力生长因子在大肠杆菌中的表达及活性分析

MGF(Mechano-growth factor)是一种IGF-1变体形式, 研究发现该因子具有应力敏感性, 并且具有促进肌肉肥大、再生以及神经损伤修复的功能。通过RT-PCR从拉伸刺激的人成骨细胞中克隆MGF cDNA序列, 并去除5'端9 bp的序列, 使N端缺少对肠激酶(Enterokinase, EK)具有抑制作用的脯氨酸, 将截短型MGF (des(1-3) MGF) cDNA序列克隆入pET32a(+)质粒, 构建重组表达质粒。重组质粒转化E. coli BL21(DE3), 在30oC培养下以可溶形式表达融合蛋白Trx/ des(1-3)MGF, 采用离子交换层析和Ni2+金属亲和层析, 获得纯度95%以上的融合蛋白。再对融合蛋白EK酶切, rpHPLC分离获得纯度达98%的des(1-3)MGF, SDS-PAGE电泳及质谱分析蛋白分子量与理论值相符。生物活性实验显示, 所制备的des(1-3)MGF比des(1-3)IGF-1更显著的促进MC3T3-E1细胞的增值和迁移。     

基于蛋白质结构预测的胰岛素样生长因子-1的制备及活性分析北大核心CSCD

为了更经济高效地制备胰岛素样生长因子-1 (insulin-like growth factor-1, IGF-1),本研究采用计算机模拟技术对3种IGF-1融合蛋白进行蛋白质结构预测与分子对接,筛选出酶切最适配的IGF-1融合蛋白表达形式。利用基因工程技术构建并鉴定了IGF-1融合蛋白原核表达载体,并转化大肠杆菌Origami B(DE3)菌株,获得重组子;经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达后,对菌体的破菌上清进行亲和层析、脱盐、凝血酶酶切及酶切产物亲和层析纯化得到目的蛋白;通过3T3细胞增殖法建立活性评价体系并对获得的IGF-1进行活性测定。结果显示,构建的IGF-1融合蛋白原核表达载体序列正确,获得的重组子在25℃、0.05 mmol/L IPTG诱导16 h时融合蛋白为可溶性表达,经初步纯化、凝血酶酶切、再次纯化后可获得纯度大于90%的IGF-1目的蛋白,在建立的活性评价体系下测得制备的IGF-1比活为2.47×10^(5)U/mg,与市售标准品接近。本研究建立了一条用于制备IGF-1的完整工艺路线,为IGF-1药物的研制及工业化生产奠定基础。     

IGF-1及IGF-1R在胃癌中的表达及意义

目的探讨胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)及胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor-1receptor,IGF-1R)在胃癌及癌旁胃黏膜组织中的表达及意义。方法采用免疫组化MaxVision两步法检测80例胃癌和50例癌旁胃黏膜组织中IGF-1及IGF-1R蛋白的表达,并分析两者与胃癌患者临床病理指标间的关系及其相关性。结果 IGF-1及IGF-1R蛋白在胃癌组织中表达阳性率分别为71.25%和75.00%,在癌旁胃黏膜组织中表达阳性率分别为30.00%和24.00%,差异有统计学意义(Z=-4.942,P0.001;Z=-5.688,P0.001)。IGF-1及IGF-1R蛋白的表达与胃癌的组织分化程度、有无淋巴结转移、浸润深度及临床分期相关(Z=-2.067、-2.837,P0.05;Z=-4.117、-3.579,P0.05;Z=-2.885、-2.836,P0.05;Z=-3.286、-3.313,P0.05)。相关性分析显示两者表达呈正相关。结论 IGF-1和IGF-1R蛋白在胃癌组织中呈高表达,两者可能在胃癌的发生、发展过程中具有协同及相互调节的作用。IGF-1和IGF-1R蛋白可能成为胃癌早期诊断、评估胃癌患者预后的重要指标。     

