人亲环素B基因的克隆表达及重组蛋白的生物活性

应用ＲＴ－ＰＣＲ方法从人淋巴细胞中扩增出亲环素Ｂ（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＢ,ＣｙＰＢ）基因,克隆入ｐＥＴ－２８ａ载体中表达．表达产物以包涵体形式存在,占细菌可溶性蛋白的１５％．经Ｎｉ－ＮＴＡ树脂金属螯合亲和层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０柱层析纯化,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测呈单一条带,毛细管电泳为单一色谱峰,纯度达９５％．经复性处理,表达产物显示肽基脯氨基顺反异构酶活性     

人神经生长因子基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

神经生长因子(Nerve　Growth Factor,NGF)是最早发现的生长因子之一。它对中枢和周围神经元具有存活分化效应^[1]。NGF有可能治疗Alzheimers老年痴呆病、某些周围神经病变和脊髓损伤^[2]。NGF在人体组织中含量极微,已有报道从胎盘中纯化hNGF,但其组织来源极其有限,成本高,产量低．不能满足对hNGF的需求,所以如果能利用基因工程方法获得大量有生物学活性的hNGF制品,对其基础理论研究和临床应用具有深远的意义。我们根据已知序列设计合成一对引物,以人基因组DNA为模板,用PCR获得hNGF基因,并构建重组表达质粒．使rehNGF在大肠杆菌中获得表达,表达产物具有免疫学和生物学活性。     

重组人亲环素A的表达,纯化及活性测定

将RT－PCR扩增得到的亲环素A（CyPA）基因片段插入原核表达载体pET11c中,得到重组质粒pET11／CyPA,转入大肠杆菌获得高效表达。Spe－PAGE分析表明,重组CyPA表达量占菌体可溶性蛋白的40％以上。经50％硫酸铵沉淀和DEAESepharoseCL－6B柱层析可纯化重组CyPA。用糜蛋白酶偶联法测定显示重组CyPA具有肽基脯氨酸顺／反异构酶活性。     

重组人亲环素A的表达、纯化及活性测定

将RT－PCR扩增得到的亲环素A（CyPA）基因片段插入原核表达载体pET11c中,得到重组质粒pET11／CyPA,转入大肠杆菌获得高效表达。Spe－PAGE分析表明,重组CyPA表达量占菌体可溶性蛋白的40％以上。经50％硫酸铵沉淀和DEAESepharoseCL－6B柱层析可纯化重组CyPA。用糜蛋白酶偶联法测定显示重组CyPA具有肽基脯氨酸顺／反异构酶活性。     

人神经生长因子基因在大肠杆菌中的克隆、表达及产物纯化

从人胎盘组织中提取总DNA, 经PCR扩增编码人β神经生长因子（β-NGF）成熟肽的基因,并克隆到大肠杆菌表达载体pET15b中。重组质粒pET15b-NGF经测序与报道的完全一致。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导表达得到16kD的目的蛋白带,与预期的大小一致,NGF表达量约占全菌总蛋白的25%.经过亲和层析柱（Ni2+-charged IDA his-bind column）纯化后得到了单一的NGF蛋白条带,蛋白纯度可达90%以上,从每升表达菌液中可以得到4.56mgNGF。表达产物的Western 印迹鉴定结果显示：重组人神经生长因子能与兔抗人β-NGF的多克隆抗体发生特异性结合反应,在16kD处出现单一的条带,表明诱导表达的重组NGF具有免疫学活性。鸡胚背根神经节感觉神经元鉴定试验表明,本实验表达的重组NGF具有良好的生物学活性。     

人蛋白质二硫键异构酶Cdna基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从人胚胎肝组织中分离纯化出总RNA,在总RNA中提取mRNA,经逆转录得到cDNA第一条链,并以之为模板和相应寡聚脱氧核苷酸为引物．进行PCR合成人蛋白质二硫键异构酶(Proteim disulfide isomerase,PDI)cDNA基因,将所得cDNA克隆到质粒pUCl8上,转化大肠杆菌DH5a细胞,进行诱导表达筛选和活性筛选。将筛选的基因克隆到载体pBV220上,在大肠杆菌细胞中表达,产物以溶解形式在胞浆中表达。表达产物经硫酸铵分级沉淀和DEAE Sepharose Fast Flow柱层析分离,产物的纯度与活性分别为90％、1100u／g。     

