反向遗传学技术在疫苗研究的进展

本文通过反向遗传学技术的基本原理,发展历史和反向遗传学技术在疫苗研究方面的进展与应用,重点介绍了反向遗传学技术在流感病毒疫苗方面的应用。     

利用反向遗传学技术构建H5亚型禽流感高产疫苗株

采用RT-PCR技术分别扩增了鹅源高产禽流感病毒的6条内部基因片段,近期分离的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素基因以及N3亚型参考毒株的神经氨酸酶基因,分别构建了8个基因的转录与表达载体,利用反向遗传学技术拯救出了全部基因都源于禽源的重组流感病毒疫苗株rH5N3。通过对血凝素蛋白HA1和HA2连接肽处的5个碱性氨基酸(R-R-R-K-K)基因缺失与修饰,从而消除了病毒基因的毒力相关序列,拯救的rH5N3疫苗株对鸡和鸡胚均无致病性,病毒在鸡胚尿囊液和细胞培养上清的HA效价得到极大提高,分别为12048和1512。制备的禽流感疫苗免疫动物后4~5周即可诱导产生高效价的HI抗体,鸡免疫后18周依然保持高水平的HI抗体。重组疫苗不论是对于国内早期分离的禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96还是近期分离的A/Goose/HLJ/QFY/04都能够产生完全的免疫保护作用,免疫鸡攻毒后不发病、不排毒、不死亡。带有N3鉴别诊断标记禽流感疫苗株的研制为H5N1高致病性禽流感的防治提供了新的技术保障。     

RNA病毒的反向遗传学

反向遗传操作作为一种新兴技术在RNA病毒的研究中发挥着重要作用。本文介绍了RNA病毒反向遗传学的研究方法以及RNA病毒反向遗传技术的最新研究进展。     

流感病毒的反向遗传学研究进展

反向遗传学是指对病原微生物的cDNA进行目的性修饰,以对其进行功能和表型的分析[1]。它是相对于经典遗传学而言的,后者是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰,如定点     

口蹄疫病毒反向遗传学研究进展

反向遗传学操作技术在口蹄疫病毒(FMDV)病原学基础研究领域的应用, 使得人们能够在基因组整体水平上研究病毒基因的功能。得益于反向遗传学系统的不断完善和发展, 目前人们对FMDV分子病原学也有了更加深入的认识和理解。本文结合实验室在FMDV反向遗传学方向上所开展的探索性研究工作, 综述了国内外利用反向遗传学操作技术在研究FMDV分子致病机制、病毒毒力与变异的关系、病毒复制的影响因素、新型FMD基因疫苗的研制等领域所取得的进展, 展望FMDV反向遗传学研究新动向。     

反向遗传学技术在猪瘟病毒研究中的应用

猪瘟目前在许多国家流行并对养猪业造成巨大损失。虽然常规疫苗(如中国猪瘟兔化弱毒疫苗,即C株)在猪瘟防控中发挥巨大作用,但近年来在猪瘟防控中出现的新情况,如非典型感染、持续性感染及免疫失败等;同时目前世界上许多国家正开展的猪瘟扑灭计划使得弱毒疫苗的应用受到很大限制。因此,加强猪瘟病毒在致病机理、传播机制等方面的研究以及加快新型猪瘟疫苗的开发是当务之急。近年来,反向遗传学技术的发展为猪瘟病毒基因功能研究和疫苗制备方面开辟了新思路。以下回顾了反向遗传操作技术在猪瘟病毒基因功能研究与标记疫苗株构建方面的研究进展,同时提出了该领域目前面临的问题,并对其未来发展方向进行了展望。     

流感病毒反向遗传学技术研究进展

流感病毒亚型众多,且极易发生变异,给防控带来很大困难,所以当务之急应加强其在致病机理、传播机制等方面的研究和加快新型流感疫苗的开发．近年来,反向遗传学技术的发展为流感病毒基因功能研究和疫苗制备方面开辟了新思路．     

