新城疫病毒HN和F基因遗传变异相关性的研究

选取国内1999~2005年发生的NDV毒株,经CEF蚀斑纯化和SPF鸡胚增殖,对其融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因分别进行克隆测序,结合在GenBank中发表的具有F和HN基因的NDV序列,利用DNAStar软件,对其不同毒株的F或HN基因片段和全长、F和HN基因全长分别进行遗传变异的研究,利用统计学软件SPSS8.0进行同源性相关分析。结果表明:不同NDV毒株F或HN基因片段与其全长之间,核甘酸r≥0.973,氨基酸:0.911≤r≤0.968,遗传变异高度相关,但F与HN基因全长之间核甘酸的遗传变异呈现弱相关(r=0.312)。国内NDV野毒株之间HN核甘酸高度同源(同源率97%以上),而与La Sota同源率仅为79.2%~80.7%,且显示出明显的地域性。     

抗体选择压作用下新城疫病毒HN和F基因的演化及其抗原性变异的比较分析

TZ060107株新城疫病毒(NDV)在含有对它抗体的鸡胚成纤维细胞(CEF)培养上分3个独立系列连传50代,每10代扩增其HN和F基因并测序。选择变异最大的系列A1-50病毒,再在含有抗A1-50抗体的CEF培养上分3个独立系列连续传50代,同时设3个不带抗体的独立传代系列作为对照。对第60、70、80、90、100代病毒的HN和F基因序列比较结果显示,有抗体组HN基因的非同义突变(NS)对同义突变(S)比值NS/S为5.25,明显高于无抗体组NS/S的2.375。前50代在抗体选择压作用下已发生的稳定NS突变在含有抗A1-50抗体的细胞培养中传代仍能稳定保持,且又出现了一个新的稳定的NS突变位点。在有抗体组经传50代后F基因发生的稳定非同义突变,在抗A1-50血清作用下再连传50代后也仍然保持,且又出现3个新的稳定的NS突变。不同传代病毒与原始病毒间的血清交叉血球凝聚抑制试验结果表明,随着在含有抗NDV血清的细胞培养上传代代数的增加,病毒与原始病毒间在抗原性的差异越来越大。     

华南地区新城疫病毒HN基因的克隆及其系统发育分析

用RT-PCR一步法扩增了华南地区NDV野毒HN基因, 并对其中的3株的HN基因897bp片段进行了克隆、测序及同源性分析.本试验还对该毒株的系统发育情况进行了分析中国华南地区NDV各毒株与欧美国家Ⅰ至Ⅴ基因型明显分离,遗传关系较远.台湾省的NDV各毒株归属为一型,并且与华南株的遗传距离较近.NDV华南FS1株不能归类到任何一个基因型中.广东地区从鹅群中分离到的副粘病毒GPMV株与我们从鸡体中获得的NDV FS2株有很近的亲缘关系.     

华南地区新城疫病毒HN基因的克隆及其系统发育分析

用RT PCR一步法扩增了华南地区NDV野毒HN基因 ,并对其中的 3株的HN基因 897bp片段进行了克隆、测序及同源性分析。本试验还对该毒株的系统发育情况进行了分析 :中国华南地区NDV各毒株与欧美国家Ⅰ至Ⅴ基因型明显分离 ,遗传关系较远。台湾省的NDV各毒株归属为一型 ,并且与华南株的遗传距离较近。NDV华南FS1株不能归类到任何一个基因型中。广东地区从鹅群中分离到的副粘病毒GPMV株与我们从鸡体中获得的NDVFS2株有很近的亲缘关系     

细胞培养上新城疫病毒HN基因在抗体免疫选择压作用下的抗原表位变异

本实验研究了抗体免疫选择压对新城疫病毒（NDV）HN基因和F基因变异的影响。将NDV野毒株TZ060107分别接种到含有抗NDV的单因子血清（A组）与不含抗体的（B组）鸡胚成纤维细胞中连续传代,每组设3个独立的传代系列。分别对第10,20,30,40,50代病毒的HN和F基因进行扩增克隆测序。序列比较结果显示,有抗体A组HN基因发生突变的位点数明显多于无抗体B组,且非同义突变（NS）与同义突变（S）比值NS／S为6,明显高于无抗体B组NS／S的3.4。在有抗体A组有5个碱基位点发生稳定的非同义突变,而且其中3个（aa#353,521和568）与已知的抗原表位密切相关。F基因在有抗体A组也出现2个稳定的非同义突变,无抗体B组没有产生稳定变异。但不论在有抗体A组还是无抗体B组,F基因变异的NS／S比均小于2.5。本研究表明,抗体免疫选择压可显著影响HN基因变异,但对F基因变异的影响小于HN基因。     

