高糖诱导腹膜间皮细胞发生上皮间质转化中microRNA的异常变化

目的:定腹膜间皮细胞在高糖引起上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程中microRNA的表达差异。方法:常规培养PMC细胞,利用高糖培养液刺激诱导腹膜间皮细胞发生EMT,倒置显微镜观察各组细胞形态学变化,实时定量PCR检测EMT标志基因变化,以此确定高糖诱导EMT的发生。利用特异茎环结构的引物合成microRNA的cDNA,实时定量PCR检测重要microRNA的表达变化。结果:高糖培养液培养腹膜间皮细胞48hr后,细胞形态呈梭形改变,同时EMT标记基因E-cadherin表达明显减低(P0.01),Vimentin表达显著升高(P0.01),说明高糖诱导腹膜间皮细胞发生了EMT。利用microRNA特异的茎环结构引物,实时定量PCR检测结果发现高糖刺激后miR-193a的表达明显上调(P0.01);miR-15a和let-7e的表达明显降低(P0.01);miR-16和miR-21的表达无明显变化(P0.05),同时检测发现高糖刺激后miR-193a的表达水平随刺激时间表达升高。结论:异常变化的microRNA可能对高糖诱导的腹膜间皮细胞EMT具有重要调控作用。     

MicroRNA-21介导非对称性二甲基精氨酸诱导的内皮细胞衰老

目的：观察非对称性二甲基精氨酸（ADMA）对内皮细胞中microRNA-21（miR-21）表达的影响,探讨microRNA-21在ADMA诱导的内皮细胞衰老中的作用。方法：人脐静脉内皮细胞（HUVEC）与10uM的ADMA孵育48小时后收集细胞提取总RNA及蛋白,荧光定量实时RT—PCR检测miR-21表达,Westernblot检测超氧化物歧化酶2（SOD2）表达,衰老相关半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色鉴定衰老的内皮细胞;然后HUVEC与miR-21抑制剂转染6小时后继续与10uM的ADMA孵育48小时留取细胞按上述方法检测相关指标。结果：HUVEC与ADMA孵育后miR-21表达量明显增加（P〈0．01）,同时衰老的内皮细胞数量增多（P〈0．05）,而SOD2表达减少（P〈0．01）;MiR-21抑制剂转染HUVEC后ADMA诱导的miR-21表达明显减少,同时衰老的内皮细胞减少,而SOD2表达明显增加（所有P〈0．01）。结论：ADMA诱导了HUVEC中miR-21表达及细胞衰老,miR-21介导了ADMA诱导的内皮细胞衰老作用,其机制可能与其抑制SOD2表达有关。     

高糖诱导内皮细胞损伤microRNA表达紊乱的体外研究

目的:研究高糖诱导的内皮细胞损伤微小RNA(microRNA,miRNA)的表达变化。方法:常规培养的人冠状动脉内皮细胞,利用不同浓度D-葡萄糖溶液(0 mmol/L、5 mmol/L、15 mmol/L和25 mmol/L),诱导刺激24 h后分别用CCK-8法和流式细胞术检测其生长活力和凋亡水平。收集细胞总RNA,利用实时定量PCR(Quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测miRNA的表达变化,同时利用TargetScan、PicTar等生物信息学预测软件预测可能的靶基因。结果:高糖溶液(25 mmol/L)刺激内皮细胞后,细胞生长活力明显降低,为对照组的67.5%(P0.01),凋亡水平为对照组的4.5倍(P0.01)。QRT-PCR结果显示miRNA的表达出现了明显的紊乱,其中miR-451、miR-504、miR-302d、miR-18b*、miR-198、miR-328和miR-517c明显下调,miR-29c、miR-100*、miR-137、miR-660和miR-217明显上调(P0.05)。靶基因预测发现miR-217和miR-451可能调控内皮细胞功能相关的多个基因的表达。结论:在高糖诱导的内皮细胞损伤中,miRNA表达紊乱提示其可能参与内皮细胞功能。     

