大鼠骨髓基质干细胞的分离培养与向神经元样细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨大鼠骨髓基质干细胞的提取、分离培养和体外扩增的最佳条件,研究其在体外培养中定向诱导分化为神经元样细胞的可能。方法 通过密度梯度离心和贴壁培养法从成年大鼠骨髓中分离骨髓基质干细胞,进行培养扩增,观察其生长特性;用2-巯基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME)对传代细胞诱导分化,并通过免疫细胞化学染色鉴定分化细胞的类型。结果 原代培养时形成由基质干细胞组成的细胞集落,细胞集落14d时接近融合,传代后,细胞体积变大,约5～7d传代一次。β-ME诱导后,70％以上的细胞在形态上呈神经元样,免疫细胞化学染色呈NSE阳性,GFAP阴性,说明诱导分化的细胞为神经元,而不是星形胶质细胞。结论 骨髓基质干细胞在体外培养条件下生长良好,并可连续传代;在β-ME作用下可被诱导分化为神经元样细胞。     

神经妥乐平体外诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞

目的探索神经妥乐平(NT)体外诱导大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,rMSCs)分化为神经元样细胞的可行性,以期为临床应用MSCs治疗神经系统疾病奠定基础。方法取一月龄SD大鼠骨髓,分离出MSCs进行培养、扩增、纯化。用NT诱导MSCs分化为神经元样细胞。用神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色鉴定阳性细胞。结果MSCs经诱导后胞体变圆,伸出细长突起,呈神经元样形态。免疫组化鉴定显示(31.50±7.32)%的细胞表达NSE阳性,(45.30±9.38)%的细胞表达GFAP阳性。结论MSCs在体外可被NT诱导分化为神经元样细胞。     

人骨髓基质细胞的长期培养及其对病毒的敏感性

为了长期培养骨髓基质细胞和研究其对病毒的敏感性,我们采用静置贴壁培养法,体外长期培养了胎儿、儿童和成人骨髓基质细胞,并将传至５代以上的肌样骨髓基质细胞采用微量细胞病变（ＣＰＥ）法,开展了对５种病毒的敏感性试验。结果表明,人骨髓基质肌样细胞对滤泡性口腔炎病毒,脊髓灰质炎病毒、Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒均敏感,能产生明显的ＣＰＥ,其效价（ＴＣＩＤ５０）可达１０＾－３～１０＾－４,其中胎儿骨髓基质肌样细胞对     

人骨髓基质细胞的长期培养及其对病毒的敏感性

为了长期培养人骨髓基质细胞和研究其对病毒的敏感性,我们采用静置贴壁培养法, 体外长期培养了胎儿、儿童和成人骨髓基质细胞,并将传至5代以上的肌样骨髓基质细胞采用微量细胞病变(CPE)法,开展了对5种病毒的敏感性试验.结果表明,人骨髓基质肌样细胞对滤泡性口腔炎病毒,脊髓灰质炎病毒、I型和Ⅱ型单纯疱疹病毒均敏感,能产生明显的CPE ,其效价(TCID50)可达10-3～10-4,其中胎儿骨髓基质肌样细胞对病毒敏感性至少比儿童高2倍,比成人高4倍,即胎儿＞儿童＞成人,但对B3型柯萨奇病毒均不敏感.我们的研究结果不仅可为人骨髓基质细胞体外长期培养提供了确实可行的简便方法, 而且为该细胞对病毒的敏感性提供了实验依据,并为该细胞的利用开辟了新的应用前景.     

Neuritin诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞的电生理研究

目的:探讨神经营养因子Neuritin诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞的电生理特性.方法:应用膜片钳技术,采用全细胞记录方式,对由Neuritin诱导的大鼠骨髓基质细胞进行诱导前后的电生理功能测定.结果:分化后的神经元样细胞较诱导前细胞的膜特性[静息膜电位(RMP)膜电容(Cm)串联电阻值(RS)]有了显著改变(p＜0.01).分化后细胞记录到K+电流,包括两种成分:外向延迟整流K+电流和内向整流K+电流.结论:骨髓基质细胞经过Neuritin诱导能够向功能性神经元方向分化.     

