番木瓜环斑病毒复制酶(亚基)基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

近二年报道,在TMV^⑴、PVX^⑵、PEBV^⑶和CMV^⑷等病毒中,利用病毒编码的复制酶(亚基)基因或相关cDNA片段转化烟草,工程植株获得绝对或极高的病毒抗性。大量研究认为：马铃薯Y病毒组的核内含体大分子量蛋白(Nib)是依赖于RNA的RNA复制酶(或核心亚基),Nlb与上述病毒的复制酶有广泛的同源保守区^⑸。因此,Nib基因的克隆,不但在植物抗病基因工程方面,而且在马铃薯Y病毒组基因组的复制研究方面．均有重要的意义。本文以马铃薯Y病毒组的重要成员番木瓜环斑病毒的华南强株系(PRSV—sM)为材料,克隆了PRSV的Nib基因,并完成其全序列测定和植物表达载体的构建,为探索马铃薯Y病毒组复制酶可能介导的抗病性打下了基础。     

番茄环纹斑点病毒与马铃薯Y病毒复合侵染烟草的细胞病理特征

在自然情况下, 番茄环纹斑点病毒(TZSV)和马铃薯Y病毒(PVY)通常复合侵染同一植株。该文首次报道了TZSV和PVY复合侵染烟草(Nicotiana sp.)植株的细胞病理特征, 并与单独侵染进行了比较分析。复合侵染的烟草植株细胞中, TZSV病毒颗粒明显增多, 并聚集于囊膜内形成包涵体, 与PVY的风轮状及片层状内含体和病毒颗粒聚集体交叉分布于细胞质(内含线粒体明显增多)中, 线粒体、叶绿体和细胞核结构较完整; 两种病毒的颗粒、包涵体和内含体数量均较单一侵染增多, 且对寄主亚细胞结构的破坏较单一侵染为轻, TZSV和PVY及其与寄主的互作可能存在协生作用。     

侵染扁豆的三叶草黄脉病毒的鉴定

1987年从泰安表现系统花叶的扁豆上分离到一个分离物B_2,汁液摩擦接种9科38种植物,它可侵染5科10种植物,在扁豆和昆诺藜上引起系统花叶,在苋色藜上引起局部枯斑。该分离物钝化温度为60—65℃,稀释限点为10~(-3)—10~(-4),体外存活期为3—5天。可由桃蚜传播;病毒粒体线条状,大小为700—760×12nm病叶细胞内有风轮状内含体,该分离物与三叶草黄脉病毒的抗血清有明显的-阳性反应。根据这些特性,该病毒属于马铃薯丫病毒组的三叶草黄脉病毒。     

卫星病毒和卫星RNA的分子结构及遗传工程

自60年代发现卫星病毒、70年代发现卫星RNA以来,已发现10个病毒组中的31种植物病毒含有卫星病毒或卫星RNA(统称卫星)。植物病毒卫星是指依赖于植物病毒进行复制的核酸分子,如核酸分子含有编码外壳蛋白的遗传信息,并能包裹成形态学和血清学与辅助病毒不同的颗粒,称卫星病毒;如本身没有编码外壳蛋白的遗传信息,而是装配于辅助病毒的外壳蛋白中,则称卫星RNA。     

马铃薯Y病毒外壳蛋白基因在转基因马铃薯中的表达

ＰＶＹ是马铃薯Ｙ病毒组的典型成员,主要感染马铃薯、番茄、辣椒和烟草等。近年来,利用植物基因工程手段获得了不少抗病毒转基因工程植物,为培育抗病毒作物新品种提供了新途径［１］。病毒外壳蛋白基因导入并使之在植物中表达可获得抗相应病毒的转基因植物,已在烟草、番茄、马铃薯、苜蓿、黄瓜和番木瓜等植物中获得成功［１～３］。本室已成功地对在我国流行的ＰＶＹＮ株系外壳蛋白基因进行了克隆及序列测定［４］,在此基础上,我们构建了植物表达中间载体,通过土壤农杆菌介导的叶盘法转化马铃薯,获得了大量转基因植株。分子检测证明…     