反向遗传学技术及其在FMDV研究中的应用

反向遗传技术是一种新兴的分子生物学技术,已广泛应用于生命科学研究的各个领域。综述反向遗传技术研究进展,并讨论该技术在口蹄疫病毒研究中的应用。     

狂犬病病毒反向遗传学及其应用

反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰,如定点突变、基因插入缺失置换等,再按组成顺序构建含有生物体必需元件的修     

狂犬病毒反向遗传学技术的研究及应用进展

反向遗传学技术是上世纪90年代在分子病毒学研究领域兴起的新技术,通常也被称为“病毒拯救”。综述了应用反向遗传学技术“拯救”狂犬病毒的主要技术体系以及反向遗传学技术在狂犬病毒致病机理、狂犬病毒疫苗及载体研究中的应用进展。     

口蹄疫反向疫苗研究进展

利用反向遗传技术对口蹄疫病毒基因的改造和修饰,可以实现对疫苗种毒的生产性能、抗原匹配性、抗原稳定性、免疫应答能力、生物安全性等特征的改良,能够迅速获得预期生物学特性的疫苗候选株,进而可以减少和避免流行毒株驯化环节带来的负面影响。不仅改变了对流行毒株筛选驯化受病毒自然属性制约、费时费力、成功率低的缺陷,而且可以实现更为主动有效的疫苗毒株的设计,对整体提升疫苗品质和效力具有重大意义。本文以口蹄疫病毒为例,从改良疫苗毒株的生物学特性方面进行了综述,为相关研究提供参考和借鉴。     

哺乳动物正呼肠孤病毒反向遗传学研究进展

呼肠孤病毒科是分布最广的病毒类群之一,其中哺乳动物正呼肠孤病毒(Mammalian Orthoreovirus,MRV)属于正呼肠孤病毒属,主要感染哺乳动物的呼吸道和肠道。近年来,MRV的反向遗传学操作技术取得了长足进步,运用该技术,在MRV基因组组装、基因功能及致病机制等方面都获得了较大突破。综述了MRV反向遗传学操作技术的建立过程及运用该技术取得的最新成果,并展望了该技术在呼肠孤病毒科其他病毒中的应用。     

反向遗传学在呼吸道合胞病毒减毒活疫苗研究中的应用

人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, RSV)是引起婴幼儿下呼吸道感染的最重要的病毒病原,减毒RSV活疫苗能模拟自然感染充分活化机体固有免疫系统,并诱导产生体液免疫和细胞免疫,不会产生疾病增强作用,经黏膜途径应用,能突破母传抗体的干扰,因而受到广泛关注,反向遗传学(reverse genetics)在减轻野生型RSV毒力和增强其免疫原性等方面具有传统减毒技术不可比拟的优势,所以综述了反向遗传学在RSV减毒活疫苗研究中的应用。     

基于质粒的轮状病毒反向遗传学研究进展

轮状病毒是全球范围内引起婴幼儿急性胃肠炎的最主要病原体,2016年导致的儿童死亡病例为228047例,每年导致的住院病例则高达200万例。轮状病毒属于呼肠孤病毒科,基因组由11条分节段的双链RNA (dsRNA)组成,被三层衣壳包裹。病毒反向遗传学技术的建立加快了病毒学的研究。2017年,完全依赖质粒的轮状病毒反向遗传学技术获得突破,随后在轮状病毒致病机制、疫苗研发、载体构建等方面取得重要进展。本文将就此技术的建立、发展和应用进行综述,供相关领域人员参考,以期加快我国轮状病毒的研究和应用,推动我国轮状病毒急性胃肠炎的预防和控制。     

反向遗传学在现代生物学领域中的应用

反向遗传学是一种新兴的分子生物学技术.主要从反向遗传学的含义、研究方法及应用等角度进行综述,并介绍有关反向遗传学研究的最新进展.     