miR-217参与高糖诱导的内皮细胞凋亡的调控

目的:研究miR-217对高糖诱导的内皮刺激内皮细胞凋亡的作用。方法:培养人冠状动脉内皮细胞,用含D-葡萄糖(30mmol/L)的培养液刺激:(1)利用实时定量PCR检测内皮细胞相关微小RNA(miR-217、miR-137、miR-29c、miR-218、miR-451、miR-328、miR-517c和miR-216a等)的表达变化;(2)利用慢病毒感染技术干预内皮细胞miR-217水平,利用流式细胞术检测细胞凋亡水平;(3)生物信息学预测、双荧光素酶报告基因验证以及蛋白免疫印迹法(western blot)确定miR-217的靶基因。结果:(1)实时定量PCR检测发现高糖刺激内皮细胞后,miR-217、miR-137、miR-29c、miR-218等的表达上调(P0.01),miR-451、miR-328、miR-517c和miR-216a的表达下调(P0.01),其中miR-217比对照细胞升高了5.67倍;(2)慢病毒感染内皮细胞后再经高糖刺激,流式细胞术检测发现过表达miR-217的内皮细胞凋亡水平有显著提高;(3)生物信息学分析发现SIRT1基因的3'非翻译区上存在一个miR-217的结合位点,双荧光素酶报告基因和western blot结果均证明SIRT1是miR-217的靶基因。结论:miR-217可能通过抑制SIRT1的表达参与高糖诱导的内皮细胞凋亡的调控。     

周期性张应力刺激下成肌细胞钙网蛋白的表达及变化

目的：检测成肌细胞钙网蛋白（CRT）在循环拉伸应力刺激下的表达变化。方法：体外构建面颌部成肌细胞力学刺激模型。加力组以0．5赫兹的加载频率和10％细胞拉伸变形幅度对细胞进行加力培养1h,6h,12h,24h,运用实时荧光定量PCR技术跟Westem Blot技术分别检测在周期性张应力作用下成肌细胞CRT在基因水平及蛋白水平的表达变化。结果：当对细胞加力6h后,CRTmRNA及蛋白表达量开始增多,加力12h后CRTmRNA及蛋白表达量到达最多（P〈0．01）,加力0h组与加力12h组之间差异有显著的统计学意义（P〈0．01）。结论：持续的周期性张应力刺激下CRTmRNA及蛋白表达增加。     

血浆microRNA在早期乳腺癌诊断中的价值

目的：探讨不同microRNA的表达及评估血浆microRNA作为早期乳腺癌诊断的新标志物的价值。方法：我们收集了49例早期乳腺癌的术前血浆作为实验样本和36例健康女性血浆作为对照样本。应用反转录和实时荧光定量聚合酶链反应,我们检测miR-21,miR-205,miR-222这三个候选基因的相对表达量并分析了这三个候选microRNA表达与临床病理特征的关系。结果：我们发现,与健康对照相比,miR-21（1．565,P=0．022）andmiR-222（2．258,P〈0．001）在乳腺癌病人血浆中的表达明显升高,而miR-205（0．591,P=0．001）在乳腺癌病人血浆中的表达明显下降。并且在临床病例资料数据的比较中,miR-21（P=0．0101）在乳腺癌病人中的表达水平与雌激素受体和孕激素受体相关。血浆中miR-222的表达水平在肿瘤不同分期中明显不同。结论：本实验证明miR一21,miR-205andmiR．222的表达水平与乳腺癌的病理特征明显相关,可以作为乳腺癌的潜在标志物。     

