集胞藻PCC6803中基因slr1761突变体的构建

PCR扩增了集胞藻PCC6803的slr1761基因,进一步以PGEM-T为载体将其克隆到大肠杆菌中,构建了P1761质粒。通过DNA体外重组,以卡那霉素抗性基因插入目的基因片段,构建了既含目的基因上游及下游序列、又携带选择性标记卡那霉素抗性的PK1761质粒。该质粒转化野生型集胞藻PCC6803细胞,利用同源重组原理获得了能在含卡那霉素的培养基上正常生长的基因敲除突变株。对该突变株基因组DNA进行PCR扩增,验证了其基因结构的正确性。     

集胞藻PCC6803 EGY同源基因破坏突变体的构建及表型分析

摘要：拟南芥中近来发现的定位于叶绿体的膜嵌合金属蛋白酶EGY1影响叶绿体发育与脂肪酸合成,经生物信息学分析,集胞藻PCC6803 (Synechocystis sp. PCC6803)中slr0643、sll0862基因编码同源蛋白。【目的】为了鉴定这两个基因的功能,【方法】本文通过同源重组插入卡那霉素抗性基因、切断目的基因,分别构建了slr0643::km和sll0862::km两种突变体,检测突变体的生理生化表型。【结果】在30℃,20 μE/m2s自养培养下,slr0643::km与野生型相比,早期     

集胞藻PCC6803 中relA/spoT 同源基因syn-rsh (slr1325)的鉴定

[目的]四磷酸或五磷酸鸟苷(Guanosine 3′,5′-bispyrophosphate,(p)ppGpp)是细菌在遭遇环境胁迫时细胞产生应激反应的信号分子,(p)ppGpp由其合成酶RelA或具有合成酶或水解酶双重催化功能的RelA/SpoT合成.本文证明了集胞藻PCC6803(Synechocystis sp.)中唯一编码RelA/SpoT同源蛋白(命名为Syn-RSH)的基因slr1325(syn-rsh)的功能.[方法]通过互补试验证明syn-rsh表达产物的生物学功能;以纤维素薄层层析检测不同条件下Escherichia coli(p)ppGpp合成缺陷突变株及集胞藻PCC6803细胞中的(p)ppGpp.[结果]诱导Syn-RSH表达可使(p)ppGpp合成酶和水解酶基因缺失的E.coli突变株回复野生型表型,并在细胞中积累一定水平的ppGpp;在实验室培养条件下,集胞藻PCC6803细胞中可检测到低水平的ppGpp,氨基酸饥饿可诱导ppGpp水平升高并维持在相应水平.[结论]Syn-RSH具有(p)ppGpp合成酶和水解酶的双重功能,(p)ppGpp是集胞藻PCC6803在实验室生长条件下细胞生长所必需的.     

敲除集胞藻PCC 6803中编码乳酸脱氢酶的slr1556基因对生物合成乙醇的影响

探究在集胞藻PCC 6803中引入外源乙醇合成基因并敲除集胞藻PCC 6803中编码乳酸脱氢酶的slr1556基因对生物合成乙醇的影响。在集胞藻PCC 6803中引入来源于运动型发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因（pdc）与大肠杆菌的NADPH依赖型醛还原酶基因（yqhD）光强启动子PrbcL的驱动下组合表达,生物合成乙醇。在此基础上进一步敲除集胞藻PCC 6803中编码乳酸脱氢酶的slr1556基因,以提高乙醇合成前体丙酮酸含量,促进乙醇的生产。结果显示敲除slr1556基因可以提高丙酮酸含量并显著增加乙醇的产量。竞争性丙酮酸转化乳酸代谢途径的阻断可以有效促进丙酮酸的累积,进而促进乙醇的生产。     

集胞藻PCC 6803中脂肪酸激活酶Slr1609互作蛋白的鉴定

集胞藻中slr1609是编码脂肪酸激活酶的基因,对与其相关的重要功能伴侣蛋白进行研究,可以完善对脂肪酸合成模块的认识,为进一步通过合成生物学技术改造蓝细菌提供理论支持。本研究在集胞藻PCC 6803中建立了蛋白质复合体分析及鉴定技术:利用氯霉素抗性基因筛选,构建带有3×FLAG标签的Slr1609突变株,通过RT-PCR优化重组蛋白表达条件;同时对突变株进行了Western blotting鉴定,以及利用Native-PAGE验证了蛋白质复合体的存在。最后,LC-MS/MS质谱鉴定获得了Slr1609蛋白复合体中的可能伴侣蛋白。     