猪背最长肌中胰岛素样生长因子(IGFs)系统基因的发育表达模式

采用荧光定量PCR技术检测了长白猪和梅山猪的背最长肌组织中胰岛素样生长因子1和2(IGF-1和-2)、胰岛素样生长因子1受体和2受体(IGF-1R和-2R)、胰岛素样生长因子结合蛋白3和5(IGFBP-3和-5)基因mRNA丰度在初生(0月龄)、1、2、3、4和5月龄间的表达变化并分析品种间和不同月龄间基因表达的差异及其对肌肉生长发育的影响。结果表明: 两猪种出生后IGF-1 mRNA表达量均表现为逐渐上调, 而IGF-2则恰好相反, 表现为逐渐下调。这与IGF-2主要在胚胎期发挥作用, 而IGF-1则主要在动物个体出生后才发挥促进细胞增殖和个体发育功能的特点相符。IGFRs mRNA与IGFs mRNA 表达的发育性变化模式并不相似, 提示背最长肌组织中IGFRs mRNA 的表达可能没有受到组织局部产生的IGFs调节。长白猪的IGF-1R、IGF-2R 和IGFBP-3 mRNA表达量均在2月龄时达到最高峰, 提示2月龄可能是长白猪IGFs系统发挥作用最为明显的生长发育阶段。以上结果初步揭示猪生长发育过程中胰岛素样生长因子系统基因表达的发育性变化模式和品种差异, 为深入研究胰岛素样生长因子系统基因的相互调控机制提供了基础数据。     

胰岛素样生长因子-1对血管平滑肌细胞PI3K/PTEN信号通路的影响

目的:探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)促血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的细胞内信号转导机制.方法:体外培养的兔血管平滑肌细胞分3组处理,以细胞计数、噻唑盐比色法测定细胞增殖能力,以磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)特异性抑制剂渥漫青霉素(WT)孵育细胞间接反映PI3K作用.Western Blot定量磷酸酶PTEN表达水平,免疫沉淀、特异底物diC16PIP3绿色试剂法测定PTEN脂质磷酸酶活性.结果:IGF-1(100 μg/L)使细胞计数及MTT 比色A值分别增加至对照组的2.8倍和3.8倍,WT抑制VSMC增殖,并完全逆转IGF-1的作用(均P<0.01).各浓度IGF-1对PTEN蛋白表达水平无明显影响,其对PTEN活性的抑制呈浓度(10～100 μg/L)及时间(3 min～24 h)依赖性(均P<0.01).结论:IGF-1促VSMC增殖作用与活化PI3K蛋白激酶的促生长活性及抑制PTEN脂质磷酸酶的负性调节细胞生长作用有关.     

IGF-1R的表达与XELOX方案化疗治疗晚期胃癌的临床疗效的相关性分析

目的:探讨晚期胃癌患者中胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R)的表达与卡培他滨联合奥沙利铂(XELOX)方案化疗疗效的关系。方法:收集56例一线接受XELOX化疗的晚期胃癌患者的临床、病理资料,采用免疫组化法检测其IGF-1R的表达情况,计算客观有效率(ORR)和疾病控制率(DCR),统计分析IGF-1R的表达与胃癌患者临床病理特征、近期疗效、临床受益率及毒副反应发生情况的关系。结果:56例患者中,IGF-1R的阳性率为69.6%,其中未分化-低分化腺癌患者IGF-1R的阳性率显著高于中-高分化腺癌(76.5%vs.59.1%,P0.05)。56例患者的ORR为28.6%,DCR为55.3%。与IGF-1R(-)的胃癌患者相比,IGF-1R(+)的胃癌患者ORR、DCR及临床受益率均显著降低(ORR:23.1%vs.41.1%;DCR:48.7%vs.70.5%;临床受益率:51.3%vs.70.6%)(P0.05)。IGF-1R的表达与XELOX方案所致化疗毒副反应无显著相关性(P0.05)。结论:IGF-1R的表达可能成为预测胃癌化疗疗效及预后的新指标,IGF-1R(-)的胃癌患者可能更能从XELOX化疗方案中获益。     