禽流感病毒血凝素疫苗在转基因马铃薯中的表达

利用转基因马铃薯表达禽流感病毒血凝素疫苗,将含有禽流感病毒血凝素序列的表达载体导入农杆菌,再感染马铃薯的幼茎外植体。转化植株的再生及温室栽培,Western blot分析表明,83％的转化植株在其块茎组织中表达了重组血凝素,表达量占总蛋白量的0．03－0．04％,结果显示用马铃薯生产口服禽流感疫苗是可行的。     

猫杯状病毒反向遗传学操作系统的建立及其应用的研究进展

猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)是引起猫呼吸道疾病的一种常见病原,自1995年以来,国内外相继建立了FCV反向遗传学操作系统并且FCV反向遗传学在病毒基因组结构与功能、表达外源蛋白、与宿主相互作用、致病机理等研究方面的应用已经取得了一些进展,本文通过收集FCV反向遗传学相关的研究文献,对FCV反向遗传学操作系统的建立及其应用研究进展进行综述,以期为相关领域的研究提供有益的参考与借鉴。     

有关疫苗的几个概念

在过去的100多年里．疫苗在预防病毒和细菌性的传染病方面起了非常大的作用,为人类健康和畜牧业的发展做出了重要的贡献。随着分子生物学和基因工程技术的发展和应用,近20年中．基因工程疫苗的研究取得了快速的进展,各种新型的基因工程疫苗应运而生。关于疫苗,特别是一些新型的基因工程疫苗．许多人还不是很了解．现将有关疫苗的几个概念整理如下,供教学工作者参考。     

应用反向遗传学技术在哺乳动物细胞中产生甲型流感病毒

在国内首次应用反向遗传学技术将多个质粒共转染哺乳动物细胞,得到了具有活性的甲型流感病毒.采用自行构建的含有polⅠ和polⅡ启动子和终止子序列的pIVV2质粒,将A/PR/8/34(H1N1)流感病毒基因组全部8个RNA节段的cDNA分别克隆到该质粒的两个启动子之间,得到了8个可在真核细胞中复制和表达的质粒.将这8个质粒共转染293T细胞,培养48h后吸取上清液,转接入MDCK细胞中,再经过72h培养,发现在MDCK细胞中有明显的流感样细胞病变产生,测上清病毒血凝滴度为1:10.将MDCK细胞冻融液继续接种鸡胚和MDCK细胞,培养后将鸡胚尿囊液和MDCK细胞冻融上清液进行血凝和血凝抑制实验,证明所得病毒为A/PR/8/34(H1N1).此结果将有助于国内今后对流感疫苗的研究.     

基于反向遗传学技术获取具有精确末端的EV-A71

目的基于反向遗传学技术,设计可获取具有精确末端的肠道病毒A71(enterovirus A71, EV-A71)的方法,并在病毒感染能力研究和抗病毒药物筛选中进行应用。方法利用同源重组方法,在病毒基因组5′末端,引入具有顺式酶切活性的锤头状核酶(cis-active hammerhead ribozyme)序列;在病毒3′末端的poly(A)尾后,引入限制性核酸内切酶NsiⅠ酶切位点(ATGCA↓T),构建含有EV-A71全长感染性克隆的质粒(pBR322-EV-A71)。pBR322-EV-A71经体外转录获得EV-A71感染性RNA,用该RNA转染横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyo-sarcoma cells, RD),以获取具有精确末端的EV-A71颗粒。通过检测病毒RNA拷贝数、病毒蛋白的表达量等指标,验证拯救病毒的感染能力和抗病毒药物的抑制作用。结果 pBR322-EV-A71经体外转录所得RNA,在转染进入RD细胞后,观察到细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)并检测到病毒负链RNA,表明成功合成了EV-A71颗粒;拯救病毒颗粒在连续传代过程中,病毒增殖能力得以逐步提升,第4代病毒(R4 EV-A71)的感染能力强于第1、2、3代病毒(R1、R2、R3 EV-A71)(P<0.001),且已趋近于野毒株(wild-type EV-A71, wt EV-A71)水平(P>0.05);U0126和sorafenib两种ERK通路抑制剂可以有效抑制R4 EV-A71的增殖(P<0.001),且R4 EV-A71与wt EV-A71表现出同等程度的抑制作用。结论 pBR322-EV-A71可拯救出具有精确末端的EV-A71病毒颗粒,且其子代病毒可代替wt EV-A71进行病毒感染能力的评价和抗病毒药物的筛选。