ggpS基因过表达对集胞藻PCC 6803甘油葡萄糖苷和甘油合成的影响

为了研究甘油葡萄糖苷磷酸合成酶(GgpS)在集胞藻PCC 803甘油葡萄糖苷和甘油合成中的作用,本研究在前期获得高产甘油葡萄糖苷藻株的基础上分别过量表达来自于集胞藻PCC 6803自身和聚球藻PCC7002的甘油葡萄糖苷磷酸合成酶基因ggpS,并测定了在不同浓度NaCl胁迫时突变藻株的甘油葡萄糖苷和甘油积累量。结果发现获得的突变株甘油葡萄糖苷合成没有提高,但是甘油合成显著增强。此外,当培养基NaCl浓度从600 mmol/L提高到900 mmol/L时,集胞藻PCC 6803自身ggpS过表达藻株的甘油合成进一步提高75%。这些结果显示了GgpS在将碳代谢流导入集胞藻甘油合成途径中的作用。研究成果也为进一步通过基因工程改造提高集胞藻甘油葡萄糖苷和甘油合成效率奠定了基础。     

集胞藻ORFs侧翼序列的PCR扩增和定向基因插入失活策略

针对集胞藻PCC6803的1927个待定编码基因进行了两侧序列的PCR扩增。4个亚株基因组在sll0267-sll0269区域的PCR扩增产物与Kazusa DNA数据存在差异,以叶绿素合成基因chlH和chlL为例,显示三片段连接PCR产物可有效用于集胞藻6803基因组定向插入失活。     

集胞藻PCC6803高效基因表达平台的构建与评价

针对蓝细菌代谢工程改造的需求,成功构建了可以在模式蓝细菌菌株集胞藻PCC6803中高效表达外源基因的3个基因组整合表达平台,以及1个可以在多株蓝细菌中表达的广宿主穿梭表达平台。该表达平台通过选用集胞藻PCC6803中1,5-二磷酸核酮糖缩化酶/氧化酶的启动子驱动外源基因的表达,应用“SD-AUG”翻译融合的策略提高外源蛋白翻译效率,以及加入终止子序列Trbc以提高转录终止效率,实现了对外源基因的高效表达。利用lacZ作为报告基因,检测了所构建表达平台pFQ20在集胞藻中的基因表达效率,结果显示β-半乳糖苷酶的活性为109 Miller。同时,基于pFQ20表达平台在集胞藻PCC6803中表达了来自大肠杆菌的硫酯酶基因tesA’,蛋白印迹实验结果显示了硫酯酶的成功表达。该表达平台为在蓝细菌中开展遗传研究及基因工程改造提供了有用的遗传工具,其构建策略为在蓝细菌中构建高效稳定的外源基因表达元件提供了借鉴。     

集胞藻类金属硫蛋白的纯化、性质和溶液构象的研究

集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803光照培养,加入100 μmol/L ZnCl     

Slr1122影响Hik12磷酸化并参与调节Synechocystis sp.PCC 6803的色素合成

Synechocystis sp.PCC 6803是一种良好的研究光合作用的模式生物,其中slr1122编码一个250个氨基酸的未知蛋白。据报道Slr1122可能与杂合传感激酶（hybrid sensory kinase）Sll1672（Hik12）相互作用,本研究通过复合物实验证实了Slr1122与Sll1672确实存在相互作用。利用32P标记证明,在加入Slr1122后Hik12的磷酸化受到了明显的影响,推测其可能参与该双组分系统的调控。通过同源双交换,用卡那霉素抗性基因替换slr1122,将slr1122从Synechocystis sp.PCC 6803中敲除,构建了slr1122的缺失体Δslr1122。研究发现在Δslr1122中,编码PSⅡ中核心蛋白D1亚基的slr1181（psbAI）的转录水平明显降低,使PSⅡ光合作用受到影响,导致Δslr1122的生长速率低于野生型（WT）。同时slr1122的缺失使得蓝细菌对光的敏感性增强,在弱光条件下,Δslr1122对光能的利用效率高于WT,其生长速率也较WT高,但与此相反,Δslr1122对强光的耐受力及生长速率则不及WT。Δslr1122体内的藻胆蛋白含量与色素含量均降低,尤其是类胡萝卜素,RT-PCR的结果也显示合成类胡萝卜素过程中的5个关键酶转录水平均下降。这可能是Δslr1122对氧化胁迫变得敏感的原因之一。总之,Slr1122影响杂合传感激酶Hik12磷酸化并参与调节Synechocystis sp.PCC 6803的光合色素合成。     