大头金蝇酰基辅酶AΔ9去饱和酶cDNA克隆与原核表达

为深入研究大头金蝇Chrysomya megacephala (Fabricius)脂肪酸代谢关键功能基因酰基辅酶AΔ9去饱和酶(ACD9des),运用RT-PCR和RACE技术,获得其cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析。大头金蝇ACD9des基因cDNA (GenBank登录号为KF835695)全长1 429 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 146 bp,编码381个氨基酸,5'UTR长度为138 bp,3'UTR约为114 bp。ORF编码的蛋白质分子量为43. 47 kD,等电点9. 06,氨基酸序列与其他昆虫酰基辅酶A去饱和酶一致性高达66%-93%,且含有由7个酰基辅酶A去饱和酶蛋白家族特有的保守模式(motif)所构成的指纹(IPR015876)。大头金蝇ACD9des在进化上与葱蝇Delia antiqua最趋于一致。将ACD9des的ORF克隆到原核表达载体p ET-44a(+),并利用Rosetta (DE3)感受态细胞进行ACD9des原核表达。Western Blot分析表明,IPTG诱导表达的特异性蛋白可以与anti-His抗体特异性结合,大小与预期理论值(43. 47 kDa)相符,为ACD9des。该蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。最后利用含250 mM咪唑洗脱液和镍离子亲和层析柱对扩大培养获得的重组蛋白进行了纯化收集。本文的研究结果为大头金蝇功能基因的深入研究提供了坚实的基础。     

TGF-β1和IGF-1 mRNA在早期胚胎停育绒毛组织中的表达及意义

目的:通过检测胚胎停育患者绒毛组织中TGF-β1和IGF-1 mRNA的表达,探讨其在胚胎停育发病机制中的作用。方法:用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测正常人流(20例),胚胎停育(25例)绒毛组织中TGF-β1和IGF-1基因在转录水平的表达。结果:(1)与对照组相比,实验组绒毛组织中TGF-β1mRNA表达量降低(P0.05),(2)胚胎停育患者绒毛中IGF-1mRNA表达量升高(P0.05)。(3)绒毛组织中TGF-β1与IGF-1的表达呈负相关(r=-0.793,P0.05)。结论:TGF-β1、IGF-1的表达在基因转录水平发生改变,TGF-β1表达的降低可能上调了IGF-1的表达,提示两者可能共同参与了胚胎停育的发生。     

胰岛素样生长因子-1 受体(IGF-IR)在乳腺癌组织中的表达及其 临床意义初探

目的:检测分析胰岛素样生长因子-1受体(IGF-IR)在乳腺癌组织中的表达状况及其临床意义。方法:应用半运用半定量RT-PCR方法分析84例乳腺癌和癌旁正常乳腺组织中IGF-1R基因mRNA的表达水平,并分析其表达与患者临床病理特征及预后之间的关系。结果:乳腺癌组织中IGF-1R基因mRNA表达水平显著高于癌旁乳腺组织,二者具有统计学差别(P<0.001)。乳腺癌组织中IGF-1R基因mRNA表达水平与肿瘤组织分化程度及乳腺癌患者的TNM分期和淋巴结转移情况显著相关(P值分别是0.005,0.025和0.041)。另外,高表达IGF-1R的乳腺癌患者的五年总体生存率(38.3%)显著高于低表达IGF-1R的患者(49.7%;P=0.009)。多因素COX模型分析结果表明:IGF-1R基因mRNA表达水平是乳腺癌患者的一个独立预后分子(HR=2.78,95%CI:1.94-3.94,P=0.041)。结论:IGF-1R基因表达水平上调在乳腺癌发展过程中起着重要的作用。IGF-1R基因mRNA表达水平有望成为临床乳腺癌患者预后判断的一个重要分子标志物。     