骨髓基质细胞的特征及其在细胞和基因治疗中的应用

骨髓基质细胞是一类独特的间质干细胞,可分化为多种非造血系的组织。骨髓基质细胞具有贴壁生长的特性,因而易于在体外分离和扩增;另外骨髓基质细胞可在体内外表达多种治疗性的外湖目的基因。因此,骨髓基质细胞被认为是一种理想的治疗性细胞的基因治疗中的靶细胞。本文对骨髓基质细胞的研究进展及其在细胞和基因治疗中的应用作一综述。     

抗氧化剂对皮肤角质细胞体外寿命的影响

考察了抗氧化剂对鼠角质细胞体外培养寿命的影响。实验发现在角质细胞的体外培养过程中添加抗氧化剂有利于延长细胞的寿命,其中效果最好的是巯基乙醇,其次为过氧化氢酶和SOD,但在体外培养过程中,角质细胞生长速率仍然逐渐下降。实验还发现,添加抗氧化剂可在一定程度上提高角质细胞的克隆形成率,减缓细胞衰老速率。同时,通过考察鼠表皮角质细胞衰老动力学,获得了对应于不同抗氧化剂的细胞衰老动力学常数。      

骨髓基质干细胞向心肌细胞诱导分化的实验研究

目的探讨大鼠骨髓基质干细胞在体外和体内向心肌细胞诱导分化的能力,为下一步的细胞移植治疗心肌梗死提供实验基础.方法体外诱导实验中,将不同浓度的5-氮胞苷作用于不同培养时间的骨髓基质干细胞,摸索5-氮胞苷的最佳诱导时机和浓度,观察诱导后细胞形态变化,并用免疫细胞化学染色检测心肌特异性肌钙蛋白T的表达;在体内实验中,培养扩增的骨髓基质干细胞经BrdU标记后,自体移植于正常心肌内,分别通过BrdU和心肌特异性肌钙蛋白T免疫组织化学染色检测移植细胞的存活和分化情况.结果体外诱导实验中,5-氮胞苷的诱导作用以10μmol/L的浓度对传代细胞进行两次诱导,效果最好,不仅能诱导出表达心肌特异蛋白的心肌样细胞,而且这些细胞在体外能够自发搏动.体内诱导实验中,移植的细胞在正常心肌微环境中能够存活并分化为心肌细胞.结论骨髓基质干细胞在体外化学诱导和体内心肌微环境诱导时均能分化为心肌细胞,可用于细胞移植治疗心肌梗死的实验.     

诱导体外培养的骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

选用Wistar大鼠分离骨髓间充质干细胞作体外培养及鉴定其表达抗原CD44、CDw90;采用10μmol／L 5-氮胞苷诱导第1代的骨髓间充质干细胞,于诱导后2、4周进行免疫细胞化学反应检测α-横纹肌肌动蛋白、肌钙蛋白T。证实体外培养的第1代骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷诱导可分化为心肌样细胞,为指导体外诱导的心肌细胞应用于。临床提供一定的理论依据和技术手段。     

转基因骨髓基质细胞系对人脐血CD34+细胞的体外扩增作用

为探讨转染FL和/或TPO基因骨髓基质细胞系对脐血CD34+细胞的体外扩增效应, 建立了转基因骨髓基质细胞系共培养体系. 采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+细胞, 在CD34+细胞不同体外培养体系中取样测试细胞总数、CD34+细胞百分率和CFC(包括CFU-GM 和BFU-E). 结果表明, 在8种不同组合的培养体系中, 转基因基质细胞共培养体系较无基质液体培养体系对细胞总数, CFC, CD34+细胞均具有明显的扩增效应, 其中以SCF + IL-3 + HFT扩增效果最好, 分别扩增了(893.3±52.1), (74.5±5.2)和15.7倍. CFU-GM和BFU-E在第2周时达扩增高峰, 扩增倍数分别为(78.1±5.5)和(57.0±19.7). LTC-IC测定结果显示, 只有SCF + IL-3 + FL + TPO和SCF + IL-3 + HFT组有LTC-IC的存在, 统计学检验无显著性差异. 上述结果提示, 转基因骨髓基质细胞系可通过细胞间的接触协同其他细胞因子增强对脐血CD34+细胞的体外扩增作用.     