MicroRNA-141在上皮性卵巢癌患者组织和血清中的表达及临床意义的探讨

目的：探讨微小RNA-141（miR-141）在卵巢癌患者组织和血清中的表达情况并初步探讨其作为肿瘤标记物早期诊断上皮性卵巢癌的可行性。方法：采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real-timeRT—PCR）检测16例上皮性卵巢癌患者和4例正常人卵巢组织及血清标本中miR-141的表达;检测4例良性卵巢肿瘤血清中miR-141的表达。结果：miR-141在卵巢癌患者组织中相对表达量分别为（72．846±76．671）显著高于正常人（2．869±3．201）（P〈0．05）;miR-141在卵巢癌患者血清中相对表达量（31．581±52．885）显著高于良性卵巢肿瘤患者（0．668±1．196）和正常人（1．690±1．697）（P〈0．05）,后两组间表达无差异（P〉0．05）;miR-141表达随卵巢癌临床分期的进展呈上升趋势（P〈0．01）,在无淋巴结转移组明显高于有淋巴结转移组（P〈0．05）,与组织分级和CA125的升高无关（P〉0．05）。在组织中miR-141表达水平与上皮性卵巢癌临床病理特征均未见明显差异（P〉0．05）。结论：miR-141可能在上皮性卵巢癌的发生发展中发挥癌基因的作用;miR-141用于检测上皮性卵巢癌敏感性和特异度较高,有望成为上皮性卵巢癌早期诊断的新指标。     

含蛋白转导域的SARA/SBD融合蛋白对腹膜透析大鼠

目的：探讨含蛋白转导域的SARA融合蛋白（PTD-SAR／SBD）对腹膜透析大鼠腹膜纤维化的抑制作用。方法：每日腹腔注射4．25％葡萄糖腹膜透析液（PDF）制备腹膜透析大鼠模型。28只Sprague-Dawley大鼠随机分为正常对照组（n=8）;腹膜透析模型组（n=10）;PTD-SARA／SBD蛋白干预组（n=10）。4周后行腹膜平衡试验,检测超滤量、葡萄糖吸收率;留取壁层腹膜组织行HE染色;免疫组织化学方法检测大鼠壁层腹膜间皮细胞转分化指标E-cadherin和Twist的表达;Westemblotting测定E-cadherin、twist,以及CollagenⅠ、TGF-β1、P-Smad3、t-Smad3的表达。结果：①与正常对照组比较,模型组大鼠壁层腹膜增厚,糖转运率增加,超滤量降低（P〈0．01）;免疫组织化学与westernblotting检测结果显示E-cadherin表达下调,Twist表达上调;CollagenⅠ、P-Smad3、TGF-β1表达增加。②与模型组比较,PTD-SARA／SBD蛋白干预组大鼠壁层腹膜糖转运率降低,超滤量增加（P〈0．05）;E-cadherin表达上调,Twist表达下调;CollagenⅠ、TGF-β1、P-Smad3表达减少,各组t-Smad3无明显变化。结论：PTD-SARA／SBD融合蛋白通过抑制TGF-WSmads信号通路部分逆转腹膜间皮细胞转分化从而改善腹膜结构和功能,为防治腹膜透析所致腹膜纤维化奠定基础。     

肾小球系膜细胞中硫氧还蛋白1过表达对基质金属蛋白酶9表达的影响

为进一步探讨硫氧还蛋白1（thioredoxin1,Trx1）过表达对高糖环境下肾小球系膜细胞基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase9．MMP0）表达的影响．采用RT-PCR和明胶酶谱法检测细胞中MMP-9mRNA和酶活性的变化．用脂质体介导瞬时转染法转染正义Trx1及反义Trx1,观察高糖环境Trx1过表达对MMP9表达的影响．结果表明．HBZY-1高糖组与正常糖组比较,MMP9mRNA在12h,24h,48h时表达增加（P〈0．05）,同时酶活性于12h、24h、48h也明显增高（P〈0．01）．转染正义Trx1组细胞,MMP．9mRNA水平及MMP9酶活性,在高糖组与正常糖组差异无统计学意义（P〉0．05）;但转染反义Trx1组和未转染组细胞的MMP9 mRNA水平及酶活性．高糖组均比正常糖组表达增加,差异有统计学意义（P〈0．01）．提示Trx1过表达可抑制高糖环境诱导的肾小球系膜细胞MMP9高表达．     

