝇眼部蝶呤代谢提供了体内实验的直接证据．     

靶向小鼠Idua基因的CRISPR/Cas9系统构建及打靶效率分析

黏多糖贮积症(mucopolysaccharidosis,MPS)是一种遗传代谢病.人IDUA基因编码的α-L-艾杜糖苷酶(α-L-iduronidase,IDUA)功能异常是导致Ⅰ型MPS的主要病因.本研究拟构建特异性靶向小鼠Idua基因的CRISPR/Cas9编辑系统,用以模拟人IDUA基因突变,为建立精准模拟Ⅰ型MPS的细胞模型和动物模型提供高效基因编辑系统.本研究筛查了人类IDUA基因的致病突变,并将候选突变位点定位于小鼠Idua基因上,作为拟突变位点.然后通过sgRNA的设计、表达质粒构建、转染、药物筛选、TA克隆测序等步骤证明了设计的sgRNA具有高效的打靶效力.本研究结果对深入研究MPS的致病机制和探讨MPS的治疗具有重要意义.     

大肠杆菌AroG蛋白F209S突变体对苯丙氨酸反馈抑制作用的影响(英文)

在大肠杆菌中 ,80 %的 3 脱氧 D 阿拉伯 庚酮 7 磷酸 (3 deoxy D arabino heptulosonate 7 phosphate,DAHP)合酶由aroG基因编码。分别以大肠杆菌K1 2及其抗苯丙氨酸类似物的突变体总DNA为模板 ,以PCR方法扩增得到aroG基因及其突变体。基因测序结果表明抗苯丙氨酸类似物的突变体 ,其aroG基因核苷酸 62 5位发生了T→C的点突变 ,从而使AroG蛋白的 2 0 9位氨基酸由Ser取代了Phe。aroG基因及其突变体克隆到表达质粒 pTrc99A上 ,在大肠杆菌JM 1 0 5中进行表达 ,表达产物的SDS PAGE上可以看到分子量相当明显的条带 ;菌体粗提物中DAHP合酶的活性提高了 1 .8倍 ;酶活抗性检测表明AroG蛋白突变体在一定程度上解除了苯丙氨酸的反馈抑制作用 ;与含K1 2aroG基因的JM1 0 5细胞相比 ,含aroG基因突变体的JM1 0 5细胞可以在含高浓度苯丙氨酸类似物的培养基上生长。     

苯丙酮尿症

这是一种代谢缺陷的隐性遗传病,是由一种隐性基因(p)所决定的。只有在基因纯合(p/p)时才表现病症。 这种病主要是因患者肝脏中缺乏苯丙氨酸羟化酶,致使体内的苯丙氨酸不能氧化成酪氨酸,因此使大量的苯丙氨酸累积在血和脑脊髓液中或随尿排出。如果在尿中加几滴氯化高铁,尿就呈深绿色。苯丙氨酸对婴儿神经系统有损