天花粉蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

天花粉蛋白 (Trichosanthin ,TCS)全长基因通过PCR从 pCDNA3 1中获得 ,克隆至表达载体中。双向测序表明获得的天花粉蛋白全长基因序列正确。建立大肠杆菌原核表达系统 ,表达并纯化His TCS活性融合蛋白 ,鉴定出其具有RNAN 糖苷酶活性和与TCS特异性单克隆抗体TE1 (IgE)结合的抗原活性     

大花杓兰亲环素基因的克隆及生物信息学分析

亲环素是一个多基因家族,在植物生命活动中发挥着重要的作用。该研究以大花杓兰(Cypripedium macranthum)为材料,采用RT-PCR技术克隆到1个亲环素基因(CyP),并对其进行生物信息学分析。结果表明:大花杓兰CyP基因的开放阅读框序列为525 bp,命名为CmCyP(GenBank登录号为MH411125),编码174个氨基酸。预测CmCyP蛋白是一个位于细胞质、相对分子量约为18 kD、理论pI为8.73、无信号肽、跨膜结构域的亲水性蛋白质。磷酸化和糖基化位点预测分析发现,CmCyP蛋白存在18个潜在的磷酸化位点和2个潜在的糖基化位点。蛋白保守结构域预测分析发现,CmCyP蛋白包含一个高度保守的肽脯氨酰顺反异构酶结构域,属于单结构域亲环素。对二级结构进行预测分析发现,CmCyP蛋白中存在无规卷曲70个、延伸链56个、α-螺旋23个、β-折叠25个,这4种结构元件在三级结构中也有体现。系统进化树结果显示,大花杓兰CmCyP蛋白与铁皮石斛(Dendrobium catenatum)和万带兰(Vanda hybrid cultivar)的CyP蛋白的亲缘关系较近。该研究首次克隆了大花杓兰亲环素基因(CmCyP),为进一步探讨CmCyP基因的生物学功能奠定了基础。     

抗菌肽-X基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR技术获得抗菌肽—X基因、TNFα基因,与温度诱导的表达载体pRC连接成为重组表达载体,导入大肠杆菌TG1,通过温度诱导表达重组蛋白。将重组质粒转入不同的表达菌中进行表达,经SDS—PAGE选出E.coil BL21(DE3)为最佳表达的宿主菌。培养后,离心得菌体,经超声破碎离心得包涵体,溶解后用CNBr切割并透析,最后经CM52纤维素柱分离纯化得到有活性高纯度的抗菌肽—X。     

乙内酰脲水解酶基因在大肠杆菌中的克隆表达

节杆菌BT801的乙内酰脲酶系能够水解5-苄基乙内酰脲生成L-苯丙氨酸,其中乙内酰脲水解酶负责乙内酰脲的水解开环。乙内酰脲水解酶的表达对于乙内酰脲酶的催化机制研究及氨基酸的生物不对称合成都具有重要意义。通过PCR技术扩增得到乙内酰脲水解酶基因(hyuH),置于表达载体pT221的,17启动子下游,将构建的重组质粒引入大肠杆菌BL21(DE3)。SDS-PAGE分析在相对分子量50kD处有一较强的表达带,经薄层扫描分析目的蛋白占全菌蛋白的40％,主要以可溶性形式存在,活性分析表明表达产物具有天然的酶活性。     