NDV山东分离株的生物学特性及其HN基因的克隆与序列分析

2004年从山东某鸡场发病蛋鸡群中分离到一株新城疫病毒（编号：ShD-2-04）,对其生物学特性进行了研究,并对其HN基因进行了克隆和序列分析。结果表明：该病毒的最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间（MDT）为50．4,1日龄SPF鸡脑内接种分离病毒致病指数（ICPI）为1．85,6周龄SPF鸡静脉接种致病指数（IVPI）为2．42,表明该病毒具有新城疫强毒株的一些特征;其HN基因开放性阅读框架（ORF）为1,716bp,编码571个氨基酸;与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,核苷酸序列的同源性在81．6％-87．2％之间,氨基酸同源性在87．6％-90．7％之间。     

猪源新城疫病毒JL01株分离鉴定及F基因遗传进化分析

2000年,在吉林省某猪场发生具有较高发病率和死亡率的急性传染病,发病率达到40%～50%,病死率15%,取其脾、肺、肾等组织进行电镜观察,可见副粘病毒样颗粒,表明其病原可能为某种猪源副粘病毒,命名为JL01株。在对该病毒的的血凝、血凝抑制等生物学特性进行鉴定后,初步确定该种猪副粘病毒为猪源新城疫病毒。病毒回归试验表明,纯化的病毒对猪仍有较强的致死性,并可从死亡猪体内分离到新城疫病毒。该病毒对鸡胚平均致死时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)和半数致死量(EID50)分别为55.2h、1.60和10-7.5/0.1 mL,表明该毒株属于新城疫病毒强毒株。在此基础上,采用RT-PCR方法克隆了猪源新城疫病毒F基因,与其他10株NDV毒株进行序列比较分析,结果表明,JL01株与B1、LaSota、Clone30等经典的新城疫病毒弱毒株同源性较高(91.5%～98.5%),与ZJ1、Mukteswar等强毒株的同源性较低。F基因氨基酸裂解位点的序列为112G-K-Q-G-R-L117,与弱毒株序列完全相同。基因分型结果表明JL01株属于基因Ⅰ型。因此,本研究所分离到感染猪的新城疫病毒属于基因变异的新城疫病毒弱毒株...     

人癌胚抗原与新城疫病毒HN基因共表达载体的构建及表达

注射肿瘤疫苗 ,诱发机体产生特异性抗肿瘤免疫 ,是肿瘤生物治疗及手术后预防肿瘤复发、转移的重要手段之一。肿瘤核酸疫苗较重组蛋白或多肽疫苗来说 ,具有无可比拟的优点 ,它可同时诱导体液免疫和细胞免疫 ,后者在肿瘤免疫中起关键作用。传统的肿瘤疫苗是经各种方法灭活后的自体瘤苗 ,它虽可以诱导细胞免疫 ,但仍存在着灭活不彻底 ,导致人为瘤细胞种植的潜在危险 ,况且从操作性方面也较为繁琐、复杂。肿瘤抗原往往抗原性较弱 ,尤其是相关抗原 ,在某些正常组织中也有微量的表达 ,这容易使机体免疫系统对它产生免疫耐受 ,因此在激发肿瘤特异性…     