miR-224在原发性肝癌患者血清中的表达及意义

目的：原发性肝癌（primary hepatocellular carcinoma,PHC）作为常见的恶性程度极高的肿瘤,严重威胁着人类的生命。miR-224是近年来发现的一个肿瘤相关miRNA分子,在肿瘤的发生及发展过程中发挥着重要的作用。本研究通过测定原发性肝癌患者血清中miR-224的表达水平,探讨血清miR．224与原发性肝癌预后的关系。方法：采用实时荧光定量RT-PCR（Real-timeRT．PCR）方法。分别检测40例原发性肝癌患者,20例慢性肝炎患者,20例慢性肝硬化患者及20例正常人的血清标本中miR-224的表达水平。分析血清miR-224的表达水平与AFP和MMP-9的相关性。结果：原发性肝癌患者血清miR-224的表达水平明显高于正常人、慢性肝炎和慢性肝硬化患者（P〈0．05）。皮尔森相关分析结果显示原发性肝癌患者血清miR-224的表达与AFP和MMP．9呈正相关。血清miR-224低表达组术后复发／转移率显著低于高表达组,术后生存率则高于高表达组（P〈0．01）。结论：miR-224在原发性肝癌患者的血清中呈高表达,其血清表达水平与原发性肝癌的临床预后密切相关。这提示我们,miR-224可能成为新的原发性肝癌检测标记物和潜在的原发性肝癌预后分子标志物。     

2种微小RNA实时定量PCR检测方法的比较

目的:对目前最常用的检测微小RNA(miRNA)的茎环实时定量PCR法和PAP实时定量PCR法进行比较。方法:分别用茎环实时定量PCR法和PAP实时定量PCR法检测人乳腺癌细胞MCF-7中U6和23种miRNA的表达,利用定量PCR分析软件和琼脂糖凝胶电泳方法,将2种方法在引物设计难度、特异性与灵敏度,以及检测通量方面进行比较。结果:茎环法的特异性和灵敏度比PAP法高,但引物设计难度大,检测通量低;PAP法引物设计难度较低,检测通量较高,但特异性和灵敏度较差。结论:茎环法实时定量PCR适于有针对性地检测小规模miRNA,而PAP法则适于大规模miRNA筛选实验。     

肿瘤干细胞标记物CD133与miR-429在大肠癌组织中的表达及其相关性研究

目的：检测CD133不同亚群大肠癌细胞HT-29的miR-429表达情况,探讨miR-429及CD133的表达与肿瘤的发生发展之间的关系。方法：采用荧光活化细胞分选法（FACS）分选出CD133不同亚群细胞,实时荧光定量PCR分别检测两组细胞miR-429的表达,合成miR-429寡核苷酸和阴性对照miRNA并分别转染CD133＋和CD133＋两个亚群细胞。再将细胞种植于非肥胖糖尿病／严重联合免疫缺陷（NOD／SCID）小鼠体内构建移植瘤模型,不同时间测量肿瘤体积和重量,RT—PCR及蛋白质印迹检测CD133＋和CD133＋两组肿瘤CD133mRNA和蛋白质表达。结果：血清检出CD133＋细胞为67．9％,miR-429的表达量是CD133＋细胞的（1．83±0．91）倍（P〈0．05）,CD133＋比例与miR-429表达呈负相关（r=0．591,P〈0．05）;miR-429＋／CD133＋组的移植瘤体积及重量与对照组比较有统计学差异（P〈0．05）,且miR-429＋/CD133＋组成瘤时间较对照组晚约2周,但miR-429＋/CD133＋组的移植瘤CD133表达量低,与阴性对照组比较无明显差异（P〉0．05）。结论：miR-429可能作为CD133的负性调控因子,具有抑制肿瘤生长的作用,但miR-429与CD133在肿瘤发生、发展过程中的作用机制有待进一步研究阐明。     

微小RNAmiR-21和miR-31在13腔鳞癌组织中的表达及意义

目的：检测口腔鳞癌中微小RNA miR-21和miR-31的表达,探讨其与肿瘤发展的关系。方法：应用实时荧光定量PCR的方法检测72例口腔鳞癌,38例正常口腔粘膜miR-21和miR-31的表达,统计学分析其表达与肿瘤临床分期和病理分型的关系。结果：①口腔鳞癌组织与对照组比较,微小RNA miR-21和miR-31的表达都有显著增高（P〈0.05）,其中miR-21的增高更为显著（P〈0.001）。②统计学分析表明,miR-21的表达在晚期鳞癌组织较早中期鳞癌组织增高更为显著（P〈0.01）,在低分化鳞癌组织较中、高分化鳞癌组织增高更为显著（p〈0.001）;MiR-31的表达水平在不同肿瘤临床分期和病理分型鳞癌组织中无明显差异（P〉0.05）。结论：miR-21和miR-31在口腔鳞癌发生发展过程中表达有明显增高,其中miR-21表达水平可作为潜在的口腔鳞癌临床分期分级和预后的指标。     