烟草NtWRKY40在植物应答病毒侵染过程中的作用

WRKY转录因子家族在植物的抗病、抗逆反应中具有重要功能。已有研究表明,烟草花叶病毒(TMV)的侵染显著地诱导烟草Nt WRKY的表达,有必要进一步探明该基因在植物应答病毒侵染过程中的作用。采用PCR的方法克隆获得Nt WRKY cDNA,生物信息学分析结果显示,该基因属于WRKYⅡa亚族成员,与绒毛状烟草NtoWRKY40高度同源,命名为NtWRKY40。以此建立了过表达该基因的转基因烟草,并以TMV为毒源进行了转基因烟草和野生烟草的侵染实验,以观察NtWRKY40在烟草应答病毒侵染过程中的作用。实验结果表明,野生烟草在TMV侵染后9 d,NtWRKY40的表达量显著升高,而NtWRKY40过表达转基因烟草在病毒侵染后,病毒相关基因的表达高于野生型对照,与染病程度成正相关,说明过表达NtWRKY40增加了植株对病毒的敏感性,该基因为负调控因子。此外,为探索应用人工miRNA的抗病毒技术,以烟草天然miR167前体为骨架、马铃薯Y病毒(PVY)外壳蛋白基因的一段反向互补序列为成熟序列,构建了amiR167-PVY植物表达载体并转化烟草,以抑制PVY。对amiRNA转基因植株进行抗病毒实验的结果显示,amiR167-PVY能够部分抑制病毒基因的表达,转基因植株具有一定的抗病毒能力。     

浸染豇豆的一种病毒分离物的鉴定

在合肥地区从豇豆带毒实生苗中分离到一株病毒分离物Cp—2.侵染豇豆表现为卷叶、花叶,并使叶片革质化.易经汁液摩擦接种.可经桃蚜、棉蚜、蚕豆好及豆蚜以非持久性方式传播.其寄主范围广泛,能侵染测试的7科20种植物中的11种。稀释限点为10~(-3)～10~(-4),钝化温度为60～65℃,体外存活期7～8天。纯化病毒悬液A260/280为1.523.病毒粒体为杆状,宽约18～20nm,多种长度,优势长度分别为58,98,150nm。在琼脂双扩散试验中不与烟草脆裂病毒(TRV)、豌豆早枯病毒(PEBV)苜蓿花叶病毒(ALMV)、烟草花叶病毒(TMV)的抗血清发生反应。病毒外壳蛋白为单一电泳组分.其分子量为34 800,氨基酸组成中缺精所酸和脯氨酸。根据上述特征,认为Cp—2分离物为一种不隶属于目前确认病毒组群的单一病毒,且在国内外尚未见类似的报道,故暂定名为豇豆蚜传碎裂病毒(Cowpea aphid-borne breakage virus,CABV)。     

芝麻花叶病的病毒病原鉴定

从患芝麻花叶病的病叶中提纯了一种线条状病毒颗粒,长700～800nm,宽13nm。经汁液摩擦接种可感染心叶烟、大豆,甜菜等9种植物,不感染西瓜,苋色藜、豇豆等。主要传毒介体是发生在芝麻田的桃蚜。病土、病种均不传病。该病毒与西瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒及马铃薯Y病毒的抗血清无反应。超薄切片中可见到风轮形和纸卷形的圆柱状内含体以及结晶状内含体。结晶状内含体分布在细胞质和叶绿体中,其它内含体均见于细胞质中。同时,细胞质中还可见到大量聚集的线状病毒颗粒。初步认为此病毒可能是马铃薯Y病毒群中的一个新成员,暂称为芝麻花叶病毒。国内外均未见报道。     

干扰素的功能表达机制——Ⅵ.2'-5'三腺苷酸对烟草花叶病毒增殖的抑制作用

2'-5'三腺苷酸是否能抑制植物病毒在植物组织中的繁殖,过去无人报告过。本文证实2'-5'三腺苷酸能抑制烟草花叶病毒对离体的枯斑三生烟(Nicotina tabacum cv. samsum NN)叶片的侵染和在离体的普通烟(Nicotina tabacum)叶片内的繁殖,说明在植物中也存在2'-5'寡腺苷酸的作用体系,为植物干扰素的作用机理研究提供了新的依据。     

干扰素的功能表达机制——Ⅵ.2’-5’三腺苷酸对烟草花叶病毒增殖的抑制作用

2′-5′三腺苷酸是否能抑制植物病毒在植物组织中的繁殖,过去无人报告过。本文证实2′-5′三腺苷酸能抑制烟草花叶病毒对离体的枯斑三生烟(Nicotina tabacum cv.samsum NN)叶片的侵染和在离体的普通烟(Nicotina tabacum)叶片内的繁殖,说明在植物中也存在2′-5′寡腺苷酸的作用体系,为植物干扰素的作用机理研究提供了新的依据。     