新城疫病毒HN基因的遗传变异与HI相关性的研究

选取国内1999~2004年分离的新城疫野毒10株,经CEF蚀斑纯化和SPF鸡胚增殖,对其血凝素-神经氨酸酶(HN)基因分别进行克隆和测序,结合在GenBank中发表的LaSota、F48E9和Clone30等参考序列,对其氨基酸序列进行遗传变异分析,绘制系统发育树。利用SPF鸡在隔离器中分别制备上述NDV毒株的单因子阳性血清,进行血凝抑制(HI)交叉试验,计算NDV不同株之间的HI相关系数(r)。利用统计学软件SPSS8.0对NDV不同株之间的HN氨基酸同源率和HI相关系数(r)进行相关比较。结果表明:NDV野毒间氨基酸高度同源,同源性为96.5%~99.8%,而与LaSota、F48E9和Clone30同源率仅为87.4%~89.9%;所有野毒均缺乏1个潜在的糖基化位点;HN基因的氨基酸同源性与HI相关系数显著相关(P<0.01,r=0.55)。     

新城疫分离毒HN基因的分子特性和片段同源相关性

选取国内1997-2005年分离的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)24株,经蚀斑纯化克隆其血凝素-神经氨酸酶(HN)基因,与在GenBank发表的36株国内外不同时期的NDV毒株,进行氨基酸遗传变异分析,并利用SPSS8.0软件对其不同片段的氨基酸进行同源相关比较。结果显示:国内所有NDV分离毒株氨基酸高度同源,同源性为94.4%-99.4%;与LaSota、Clone30疫苗株等的氨基酸同源性为86.9%-89%;与强毒株F48E9的氨基酸同源性为87.9%-89.9%;与国外NDV的氨基酸同源性为87.2%-96.2%。系统发育分析表明:国内NDV分离毒HN遗传距离较近,而与LaSota、Clone30和F48E9遗传距离较远。国内NDV分离毒均缺乏538-540位糖基化位点。不同片段与全长的氨基酸同源性高度相关,且与前80个氨基酸相关最密切。     

新城疫不同毒株交叉鸡胚中和指数及其与F和HN基因变异的相关性

选取13株国内2001～2004年分离的新城疫流行病毒(Newcastle disease virus,NDV),经蚀斑纯化,克隆其融合蛋白(F)和血凝素.神经氨酸酶(HN)基因,结合疫苗株La Sota、Clone30和国内标准强毒株F48E9等的基因序列,进行遗传变异分析.利用纯化的病毒制备特异阳性血清,进行鸡胚交叉中和试验,确定不同NDV毒株之间的抗原相关性,并与NDV不同毒株之间的HN和F基因核苷酸(氨基酸)同源性进行相关比较.结果表明:病毒中和指数与HN基因的核苷酸(氨基酸)同源性显著相关(P<0.01,r=-0.35),与F基因呈弱相关(P<0.05,r=0.20),而与F基因前374bp的核甘酸同源性不相关.这表明,NDV的分子变异已经对NDV的抗原性变异产生了影响,研制新型的疫苗成为必然.     

Construction and characterization of recombinant fowlpox virus co-expressing F and HN genes of newcastle disease virus and gB gene of infectious larygnotracheitis virus

The Fusion (F) and Haemagglutinin-Neuraminidase (HN) genes of Newcastle disease virus (NDV) and the glycoprotein B (gB) gene of infectious laryngothracheitis virus (ILTV) as well as a LacZ reporter gene were all inserted into a nonessential gene of fowlpox virus (FPV) 017 strain by homologous recombination. The NDV and ILTV genes were each under the control of a fowlpox virus immediate early/late promoter (LP2EP2), whereas the LacZ reporter gene expression cassette was regulated by a P11 late promoter. A recombinant FPV harboring the F, HN and gB genes as well as the LacZ gene, designated as rFPV-F/HN/gB/LacZ, was obtained after ten cycles of blue plaque purification. The presence of the NDV and ILTV genes was confirmed by PCR. The expression of the recombinant proteins in rFPV-F/HN/gB/LacZ was characterized by Western blot (F and gB proteins) and indirect immunofluorescence tests (F, HN and gB proteins). The results demonstrated that all four foreign proteins, which were encoded within a 10-kb gene fragment, could be expressed authentically and efficiently. Compared with the parental virus, rFPV-F/HN/gB/LacZ showed no obvious difference with respect to virus replication and cytopathogenic effects in the cell culture of chicken embryo fibroblasts (CEF). Overall, this study suggests that FPV can be a useful live virus vector for the expression of multiforeign genes against multiple avian pathogens.     

