猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA, 克隆到pGEM-T载体, 构建重组质粒pGEM-T-IL18, 转化E.coli JM109感受态细胞, 取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明, pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp, 编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中, 构建重组质粒pGEX-IL18, 转化E.coli BL21感受态细胞, 用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白, 占菌体总蛋白的28%左右, 以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤, 用MTT法测定表明, 重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。     

2型猪链球菌磷酸甘油酸激酶基因的克隆表达及酶活性测定

目的:克隆表达2型猪链球菌中磷酸甘油酸激酶(PGK)并对其酶学特性进行测定。方法:采用PCR方法从05ZYH33基因组中扩增出pgk片段,构建重组表达质粒p ET28a:pgk,经双酶切及测序验证正确的质粒转化入E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,重组PGK蛋白经SDSPAGE和质谱鉴定并测定其酶学活性。结果:PGK在大肠杆菌中可溶性表达,纯化后得到约43k Da的重组PGK蛋白,其酶促反应最适温度为25℃,最适pH为7.5,2型猪链球菌PGK的酶活性为75U/ml,PGK相对于3-PGA的Km值为1.744mmol/L,Vmax为0.143mmol/(L·min),相对于ATP的Km值为2.266mmol/L,Vmax为0.318mmol/(L·min)。结论:利用原核表达系统成功地表达了2型猪链球菌中的PGK,并获得了活性较好的重组PGK,酶学检测发现纯化的PGK具有良好的体外活性,为进一步研究该病在2型猪链球菌致病及代谢机制奠定了基础。     

猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA, 克隆到pGEM-T载体, 构建重组质粒pGEM-T-IL18, 转化E.coli JM109感受态细胞, 取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明, pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp, 编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中, 构建重组质粒pGEX-IL18, 转化E.coli BL21感受态细胞, 用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白, 占菌体总蛋白的28%左右, 以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤, 用MTT法测定表明, 重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。     

布鲁氏菌L7/L12蛋白的基因克隆与原核表达

本研究对羊布鲁氏菌L7/L12蛋白进行了表达和纯化。首先从布鲁氏菌M5基因组中克隆L7/L12目的基因片段,连接至pMD-19T载体,转化入E.coli DH5α感受态细胞,PCR鉴定及测序鉴定正确后对其进行双酶切,构建重组质粒pGEX-6P-1-L7/L12并利用E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。羊布鲁氏菌L7/L12基因片段大小为375 bp。SDS-PAGE检测蛋白大小为13 kD,与预测值相符。Western blotting方法检测其免疫学特性。实验结果表明,成功构建了pGEX-6P-1-L7/L12原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了L7/L12重组蛋白,Western blotting法检测其具有免疫反应。本实验为下一步研究蛋白功能及布鲁氏菌新型疫苗的研制提供了实验基础。     

重组小鼠树突状细胞因子DCF1的原核表达和纯化

目的:克隆小鼠重组树突状细胞因子DCF1蛋白进行原核表达、纯化与鉴定.方法:采用PCR从小鼠脑cDNA克隆dcf1基因,构建DCF1原核表达重组质粒(pET30a-DCF1)并转化E.coli的BL21(DE3)菌株.IPTG诱导重组蛋白表达,并在变性条件下经Ni sepharose FF6亲和层析柱纯化,再通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定.结果:成功克隆到大小为972bp的小鼠源dcf1基因片段并准确插入表达载体pET30a,0.1 mmol/L IPTG诱导转化菌2h可表达大量的DCF1蛋白,并可经Ni Sepharose FF6柱亲和层析得到高度纯化.结论:成功获得纯化的42kDa重组小鼠DCF1蛋白,为后续进行DCF1蛋白功能研究奠定了基础.     