利用脱细胞血管基质体外构建小口径组织工程血管

目的探讨利用犬的间充质干细胞诱导分化种子细胞,以异种脱细胞血管基质为基础体外构建小口径血管移植物。方法采用密度梯度离心和贴壁培养的方法从犬骨髓中分离出间充质干细胞并体外培养,诱导分化成内皮样细胞和平滑肌样细胞;采用非离子型去垢剂和胰蛋白酶去除猪颈动脉血管壁结构细胞,对脱细胞基质进行组织学、力学检测及孔隙率评估。在生物反应器内采用旋转种植的方法将犬骨髓间充质干细胞诱导的内皮样细胞种植到脱细胞基质上,体外构建小口径组织工程血管。结果犬的骨髓间充质干细胞体外能够定向诱导分化为平滑肌样细胞和内皮样细胞,可以作为血管组织工程的种子细胞。经过脱细胞处理后,光镜和电镜观察证实血管壁的细胞成分完全去除。具有良好的孔径和孔隙率。支架在生物力学、孔隙率等方面符合构建组织工程血管支架的要求。在生物反应器内剪切力条件下可以初步构建出组织工程血管。结论小口径血管移植物可以将间充质干细胞诱导种子细胞,以异种脱细胞血管支架作为基质,在搏动性生物反应器内培养的方法进行构建。     

骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的探讨大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化后超微结构和细胞因子表达的变化,为下一步细胞移植治疗扩张型心肌病提供理论依据。方法在体外扩增、定向诱导骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的基础上,电镜下观察骨髓基质干细胞诱导前后超微结构的改变,RT-PCR检测心肌特异性因子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC的表达,并与原代培养的心肌细胞比较,观察二者之间的生物学异同。结果免疫组化法证实诱导后的骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化,电镜下胞浆内可见糖原颗粒,肌原纤维排列与原代培养的心肌细胞相似;RT-PCR证实诱导后的骨髓基质干细胞表达心肌特异性因子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC。结论骨髓基质干细胞经5-氮胞苷定向诱导后在超微结构和细胞因子的表达上类似于心肌细胞,已向心肌样细胞分化。     

骨髓基质细胞在梗塞区与非缺血区心肌中的分化

目的观察心肌梗塞环境对移植骨髓基质细胞(MSC)向心肌样细胞分化的影响.方法采用成年近交系Wistar大鼠,经左冠状动脉前降支结扎建立急性心肌梗塞模型.术后1周,将来自同种供体、经体外扩增和DAPI标记的MSC分别植入梗塞区和非缺血区心肌.移植后1、2、4周取材、连续冰冻切片,观察两种环境中MSC的分布、迁移及心肌特异性肌钙蛋白T(TnT)的表达.结果植入梗塞区中的MSC扩散较快、增殖似更明显.两种环境中都可见移植细胞表达TnT,且有少数细胞呈现心肌样横纹,但梗塞区移植细胞TnT阳性率显著高于非缺血区.结论急性心肌梗塞环境有利于骨髓基质细胞向心肌样细胞分化.     

人骨髓基质细胞体外分离及定向培养内皮细胞

用Ficoll(比重1.077 g/ml)从正常成人骨髓中分离骨髓基质细胞(BMSCs),DMEM-HG 培养基内含20?S、GM-CSF(100 u/ml)、VEGF(10 ng/ml)、FGF(5 ng/ml)、L-谷氨酰胺(2mmol/ L)、肝素(90 u/ml),以及抗生素液进行定向培养和扩增其中的内皮细胞(ECs),Ⅷ因子相关抗原的免疫组化法和透射电镜观察(TEM)鉴定其细胞的性质。结果5.0×105个BMSCs在体外经定向ECs 培养和扩增8代后,获得了6.0×109个ECs,扩增了约1.2×104倍。70%-80%的细胞对Ⅷ因子相关抗原免疫组化呈阳性反应;光镜下细胞呈典型的“鹅卵石”样;TEM下可观察到胞浆内有Weible- palade小体,证实为内皮细胞。实验表明,BMSCs在体外分离和定向培养的ECs,经扩增后可能是心血管组织工程所需种子细胞的又一个重要来源。     

兔骨髓基质干细胞向血管内皮样细胞的诱导分化

目的:研究血管内皮细胞生长因子(VEGF)联合碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)促进兔骨髓基质干细胞向血管内皮样细胞的定向诱导分化,为血管化组织工程骨研究提供实验基础.方法:采集2周龄兔后肢长骨骨髓,用全骨骨髓贴壁法进行原代培养,将获得的第2代骨髓基质干细胞以1× 105/mL密度接种于内皮细胞条件培养基(含10 μg/L VEGF,10 μg/L bFGF,10％胎牛血清的DMEM/F12培养液)进行体外诱导培养,对诱导2周的细胞进行细胞形态观察和表型、功能鉴定.结果:经血管内皮细胞条件培养基诱导2周后的细胞呈扁平形,多边形,表达血管内皮细胞特异性标志CD31、VWF因子,细胞具有吞噬DiI-Ac-LDL和摄取FITC-UEA-1的功能,诱导的细胞可在BD基质胶内形成管腔样结构.结论:血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子可以成功诱导兔骨髓基质干细胞为血管内皮样细胞,有希望作为组织工程骨的血管化的种子细胞.     