置换HN基因对新城疫病毒LaSota株致病力的影响

[目的]新城疫病毒的血凝素.神经氨酸酶(HN)和融合蛋白(F)在病毒装配、出芽、释放及侵入宿主细胞的过程中发挥关键作用,但HN对病毒致病力的影响程度尚不完全清楚.[方法]为探讨这一问题,本研究以中等毒力毒株Mukteswar的HN基因替换我国广泛应用的LaSota疫苗株HN基因,通过反向遗传操作技术拯救出嵌合病毒(rL-MuHN).[结果]rL-MuHN红细胞吸附能力较亲本株rLaSota无显著升高,具有相似的细胞融合活性;嵌合病毒ICPI由rLaSota株的0.36降为0,MDT≥90,IVPI=0与rLaSota株相同,保持典型低致病力缓发型特点不变.进一步以Mukteswar株F基因替换rL-MuHN的F基因,拯救出F和HN双基因替换嵌合病毒rL-MuFHN,尽管该病毒的细胞融合能力显著提高,但其MDT、ICPI和IVPI分别为98 h,0.59和0,显示F和HN双基因替换仍未能使嵌合新城疫病毒rL-MuFHN的致病力达到中等毒力毒株Mukteswar(MDT、ICPI及IVPI分别为46 h、1.32和0.64)的水平.[结论]试验结果表明,F及HN囊膜蛋白基因之外的病毒基因组骨架背景对病毒的致病性同样具有重要的决定性意义,不同HN蛋白对嵌合病毒的致病能力的影响不同,与供体毒株毒力无关;以流行野毒株HN替代rLaSota疫苗株构建抗原针对性更强的弱毒疫苗株存在技术可行性.     

表达鸡新城疫病毒F、HN基因和传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒的构建及其特性研究

利用同源重组将新城疫病毒(NDV)的F和HN基因、传染性喉气管炎病毒(ILTV)的gB基因以及报告基因LacZ插入鸡痘病毒(FPV)的017株的复制非必需区,其中NDV的F、HN基因、ILTV的gB基因以及报告基因LacZ是在早晚期启动子LP2EP2的控制下,大肠杆菌报告基因LacZ在晚期启动子P11的控制下。经过10轮蓝斑纯化获得了包含了NDV的F和HN基因、ILTV的gB基因以及报告基因LacZ的重组鸡痘病毒,称为rFPV-F/HN/gB/LacZ。经PCR方法证明rFPV-F/HN/gB/LacZ基因组中含有NDV的F基因、HN基因和ILTVgB基因;间接免疫荧光试验和Western-blot试验表明NDV的F、HN蛋白和ILTVgB蛋白在rFPV-F/HN/gB/LacZ感染的CEF细胞中获得表达。与亲本毒相比,重组病毒在病毒的复制和致鸡胚成纤维细胞的病变方面无显著不同。这证明了在鸡痘病毒载体的一个复制非必需区可以同时插入多个禽类病原的多个外源基因,为制备多价基因工程疫苗奠定了基础。     

微生物介导的新城疫病毒疫苗的研制现状

新城疫病毒引起的新城疫是一种禽类急性接触性传染病,采用疫苗防治该病是当前研究的热点领域之一。HN/F蛋白是2种有效的疫苗候选分子,乳酸乳球菌、鼠伤寒沙门菌、单增李斯特菌、根癌农杆菌、鸡痘病毒、牛痘病毒、鸽痘病毒、禽红白血病病毒、禽副粘病毒3型、传染性法氏囊病病毒和传染性气管炎病毒等微生物经过改造后可成为理想的疫苗载体。本文综述了重组乳酸乳球菌(rLL-HN)、重组鼠伤寒沙门菌(rSt-F和rSt-HN)、重组单增李斯特菌(rLm-F)、重组根癌农杆菌(rAt-F)、重组鸡痘病毒(rFPV-HN、rFPV-F-gB和rFPV-F-HN-gB)、重组牛痘病毒(rVV-F)、重组鸽痘病毒(rPPV-F)、重组禽红白血病病毒(rAEV-HN)、重组禽副粘病毒3型(rAPMV-F)、重组传染性法氏囊病病毒(rIBDV-HN)和重组传染性气管炎病毒(rIBV-HN)等疫苗的构建及其免疫机制的研制现状。