人胶源神经营养因子基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

胶源神经营养因子（Ｇｌｉａｌｃｅｌｌｉｎｅｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ,ＧＤＮＦ)是大鼠B49细胞系中分离纯化得到的一种蛋白质^[1],由于其对多巴胺神经元的专一性的神经营养作用而被发现。GDNF成熟蛋白由134个氨基酸组成,具有两个N-糖基化位点。它属于TGF-β基因家族但与该家族其它成员的氨基酸序列同源性仅为20%,可能是一个新的亚家族。最近研究表明,它对发育中的运动神经元也有很强的神经营养作用^[1]。对啮齿类^[3,4],灵长类的弥猴^[5]的活体试验表明,胶源神经营养因子是一种治疗神经退化发夹知病如帕金森氏症、肌萎缩性脊髓索硬化症等的非常有效的潜在药物。由于GDNF在体内含量极低而且公在发育早期表达,因而只有通过基因工程方法才能获得大量的GDNF。本文报道采用PCR方法从中国入基因组DNA 中扩增出编码GDNF的基因,并实现在大肠杆菌中的高效表达。这为进一步研究GDNF的结构和生物学功能打下了坚实的基础。     

人可溶性APRIL(sAPRIL)基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从GenBank中查找出人APRIL蛋白 (编号:075888)序列 ,取其部分胞外 (sAPRIL)序列设计引物 ,用RT PCR从扁桃体总RNA中扩增出人sAPRIL基因 ,经克隆测序后进行同源比较 ,证实所克隆的基因即为sAPRIL。克隆载体经酶切后构建了表达载体 ,并在大肠杆菌中表达 ,纯化蛋白后进行细胞学实验表明sAPRIL有明显刺激肿瘤细胞增殖的作用 ,为深入研究sAPRIL的功能奠定了基础     

人胰岛素A,B链基因的合成,克隆及其在大肠杆菌中的表达

Human insulin A and B chain genes were designed and synthesized by using a rapid and simple method. The synthesized A and B chain genes were cloned separately. The expression (plasmids) pWR 590-HIA and pWR 590-HIB were constructed, and the two plasmids can direct the synthesis of the approximately 590 amino acid-long truncated beta-galactosidases fused to human insulin A or B chains. The fused A or B chain proteins were isolated from the fermented cells and cleaved with BrCN. The resulting mixtures were sulfonated and the sulfonated A and B chains were purified. Human insulin was obtained by using an A and B chain combination method.     

人胰岛素A、B链基因的合成、克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据人胰岛素A、B链的多肽顺序,设计并用一种简便快速的多肽基因合成了A、B链基因。合成的A 链和B 链基因分别克隆到pWR590质粒上,构建了表达型质粒pWR590-HIA和pWR 590-HIB,它们能够表达由β-半乳糖苷酶N-端约590个氨基酸残基与A 链或B 链组成的融合蛋白(两者之间由Met 连接)。A 链或B 链融合蛋白经BrCN 降解,磺化及分离纯化等步骤,得到了磺化A、B 链。磺化A、B链体外重组得到人胰岛素。     

人酸性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用Ncol Ⅰ和EcoRI双酶酶切,获得人酸性成纤维细胞生长因子haFGF基因,将该基因片断连接进入pBV220的EcoRI位点。连接物转化入大肠杆菌RR1,用菌落原位杂交的方法筛选出杂交阳性菌株,用酶切和Southern Blot的方法确定haFGF的插入与否以及插入方向的正反,结果我们得到了haFGF正向插入在pBV220 PLPR启动子下游的重组质粒pBV-αFGF。42℃热诱导使重组子表达,其菌体的裂解液对3T3细胞的DNA合成有较强的促进作用,说明重组菌株能够表达具有生物活性的hαFGF。SDS-PAGE结果表明,hαFGF表达产物约占菌体总蛋白的15％。hαFGF表达产物以包涵体的形式存在。     