人骨髓基质细胞对精原干细胞体外增殖的影响研究

精原干细胞是精子形成的原始细胞,在睾丸组织中的含量极低,而体外有效扩增方法的选择对其移植治疗和抗生育研究十分重要。本实验选用人骨髓基质细胞代替传统饲养层培养人精原干细胞,探讨精原干细胞能否在该饲养层上增殖的可能机制,为人精原干细胞培养提供实验方法和技术指导。骨髓基质饲养层的制备：无菌分离流产5～8月胎儿股骨,     

施万细胞条件培养基对大鼠骨髓间质细胞的诱导分化作用

目的　探讨施万细胞条件培养基对大鼠骨髓间质细胞的诱导分化作用。方法　从大鼠骨髓中分离培养间质细胞并传至第 6代 ,诱导前 2 4h加 1μg·L-1碱性成纤维生长因子 (bFGF)入培养液中以促分裂 ,再以施万细胞条件培养基作诱导剂 ,观察细胞形态的变化 ,并采用免疫组织化学法对诱导后一周的细胞进行Map 2及NSE、GFAP表达的检测。结果　诱导后 48小时间质细胞在形态上表现为神经元样 ,神经元样细胞呈Map 2及NSE阳性 ,而GFAP显阴性。结论　施万细胞的上清液能诱导骨髓间质细胞分化为神经元样细胞。     

大鼠脊髓匀浆上清诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:观察大鼠脊髓匀浆上清诱导骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)形成的神经元样细胞形态特征.方法:通过贴壁法培养分离大鼠骨髓MSCs,体外扩增纯化后加入正常大鼠脊髓匀浆上清诱导72h,倒置显微镜下观察诱导前后细胞的形态结构.激光共聚焦显微镜观测钙离子细胞形态和荧光强度变化,免疫细胞化学方法鉴定诱导后细胞的表型特征.结果:倒置显微镜下可见MSCs呈纺锤形和多角形,核居中,有1-2个核仁,诱导后细胞呈神经元样,细胞伸出较长的轴突样和树突样突起.免疫细胞化学法显示NSE(神经元特异性烯醇化酶)、NF(神经丝蛋白)阳性,GFAP(神经胶质细胞酸性蛋白)阴性.共聚焦显微镜扫描脊髓匀浆上清诱导前细胞形态呈细长的梭形,细胞核不明显,胞体染色强,突起染色弱,荧光像素值低;诱导后,细胞呈现神经元样形态,胞体大,有多个突起,胞体及各突起染色强,荧光像素值高.结论:大鼠脊髓匀浆上清液可在体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞.     

川芎嗪体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

为了探讨川芎嗪体外诱导小鼠骨髓间质干细胞（BMSCs）分化为神经元样细胞的作用,以小鼠骨髓间充质干细胞为研究对象,实验分为空白对照组、β-巯基乙醇（BME）阳性对照组和川芎嗪诱导组。采用荧光免疫化学和Western blot方法,分别检测神经干细胞巢蛋白（nestin）和经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达;RT-PCR检测诱导不同时间对神经细胞相关基因Nestin、NSE、β-微管蛋白III（β-Tubulin III）和核受体相关因子-1（Nurr1）mRNA表达的影响。结果显示川芎嗪诱导间充质干细胞24 h后,细胞形态发生显著改变,细胞突起形成且数目不等,形成神经元样细胞。细胞死亡率低于β-巯基乙醇诱导组。免疫荧光化学法和western blot结果显示：川芎嗪诱导后的细胞nes-tin和NSE蛋白表达呈阳性,且表达丰度显著高于β-巯基乙醇诱导组。川芎嗪作用不同时间的BMSCs表达神经细胞相关基因Nestin、β-Tubulin III、NSE和Nurrl。结果表明川芎嗪能定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,是较理想的诱导剂。     

银杏内酯B 诱导大鼠骨髓间充质细胞分化为神经元样细胞的电生理研究

目的:研究银杏内酯B(GB)诱导大鼠骨髓间充质细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的电生理特性。方法:应用膜片钳技术,采用全细胞记录方式,对由GB诱导的大鼠MSCs进行诱导前后的电生理功能测定。结果:分化后的神经元样细胞较诱导前细胞的膜特性有了显著改变(P<0.05)。结论:大鼠MSCs经过GB诱导能够向功能性神经元方向分化。