抗TMV和CMV双价转基因烟草纯合系进入大田试验

植物病毒病被称为作物生长和发育的“癌症”,常造成产量降低、品质下降乃至绝产。植物抗病毒病基因工程研究采用多种抗病毒策略。通过基因转移使植物产生较明显的抗病毒病的功能,在农业生产中具有可应用的良好前景。中国科学院微生物研究所、河南省农科院植物保护研究所。中国农科院烟草研究所的科研人员共同合作,针对国内烟区产生主要危害的烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)及上述两种病毒混合感染的问题,采用双价(TMV     

表达黄瓜花叶病毒卫星RNA的转基因烟草耐烟草花叶病毒

表达黄瓜花叶病毒(CMV)的卫星RNA的转基因烟草可以抗CMV的侵染.为了决定这些植物对其它病毒,如烟草花叶病毒(CMV)的安全性,我们对这些植物接种CMV.结果发现 卫星RNA可减弱TMV引起的症状,井降低病情指数,然而却对TMV在植物中的积累没有明显影响.这一发现有助于对卫星RNA抗病机制的理解,有助于含卫星RNA的生防制剂及表达病毒卫星RNA的转基因植物的应用.本文在国际上首次报道卫星RNA可减弱非相关病毒引起的症状.1 材料和方法1.1 病毒及植物烟草花叶病毒(TMV),烟草G140种子及枯班三生烟种子均为中国科学院微生物研究所病毒室保存;含黄瓜花叶病毒卫星RNA-R1基因的烟草G140(烟Sat-G140)为中国科学院微生物研究所病毒室培育,所用材料为第三代种子.     

表达黄瓜花叶病毒卫星RNA的转基因烟草耐烟草花叶病毒

表达黄瓜花叶病毒(CMV)的卫星RNA的转基因烟草可以抗CMV的侵染.为了决定这些植物对其它病毒,如烟草花叶病毒(CMV)的安全性,我们对这些植物接种CMV.结果发现 卫星RNA可减弱TMV引起的症状,井降低病情指数,然而却对TMV在植物中的积累没有明显影响.这一发现有助于对卫星RNA抗病机制的理解,有助于含卫星RNA的生防制剂及表达病毒卫星RNA的转基因植物的应用.本文在国际上首次报道卫星RNA可减弱非相关病毒引起的症状.1 材料和方法1.1 病毒及植物烟草花叶病毒(TMV),烟草G140种子及枯班三生烟种子均为中国科学院微生物研究所病毒室保存;含黄瓜花叶病毒卫星RNA-R1基因的烟草G140(烟Sat-G140)为中国科学院微生物研究所病毒室培育,所用材料为第三代种子.     

固相分子杂交技术在植物病毒鉴定和分类研究中的应用

在用斑点杂交试验对属于10个病毒组的44个不同病毒进行鉴定和分类研究中观察到,杂交现象不仅出现在同源病毒之间,也同样出现在相同病毒组或不同病毒组的异源病毒之间。定量的斑点杂交试验对仅有轻微血清学区别的病毒很敏感。在避免竞争和饱和现象对实验结果影响的情况下,检测了番茄丛矮病毒组五个病毒的RNA之间的同源性程度,结果表明,这五种病毒之间的同源性程度与Koenig和Gibbs所做的血清学结果相近。     

昆虫小RNA病毒研究进展

昆虫小RNA病毒依据基因组结构特点分为家蚕软化病毒组、蟋蟀痹病毒组和豌豆蚜病毒组。昆虫小RNA病毒蛋白质翻译具有独特性：不依赖于帽子结构,不需要启始因子eIF1、eIF1A和帽子结合蛋白eIF4E;而且蟋蟀痹病毒组和豌豆蚜病毒组结构蛋白翻译从内部核糖体进入位点独立启始,启始密码子是CUU。该文还简介了昆虫小RNA病毒复制机理及与其它动、植物小RNA病毒或类小RNA病毒的亲缘关系等的研究进展。     