人防御素6基因的克隆、亚克隆及在酵母中的分泌表达

探讨人防御素6(HD-6)在毕赤酵母中表达的可行性,为进一步研究HD6的功能提供理论依据和实验基础。采用PCR方法,设计引物从cDNA文库中扩增出人α防御素6基因片段,并将其插入到克隆载体pMD-18T中,再与毕赤酵母表达载体pPICZαA重组,以得到重组的HD-6酵母表达载体pPICZαA/HD-6,并进行琼脂糖电泳和测序鉴定。再将构建好的毕赤酵母重组表达质粒pPICZαA/HD-6经SacⅠ线性化后,应用LiCl法转化毕赤酵母菌株GS115感受态中,Zeocin平板筛选,PCR鉴定转化子。经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDSPAGE分析重组HD-6的表达。从cDNA文库中扩增出的HD-6基因片断大小正确;电泳和测序结果均证明已将此片段克隆到酵母表达载体pPICZαA内;线性化的重组质粒pPICZαA/HD-6成功转化进入毕赤酵母感受态中,PCR鉴定结果与预期相符;蛋白电泳证实重组HD-6在酵母中获得分泌表达。提示重组HD-6可以在毕赤酵母中实现分泌表达。     

β—淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

β—淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达王峥,周蓓芸,郑幼霞（中国科学院上海植物生理研究所,２０００３）关键词高温放线菌,β—淀粉酶,基因克隆β—淀粉酶是一种外切型淀粉水解酶,它从淀粉的非还原性末端依次水解α－１,４葡萄糖昔键,产生分构型的麦芽糖。内...     

解毒酶基因的克隆及在大肠杆菌中的融合表达

用RT－PCR克隆了酯酶B1 5′端B1（a）,并对其者了序列测定,将其与3′端B1（b）一起连接到pET-28a中,构了完整融合表达载体pET-ESTB1。转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下,经过12小时,酯酶B1在大肠杆菌内的融合表达达到27％。通过纯化获得1条带的重组蛋白,用粗酶对马拉硫磷的降解显示,该解毒酶在15分钟即降解22.1％,具有较高降解有机磷酸酯类农药的能力,为利用真核生物的自然资源进行农药污染的生物治理等提供了新途径。     

人细胞色素c基因在大肠杆菌中的克隆和表达及活性测定

通过PCR方法 ,从人胎儿心肌基因组DNA中得到precytc基因 (有 1个内含子 ) ,剔除内含子后 ,得到细胞色素c基因的编码序列 .测序结果表明 ,该基因与GenBank中报道的人细胞色素c基因核苷酸顺序完全一致 .将其插入原核表达载体pET3a的NdeⅠ和HindⅢ位点之间构建pET3a cytc重组质粒 ,并成功转化入E .coliBL2 1(DE3)中 .经IPTG诱导表达后 ,15 %SDS PAGE分析 ,可观察到1条与细胞色素c蛋白分子量相符的电泳条带 .Western印迹结果显示 ,该条带与小鼠抗人cytc单克隆抗体IgG2b发生特异反应 ,证实为人细胞色素c的前体蛋白 .体外使血红素与该前体蛋白结合生成完整的人细胞色素c蛋白 ,其耗氧量在不同浓度具有与反应时间的线性关系 ,为研究人细胞色素c结构和功能关系奠定了基础     

金黄葡萄球菌fnbB基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起奶牛乳房炎主要致病菌之一,主要通过其菌体表面的黏附素侵入寄主细胞引起疾病,为奶牛业造成巨大损失。金黄色葡萄球菌表面蛋白纤连蛋白结合蛋白(fibronectin-binding protein,FnBP)是其关键的黏附因子,在研制抗金黄色葡萄球菌的新型疫苗中占有重要地位.本文根据GenBank中纤连蛋白结合蛋白B基因（fnbB）序列设计特异性引物,以金黄葡萄球菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得3 458 bp 的DNA片段。使用T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM T easy Vector中,成功构建出了克隆质粒pGEM-fnbB。以 BamHI和XhoI 双酶切pGEM-fnbB和pET28a(+),并将纯化的基因fnbB 亚克隆至pET28a(+)中,构建出原核表达质粒pET28a-fnbB,并将其转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,经1 mmol/L的IPTG诱导和SDS-PAGE分析,在约165 ku 处出现了与预期目的蛋白相一致的外源蛋白带,Western blot分析结果表明该蛋白具有金黄葡萄球菌的抗原性。金黄葡萄球菌pET28a-fnbB成功表达为金黄葡萄球菌引起的奶牛乳房炎的诊断和研究新型疫苗奠定基础。