集胞藻的随机插入诱变和光激活异养突变株的筛选

以4－碱基限制性内切酶部分酶切集胞藻PCC6803基因文库总质粒DNA,并插入卡那霉素抗性基因标记,构建了二级随机插入诱变文库。以该诱变文库总DNA转化集胞藻PCC6803,得到大量有抗性标记基因随机插入的转化子,利用这一方法获得了不能进行光激活异养生长的突变株,并克隆了抗性标记基因插入部位DNA片段,在持续光照但加DCMU抑制光合作用的情况下,这些突变株仍然能够利用葡萄糖异养生长,推测突变基因与短时光信号的感应有关。     

集胞藻PCC6803中S2P同源蛋白基因sll0862缺失突变株对热胁迫与氧化胁迫的响应

原核生物中S2P参与应答外界环境刺激,然而行光合作用的蓝细菌-集胞藻PCC6803的S2P同源蛋白功能未知。【目的】考察集胞藻PCC6803中S2P同源蛋白sll0862是否参与外界环境刺激的应答。【方法】监测在高温和氧化胁迫的条件下sll0862基因缺失突变株与野生株在生长速率或存活率上的差异,利用水样调制叶绿素荧光仪(water-PAM,脉冲-振幅-调制叶绿素荧光仪)测量在高温和氧化胁迫的条件下突变株与野生株叶绿素荧光参数的差异,来考察其光合作用差异。【结果】sll0862突变株与野生株在正常的培养环境中生长速率并无差异,但是将sll0862突变株与野生株在48℃加热处理半小时后,sll0862突变株的存活率明显低于野生株。当初始OD730值为0.1的藻液中添加终浓度为1 mmol/L双氧水的时候,sll0862突变株的生长速率比野生株明显低,而且氧化胁迫条件下突变株与野生株的调制叶绿素荧光有差异。【结论】集胞藻PCC6803中sll0862基因的缺失导致突变体对高温与氧化胁迫响应出现缺陷,提示有功能的sll0862参与响应热和氧化胁迫。研究结果为进一步阐述S2P同源蛋白sll0862在集胞藻PCC6803中的功能奠定基础。     

集胞藻6803光合自养生长突变株的筛选与鉴定

集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803(以下称集胞藻6803)是一种单细胞蓝藻,既可进行自养生长,也可在光合系统失活的情况下利用葡萄糖进行异养生长[1],具有天然的DNA转化系统,为筛选光合自养生长突变株和基因功能的鉴定提供了便利.其全基因组序列已于1996年公布[2].     

蓝细菌6803agp基因的分子克隆和缺失突变株的构建

PCR扩增了蓝细菌集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC6803)的agp基因（编码ADP－葡萄糖焦磷酸羧化酶）,进一步以pUC118为载体将其克隆到大肠杆菌中,构建了pUCA质粒。通过DNA体外重组,以红霉素抗性基因部分取代agp基因片段,构建了既含agp基因上游及下游序列、又携带选择性标记－红霉素抗性的pUCAE质粒。该质粒转化野生型集胞藻6803细胞,获得了能在含红霉素的培养基上正常生长的agp基因缺失突变株。对该突变株基因组DNA进行PCR扩增,验邝了其基因结构的正确性。突变株细胞生长速度较野生型细胞快,胞内的叶绿素含量比野生型细胞高,表明该突变株具有较高的光合效率。在突变株中未检测到糖原的存在,进一步从生理水平上验证了突变株构建的正确性。     

集胞藻PCC6803膜脂循环关键基因酶学性质和生理功能

集胞藻PCC6803野生型和其脂酰ACP合酶敲除突变株的自由脂肪酸含量和组成表明膜脂的重构和降解是细胞内自由脂肪酸的来源之一。在这一过程中脂肪酶起到关键性作用。通过基因组数据库检索,发现集胞藻PCC6803基因组中只有一个脂肪酶编码基因sll1969,但是还没有其功能相关的生化证据。为了确定该基因的功能及其在脂肪酸代谢途径中的作用,加深对集胞藻PCC6803脂肪酸代谢途径的了解,文中将sll1969基因在大肠杆菌中过表达和体外纯化,得到重组蛋白Sll1969,并对其酶学性质进行初步分析。在30℃条件下,测得Sll1969以对硝基苯丁酸酯作为底物时的Km和kcat值分别为(1.16±0.01)mmol/L和(332.8±10.0)/min;该脂肪酶的最适反应温度为55℃。通过比较分析sll1969突变株中脂肪酸含量和组成变化,发现sll1969的表达量与细胞自由脂肪酸的产量呈正相关,但Sll1969不是细胞中唯一的脂肪酶。     