马铃薯Y病毒属病毒的分子生物学研究进展

马铃薯Y病毒属（Potyvirus）是种类最多的一类植物病毒,现在国际病毒分类委员会（ICTV）承认的成员有168种。它们的病毒粒子都是弯曲线状的,长度在680-900nm,在植物细胞内可以形成圆柱形（风轮状）内含体或卷旋状内含体。基因组为正义单链RNA,翻译时先翻译成多聚蛋白（polyprotein）。本属病毒可由蚜虫传播。Riechmann等曾在1992年介绍过其基因组结构、基因组表达等方面的进展,本文主要介绍1992年以后的研究进展。1基因组结构与功能马铃薯Y病毒属的基因组为正单链RNA,约10,000个核着酸,5’．端具有病毒基因组连接蛋白（VPg）…     

侵染辣椒的烟草蚀纹病毒的鉴定

1990年在杨陵从表现花叶畸形的辣椒上分离到H90－2分离物。汁液磨擦接种6科17种植物,病毒可侵染2科8种植物,在白肋烟、三生烟上出现坏死蚀纹,在辣椒、心叶烟、曼陀罗上出现花叶畸形,在苋色藜上出现局部枯斑。该分离物的致死温度为50－55℃,稀释限点10^-3-3×10^-3,体外保毒期3－5天,桃蚜可传毒。病毒粒体为线状,稍弯曲,长720－750nm,宽13nm,与烟草蚀纹病毒的抗血清有明显的阳性反应。根据这些特性,经初步鉴定该病毒属于马铃薯Y病毒组的烟草蚀纹病毒（TEV）。     

芜菁花叶病毒粒体及寄主细胞内内含体的超薄切片电镜观察

从沈阳地区分离到侵染大白菜(Brassicapekinensis)及萝卜(Raphanussativus)的芜菁花叶病毒(TurnipMosaicVirus,TuMV)纯化繁殖于大白菜(小白口)及萝卜(长白品种)上。经约25天采收纯化繁殖的毒原材料,进行病毒粗提纯,并做病毒粒子的电镜观察。看到病毒粒体较为疏散清晰,丝状,长度多分布在720nm之间。另将接种TuMV的感病寄主有关部位,切成小块经固定、系列脱水、环氮树脂包埋后,制作超薄切片并用电镜观察,看到病叶、病茎和病根韧皮部细胞内,均有清晰的风轮状、环状及带状的内含体,这是马铃薯Y病毒组(Potyvirus)成员特征之一。     

病毒组研究：微生物组研究新热点

病毒组是指分布在各种环境中病毒的集合或病毒宏基因组的统称。病毒可以分布于水体、冰川、动植物甚至某些病毒当中,主要分为真核病毒、原核病毒和亚病毒。其在维持环境内稳态、生态系统平衡等方面起着非常重要的作用,并且与人类的健康密切相关。近年来,随着测序技术和数据分析水平的进步,人们能够采用宏基因组测序的方式研究病毒组并探究其在生态位中的潜在作用。人们在冰川、海洋、各种动植物中都得到了大量的病毒组数据,发现了众多未知病毒。人们研究病毒组主要是通过宏基因组数据挖掘和病毒样粒子 (Virus-like particles,VLPs) 分离富集测序两种方式进行分析处理。迄今为止,已存在多种不同的病毒组分离富集方法,并且针对病毒组的生物信息分析也数不胜数。然而,针对病毒组的富集和数据分析方法还缺少具体、完整的综述。文中将对病毒组的分离富集方法和数据分析进行整理与总结,并列举出部分采用病毒组分离富集方法进行的重要研究,旨在为相关人员提供参考,进一步促进病毒组研究领域的发展。     

感染大麦黄花叶病毒(BaYMV)的大麦细胞质内含体及细胞器病变的研究

超薄切片电镜观察表明,在感染大麦黄花叶病毒(BaYMV)的大麦(品种“早熟3号”)叶肉细胞中,液泡周围偶而可看到病毒颗粒束,在发病后期黄化或坏死的叶肉细胞中,可见到散布的病毒颗粒。在所有表现症状的病叶叶肉细胞,表皮细胞和木质部薄壁细胞中均可观察到风轮体、束状体、板状集结体以及膜状体等细胞质内含体,未见 卷简体和细胞核内含体。感病初期细胞中,细胞质丰富,核糖体数量增加,内质网肥大,随着病毒症状发喂,叶绿体、线粒体等细胞器逐渐肿大,外膜破裂直至解体。