EGFR信号通路在SiO2诱导肺上皮细胞间质转化中的作用机制

目的：在二氧化硅（SiO2）刺激下可引起肺部一系列的炎症反应及其伴随相关的成纤维细胞增殖,然而EGFR信号通路可维持细胞增殖、分化和凋亡的平衡,因此,我们可以设想EGFR信号通路是否在肺纤维化的发生发展中起到重要的作用。本实验探讨SiO2是否能诱导人肺上皮细胞（A549）发生上皮间质转化,并且研究EGFR信号通路在矽肺纤维化中的作用机制。方法：以A549为研究对象,用0（对照组）、50、100、200μg／mlSiO2孵育A549,作用48h后于倒置显微镜观察细胞形态学改变,并收集不同时段细胞,采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测E-钙黏蛋白（E-cadherin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA表达变化,细胞免疫荧光方法检测E-cadllerin、α-SMA及信号转导蛋白EGFR表达的变化。结果：倒置显微镜观察A549经SiO2处理后细胞形态由鹅卵石状转变为纺锤型或梭型,形态似成纤维细胞,随着SiO2浓度的升高,E-cadmRNA和蛋白表达逐渐下调,在200μg／ml组表达最低,α-SMAmRNA和蛋白表达逐渐上调,200μg／ml组α-SMA表达最高;EGFR蛋白表达上调;50、100、200μg／ml与对照组的差异具有统计学学意义（P〈0．05）。结论：SiO2可诱导肺上皮细胞向间质细胞转化,其机制可能与EGFR信号通路有关。     

胶质瘤患者血浆miR-21的表达水平及意义

目的:研究脑胶质瘤患者血浆中miR-21的水平,并评价其作为临床诊断标志物的可能性。方法:收集临床确诊的胶质瘤患者和健康对照人群的血浆标本,常规方法提取血浆中RNA,采用茎环结构的引物将其逆转录成cDNA,实时定量PCR的方法分别检测miR-21在胶质瘤患者和健康对照人群中的水平,根据ROC分析评价miR-21作为诊断标志物的可能性。结果:分别收集了胶质瘤患者和健康对照人群血浆标本52例和43例,实时定量PCR结果显示,相对于健康对照人群,miR-21在胶质瘤患者血浆中呈高水平状态。ROC分析说明血浆miR-21水平作为诊断胶质瘤标志物具有较高的灵敏度和特异度。结论:血浆miR-21水平具有作为胶质瘤诊断的生物标志物的潜能。     

检测人老化胎盘组织中miR-182的表达

目的：通过检测miR-182在正常妊娠各期、老化胎盘组织中的表达,探讨miR-182在胎盘发育过程中的调控作用,并同时探讨miR-182与血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达的相关性,为寻找胎盘老化特别是胎盘提前老化发生机制提供依据。方法：采用实时荧光定量PCR方法检测42例标本（早孕绒毛和胎盘组织）中miR-182的表达情况。结果：miR-182在正常妊娠早孕绒毛组织、正常妊娠胎盘组织及老化胎盘组织中均表达。miR-182表达水平各个组间比较：早期与中期妊娠组、中期与晚期未足月妊娠组、晚期未足月与晚期足月妊娠组有显著差异（P〈0.05）;胎盘老化组与正常妊娠早期、中期、晚期未足月、晚期足月组有极显著差异（P〈0.01）;妊娠的早期、中期、晚期,miR-182的表达逐渐增多,老化胎盘组织中miR-182高水平表达。结论：miR-182与胎盘老化的发生高度相关,可能在胎盘老化机制中起重要的调控作用。