集胞藻PCC6803铜离子诱导表达平台的构建

在集胞藻PCC6803中,基因敲除是研究基因功能的最直接有效的方法,但是对于某些生存必需的基因则无法通过这种方法获得突变株。为研究集胞藻PCC6803中此类基因的功能,在其基因组中构建了一个petE基因启动子（PpetE）控制的铜离子诱导表达的平台。将集胞藻PpetE装配在lacZ报告基因的上游,通过同源双交换整合到这种蓝藻的基因组中。通过调节培养基中铜离子的浓度发现,lacZ的表达能够人为控制。特别是当铜离子浓度在6－400nmoL／L范围时,LacZ活力随铜离子浓度增加呈S型增长关系。利用这个铜离子诱导表达平台,可以控制某些必需基因的表达：提供铜离子维持细胞生存;而撤去铜离子时则关闭基因的表达,可以观察其对生命活动的影响。     

集胞藻6803的混合培养——光照强度和葡萄糖的影响

利用摇瓶研究了混合营养条件下单细胞蓝藻集胞藻6803(Synechocystissp.PCC6803)的生长特性,以及葡萄糖和光照强度对集胞藻6803生长的影响。实验结果表明,在葡萄糖消耗完之前,集胞藻6803的混合营养型生长处于对数生长期,且葡萄糖浓度及光照强度都对集胞藻6803的混合营养型生长有显著影响:在初始葡萄糖浓度097～480g/L范围内,同一光照强度培养下藻细胞的比生长速率随葡萄糖浓度的增大而降低;而在光照强度15～55μE·m^-2·s^-1范围内,初始葡萄糖浓度相同条件下藻细胞的比生长速率及对葡萄糖的藻体得率都随光照强度的增强而增大,但当光照强度在55～96μE·m^-2·s^-1时,集胞藻6803混合培养的比生长速率基本不变,出现了光饱和现象。     

增强型绿色荧光蛋白在集胞藻6803中的表达

利用聚球藻7942热休克基因groESL的启动子和报告基因egfp,构建了表达载体pUC-Tegfp并转化集胞藻6803,并通过所制备抗体对转基因藻进行蛋白免疫印迹检测.结果发现,在转基因藻株T-egfp的细胞粗提液中含有能与eGFP抗体特异结合的蛋白质,表明外源增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)在集胞藻6803中成功表达.     

集胞藻PCC 6803蛋白SpPhaB和SpPhaE的原核表达及结晶条件筛选

【目的】克隆蓝藻集胞藻PCC 6803 SpPhaB和SpPhaE的编码基因并构建原核表达载体,优化培养条件以提高在大肠杆菌中可溶蛋白的表达量,筛选SpPhaB结晶条件,为PHB家族蛋白的结构与功能研究提供基础。【方法】克隆集胞藻PCC 6803 PHB合成途径的phaB、phaE基因,将phaB、phaE基因构建到表达载体pET28a中,优化IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,提高在大肠杆菌BL21(DE3)中SpPhaB和SpPhaE可溶蛋白的表达产量,经Ni柱亲和层析纯化分别获得His-SpPhaB和His-SpPhaE蛋白,进一步筛选SpPhaB结晶条件。【结果】构建了pET28a-SpPhaB和pET28a-SpPhaE表达载体;优化获得SpPhaB可溶蛋白的最佳表达条件为：诱导温度37 °C、转速220 r/min、IPTG浓度0.1 mmol/L、诱导时间7 h;SpPhaE的可溶性蛋白最佳表达条件为：诱导温度25 °C、转速220 r/min、IPTG浓度0.5 mmol/L、诱导时间7 h,并获得了SpPhaB的结晶条件。【结论】构建了具有高效表达可溶的集胞藻PCC 6803 SpPhaB和SpPhaE的原核表达系统,并筛选优化了SpPhaB的结晶条件,为研究SpPhaB蛋白的结构及功能奠定了基础。