人血管内皮生长因子功能域受体的筛选及其生物学活性研究

利用PCR技术,从人胎盘cDNA文库扩增出4个截短的人血管内皮生长因子受体(Flt-1)cDNA,分别含胞外第2,1-2,2-3,1-3个loop,应用酵母双杂交系统对Flt-1的最小配体结合域进行了研究,结果表明,不仅其胞外1-3loop能与hVEGF₁₆₅结合,比其更小的片段2-3loop也具有与配体结合的能力.进一步构建了重组表达质粒pPIC9K/Flt-1(1-3)和pPIC9K/Flt-1(2-3),转化Pichia pastoris酵母菌GS115,摇瓶培养,经1%甲醇诱导,表达的Flt-1以可溶性分子形式存在于上清中,诱导4 d的表达量占上清总蛋白质的60%以上.表达产物经CM-Sepharose FF阳离子交换层析和Sephacryl S-100分子筛层析纯化,纯度达90%以上.体外生物学活性检测表明,表达的可溶性Flt-1(2-3)具有与Flt-1(1-3)接近的结合hVEGF₁₆₅的能力和抑制hVEGF₁₆₅对HUVEC的促增殖功能.进一步的动物模型实验证实,可溶性Flt-1(2-3)具有显著的抑制hVEGF₁₆₅促进新生血管形成的功能.     

间歇低氧对大鼠骨骼肌IGF-1和myostatin基因表达的影响

目的:旨在探讨低氧对骨骼肌胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和肌肉生长抑制素(myostatin)表达的影响。方法:SD大鼠分为常氧对照组(C)、低氧暴露组(HO)、复氧1周组(H1)。于氧浓度13.6%的低氧舱内进行间歇性低氧暴露。采用RT-PCR方法测定腓肠肌myostatin mRNA和IGF-1 mRNA的表达。结果:与常氧对照组比,低氧暴露组骨骼肌IGF-1 mRNA表达显著下降,myostatin mRNA表达显著上升;与低氧暴露组比,复氧1周组骨骼肌IGF-1mRNA表达显著上升,myostatin mRNA表达显著下降。结论:低氧暴露后骨骼肌myostatin mRNA和IGF-1mRNA表达发生反向变化,提示二者可能以相反的作用共同参与低氧对肌肉生长的调控。     

D-氨基酸氧化酶与麦芽糖结合蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合表达

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是一种重要的工业酶。为了进一步提高DAAO在大肠杆菌中的可溶性和活性表达, 分别构建了麦芽糖结合蛋白(MBP)和透明颤菌血红蛋白与三角酵母DAAO (TvDAAO) 的N-端融合蛋白。其中, MBP融合蛋白MBP-TvDAAO在组成型(JM105/pMKC-DAAO)和诱导型菌株(JM105/pMKL-DAAO)中表达时, 目标蛋白的可溶性表达量分别达到全细胞蛋白表达量的28%以上和17%左右, 比无MBP融合的对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO分别提高3.7和1.8倍; 但其酶活水平显著下降。VHb融合蛋白VHb-TvDAAO在重组菌BL21(DE3)/pET-VDAAO中摇瓶诱导表达时, DAAO酶活达到了3.24 u/mL, 比对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO提高了约90%。     

D-氨基酸氧化酶与麦芽糖结合蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合表达

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是一种重要的工业酶。为了进一步提高DAAO在大肠杆菌中的可溶性和活性表达, 分别构建了麦芽糖结合蛋白(MBP)和透明颤菌血红蛋白与三角酵母DAAO (TvDAAO) 的N-端融合蛋白。其中, MBP融合蛋白MBP-TvDAAO在组成型(JM105/pMKC-DAAO)和诱导型菌株(JM105/pMKL-DAAO)中表达时, 目标蛋白的可溶性表达量分别达到全细胞蛋白表达量的28%以上和17%左右, 比无MBP融合的对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO分别提高3.7和1.8倍; 但其酶活水平显著下降。VHb融合蛋白VHb-TvDAAO在重组菌BL21(DE3)/pET-VDAAO中摇瓶诱导表达时, DAAO酶活达到了3.24 u/mL, 比对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO提高了约90%。     