原核表达载体pET30a/ATRX-C_(2193-2492)的构建与诱导表达

[目的]构建大鼠ATRX抗原端氨基酸序列的原核表达载体,为进一步制备ATRX多克隆抗体以及探讨ATRX蛋白在HPV16致宫颈癌中的作用奠定基础。[方法]以IF-GFP-ATRX质粒为模板,PCR扩增获得ATRX-C_(2193-2492)基因片段,并克隆至p ET30a(+)空载体上,转化E.coli BL21感受态细胞,构建原核表达载体p ET30a/ATRX-C_(2193-2492),经PCR、双酶切以及测序鉴定。将构建好的质粒p ET30a/ATRX-C_(2193-2492)转化,经IPTG诱导表达,利用镍离子亲和层析法纯化6His-ATRX-C_(2193-2492)蛋白。[结果]成功获得900 bp的ATRX-C_(2193-2492)基因片段并构建了原核表达载体p ET30a/ATRX-C_(2193-2492),且该载体能在E.coli中诱导表达分子量约34 k Da蛋白产物。[结论]原核表达载体p ET30a/ATRX-C_(2193-2492)能成功诱导表达分子量约34 k Da的ATRX-C_(2193-2492)蛋白,该蛋白纯化产物能为后续ATRX多克隆抗体的制备提供实验基础。     

以重组P-gp为抗原建立检测MDR 1抗体间接ELISA方法的研究

目的:构建MDR 1基因原核表达质粒,表达P-gp重组蛋白,建立检测MDR1抗体的间接ELISA方法。方法:利用重组PCR技术扩增MDR 1基因的1kb片段,克隆至pET-28b（＋）中,构建原核表达质粒pETP-gp,转染感受态菌BL21（DE3）和BL21（DE3）plyss;以E.coli高效表达的P-gp基因主要抗原编码区重组蛋白为抗原,以HRP标记的兔抗人IgG为二抗,建立间接ELISA检测方法。结果:正确构建了pETP-gp原核表达质粒,并可在E.coli中高效表达,表达蛋白可用作检测MDR 1抗体ELISA抗原。结论:成功表达出重组蛋白P-gp,建立了检测MDR 1抗体的间接ELISA方法。     

人BMP4基因的克隆及其原核表达载体的构建

以成熟人胎盘组织为材料来源,克隆人BMP-4基因的全长cDNA,经过PCR扩增后与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-BMP4克隆质粒.酶切后回收小片段与表达载体pET-22b的多克隆酶切位点连接,构建原核表达载体pET22b-BMP4,酶切及测序鉴定重组子.重组质粒转化至感受态的Rosseta宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况.结果显示,从胎盘组织中成功地克隆到人BMP4基因,与NCBI中公布的序列100％相符合,原核表达载体pET22b-BMP4转化至Rosseta构建表达菌体,经IPTG诱导后电泳分析可见重组蛋白表达的条带.     

2型猪链球菌β-半乳糖苷酶基因的克隆表达及酶活性测定

目的:克隆表达2型猪链球菌β-半乳糖苷酶(BgaC)编码基因,并测定其酶活性。方法:根据05ZYH33基因组序列设计引物,PCR扩增bgaC基因,构建重组表达质粒pET28a-bgaC,转化E.coli BL21,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物通过SDS-PAGE鉴定;最后对表达产物进行亲和层析纯化,获得BgaC纯化蛋白后测定其酶活性。结果:bgaC基因在原核细胞中得到高效表达,重组表达的BgaC分子质量约为69kDa,其酶促反应最适温度为42℃,最佳反应时间为30min,最适反应pH为5.5,最佳底物浓度为10mmol/L。2型猪链球菌BgaC的体外酶活为1615U/ml,酶比活为1076U/mg。结论:2型猪链球菌强毒力株05ZYH33中含有bgaC基因,在原核系统高效表达的BgaC具有良好的酶学活性。     

康氏木霉内切葡聚糖酶(EGⅠ)基因的克隆及表达

目的：构建纤维素酶EGⅠ原核表达载体,并对表达产物进行初步酶学性质研究。方法：以康氏木霉的总RNA为模板,利用RT-PCR扩增内切葡聚糖酶EGⅠ,重组到T7启动子控制下的质粒pET.His中,构建重组质粒pET.His-EGⅠ,并将其转化至E.coli BL21（DE3）plysS感受态细胞中,经0.4mmol/L的IPTG诱导表达后对其表达产物进行13%SDS-PAGE分析。结果：SDS-PAGE电泳显示EGⅠ在大肠杆菌中得到了与预期目的蛋白相一致的外源蛋白带,分子量约45kDa。初步研究表明：重组蛋白具有内切葡聚糖酶活性,最适pH为6.0,温度在30℃～40℃时酶活稳定,金属离子Mn2＋对酶活力有明显的促进作用。结论：纤维素酶EGⅠ在大肠杆菌中成功表达,具有一定活性。     