胸腺素a1与复合a干扰素融合蛋白的表达及其生物学活性

实验旨在获得具有双重生物学活性的重组胸腺素a1(Thymosin alpha1, TM-a1)与复合a干扰素(IFNa-con)融合蛋白。选择大肠杆菌偏爱的密码子, 将合成的TM-a1与IFNa-con编码序列构成的融和基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-22b(+)、在宿主菌BL21(DE3)-Codon plus-RP-X中成功表达了可溶性融合蛋白(TM-a1-IFN-con)。表达量占总蛋白的20%以上。通过硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、分子筛层析后, 产品纯度达到96%以上。采用细胞病变抑制法测定融合蛋白的抗病毒活性, 采用细胞增殖实验检测融合蛋白对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。结果表明, 融合蛋白的抗病毒活性优于市售的IFNa1b和IFNa2a。对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响与市售的合成胸腺素a1相同。已有研究证实, 该融合蛋白具有良好的体外抗HBV作用, 其体外抗HBV活性比联合应用TM-a1和干扰素a强, 且细胞毒性明显低于联合应用TM-a1和干扰素a。以上结果表明, 通过大肠杆菌表达的可溶性融合蛋白(TM-a1- IFN-con), 既具有良好的干扰素a抗病毒作用, 也具有胸腺素a1促淋巴细胞增殖作用。     

不同蛋白质水平日粮对梅花鹿IGF-1和GH基因表达的影响

本试验旨在探讨不同蛋白质水平日粮对梅花鹿胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因和生长激素GH基因m RNA表达量的影响,为科学配置梅花鹿饲料及鹿茸生长提供理论基础。选取27头4岁梅花鹿公鹿为试验对象,随机分成3组,分别饲喂不同蛋白质水平的日粮(Ⅰ:20%,Ⅱ:24%,Ⅲ:28%)。采用SYBR Green Real-time PCR方法检测不同蛋白质水平日粮对梅花鹿鹿茸组织IGF-1基因和GH基因的表达情况。结果表明:不同蛋白质水平日粮显著影响鹿茸组织IGF-1和GH基因的表达风度,随着蛋白质水平的增加,IGF-1基因在鹿茸组织上的表达量降低,Ⅰ组鹿茸表达量最高,显著高于Ⅱ组、Ⅲ组(p0.05),GH基因在Ⅲ组鹿茸表达量最高,显著高于Ⅰ组、Ⅱ组(p0.05)。     

IL-6和IGF-1在非小细胞肺癌组织的表达与临床意义

目的检测白介素-6(interleukin-6,IL-6)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)在非小细胞肺癌组织和癌旁组织的表达,分析IL-6与IGF-1表达的相关性及其与临床病理特征的关系。方法随机选取150例非小细胞肺癌和100例癌旁良性组织标本,采用免疫组织化学检测组织中IL-6、IGF-1的表达及两者表达的相关性,并分析其表达与临床病理的关系。结果肺癌组IL-6、IGF-1阳性表达率84.00%、80.00%分别显著高于癌旁正常组织阳性表达率23.00%和28.00%。IL-6肿瘤组织阳性表达率在吸烟指数≥400的患者为90.91%,显著高于吸烟指数400者,IL-6在腺癌阳性表达率93.24%高于鳞癌77.63%。IGF-1肿瘤组织阳性表达率在低分化患者中显著高于中、高分化患者,III、IV期患者肿瘤组织IGF-1表达率显著高于I、II期患者。非小细胞肺癌组织中,IL-6阳性表达与IGF-1阳性表达之间呈正相关。结论 IL-6、IGF-1蛋白在非小细胞肺癌组织中明显高表达,IL-6高表达与更高的吸烟水平和腺癌组织类型相关,IGF-1高表达与更低的肿瘤分化程度和更晚的TNM分期有关,更重要的是,IL-6阳性表达与IGF-1阳性表达正相关,IL-6和IGF-1通路可能存在交叉作用,两者联合检测或抑制是潜在的诊断和治疗方向。     

B链N端缩短的胰岛素类似物研究——Ⅰ.去 B~(1-3)胰岛素类似物的制备

本文采用酸稳定性可逆氨基保护基—MSC对胰岛素氨基进行选择性保护后,相继经Edman降解和脱保护基,并对各步产物进行纯化,获得des B~1 INS;des B~(1-2) INS;des B~(1-3)INS 和des B~(1-3)B_4~(pyr)INS 四种B 链N 端缩短类似物。产物经醋酸纤维素薄膜电泳、氨基酸组成分析及末端分析鉴定证明是均一组份。     

大鼠心肌营养素-1基因在大肠杆菌中的表达与初步纯化

为了实现心肌营养素 - 1 ( CT- 1 )的高效与可溶性表达 ,将 CT- 1基因分别插入到 3种大肠杆菌表达载体 p BV2 2 0、p GEX- 2 T和 p Trx FUS中 ,并实现了表达 ,全菌表达水平分别为 2 .6%、1 6%和 2 5 %。其中 ,CT- 1在 p Trx FUS表达载体中以包含体和可溶性两种方式表达 ,表达水平分别为2 0 .8%和 1 0 .7%。可溶性表达部分经过强阴离子交换和凝胶过滤两步纯化 ,纯度达 80 %以上     

甲状旁腺素和胰岛素样生长因子促成骨样细胞ROS 17/2.8增殖分化中的协同作用

 间歇性小剂量地给予甲状旁腺素 (parathyroid hormone,PTH)可促进成骨 .胰岛素样生长因子 - I(insulin- like growth factor- I,IGF- I)由成骨细胞所产生并贮存于骨基质中 ,可促进成骨细胞的增殖分化 .为进一步了解向钙性激素和骨源性生长因子对骨生长的影响 ,利用成骨样细胞 ROS1 7/ 2 .8进行体外实验 ,观察了 PTH和 IGF- I这两种在骨生长和代谢中有重要作用的激素和因子相互作用的效果 ,并对其相互作用机制作出初步探讨 .结果显示 :联合使用 IGF- I及 PTH(间歇性给药 )时 ,(1 ) SRB(sodium rhodamine B,SRB)染色显示经 PTH(1 0 -9mol/ L,间歇给药 )和 IGF- I(1 0 -9mol/ L)联合处理的细胞 ,其数目明显增加 ,且明显高于单独处理组 ;(2 ) 3H- Td R参入增加 ,也明显高于单独处理组 ;(3)与增殖相关的原癌基因 (c- fos,c- jun,c- ki- ras)的表达增强 ,明显高于单独处理组 ;(4)骨钙素 (osteocalcin)基因 m RNA表达增强 ,明显高于单独处理组 ;(5) IGF- I(1 0 -8mol/L,1 0 -9mol/ L)可使 PTH受体基因 m RNA表达增强 .这些结果提示 PTH和 IGF- I在成骨样细胞ROS 1 7/ 2 .8增殖分化中具有协同作用 ,原癌基因的表达增强可能是其作用的一个环节 .此外 ,IGF- I可能通过增强 PTH受体表达 ,使细胞对 PTH的反应性增强     

骨骼畸形大鼠软骨细胞内胰岛素样生长因子-2的表达研究

目的 探讨胰岛素样生长因子-2(Insulin-like growth factor 2,IGF-2) 在骨骼畸形大鼠肢端软骨细胞内的表达规律.方法 应用光镜和透射电镜观测二(哑)英诱导的骨骼畸形大鼠足部软骨组织病理学改变.应用二(哑)英(1×10-8mol/L)干预体外培养的大鼠软骨细胞,采用RT-PCR及western 印迹杂交检测软骨细胞内的IGF-2 mRNA及蛋白质的表达水平.结果 15 μg/kg剂量的二(哑)英诱导实验组胎鼠出现多种畸形,内翻足、无尾畸形、腭裂等骨骼畸形发生率为33.3%.畸形胎鼠的肢端骨化中心发生带缩小,软骨细胞核内粗面内质网扩张,线粒体嵴紊乱.1×10-8mol/L剂量的二(哑)英使体外培养的大鼠软骨细胞内IGF-2 的mRNA及蛋白质的表达水平分别减少80%和60%(P＜0.05).结论 在二(哑)英诱导的骨骼畸形大鼠软骨细胞内IGF-2呈低表达状态.软骨细胞内IGF-2 的表达可能与骨骼发育密切相关.