重组酶Exo、Beta和Gam在大肠杆菌中的表达与纯化

目的:构建exo、beta和gam基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达、制备重组酶Exo、Beta和Gam。方法:将exo、beta和gam基因分别构建在原核表达载体pEGKG和pET28a上,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和DH5α,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中获得可溶性表达蛋白,用柱层析方法纯化蛋白。结果:构建了原核表达质粒pET28a-exo、pET28a-beta、pET28a-gam和pEGKG-exo、pEGKG-beta、pEGKG-gam;SDS-PAGE结果表明重组酶融合蛋白His-Exo、GST-Exo、His-Beta、GST-Beta、His-Gam、GST-Gam得到可溶性表达;用His标签抗体和GST标签抗体通过Western印迹方法检测到纯化后的融合蛋白。结论:在大肠杆菌中诱导表达了λ噬菌体重组酶,并纯化获得了一定量的纯度较好的蛋白,为下一步制备检测用多克隆抗体奠定了基础。     

何首乌中Ⅲ型聚酮合酶基因FmPKS2的原核表达及鉴定

目的：对传统中药何首乌中Ⅲ型聚酮合酶基因FmPKS2进行原核表达并鉴定重组蛋白酶活性,为研究该酶基因在何首乌有效成分代谢合成及其调控中的功能奠定基础。方法：根据何首乌FmPKS2（GenBank登录号：GQ984139）基因序列,通过PCR扩增其全长的编码区,克隆至原核表达载体PET-28a,构建重组质粒PET-FmPKS2,将其转化原核表达菌株E.coli BL21（DE3）,并用IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白可溶性,通过Ni-NTA亲和树脂纯化可溶性蛋白后以丙二酰-COA和香豆酰-COA为底物进行催化反应,TLC鉴定反应产物。结果：经过诱导,重组菌表达分子量为42KD左右的融合蛋白,其中可溶性重组蛋白最优表达条件为IPTG浓度0.5 mmol/L,诱导时间6h,温度25℃。纯化后的可溶性重组蛋白催化丙二酰-COA和香豆酰-COA得到的产物经TLC鉴定为二苯乙烯类化合物白藜芦醇。结论：成功实现FmPKS2的原核表达且融合蛋白以可溶形式存在,催化反应证明FmPKS2融合蛋白具有二苯乙烯合酶的活性。     

重组人半乳凝集素-1的原核表达、纯化及生物活性检测

目的:在大肠杆菌中表达半乳凝集素-1(galectin-1),并进行纯化及生物活性检测。方法:将人半乳凝集素-1基因克隆至带有His融合标签的原核表达载体pQE-30上,转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,表达产物经亲和层析纯化后,进行Western印迹鉴定,并用红细胞凝集试验检测其生物学活性。结果:双酶切鉴定和核苷酸序列测定表明重组表达质粒pQE-30-Galectin-1构建正确;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的50%,主要以可溶形式表达,纯化后蛋白纯度达95%以上,且具有良好的红细胞凝集活性。结论:在大肠杆菌中表达了重组人半乳凝集素-1,且具有良好的生物活性。     

钙激活酶激活蛋白基因的克隆及其在原核生物中表达及条件的优化

构建钙激活酶激活蛋白基因（UK114）的原核表达载体并优化其表达条件,为其高效表达提供试验依据。以UK114 cDNA为模板,通过PCR方法扩增钙激活酶激活蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中,酶切及测序鉴定重组体。将构建好的重组质粒转化大肠埃希菌BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达,在保持菌种不改变的前提下,分别改变IPTG的浓度、培养时间、菌体浓度、培养温度等来优化表达条件。结果显示,原核表达载体pGEX-4T-3-UK114成功构建,可在大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达,得到相对分子质量约40 kD的GST-UK114融合蛋白。在IPTG浓度为0.3 mmol/L,诱导温度为32℃,诱导时间为4 h,菌体密度OD600为0.6的条件下,目的蛋白表达量最高。试验成功构建原核表达载体pGEX-4T-3-UK114且获高效表达,为研究UK114生物学活性及产品开发提供了试验基础。     

人Hepassocin的原核可溶性表达与纯化

目的：构建人Hepassocin的原核表达载体,可溶性表达并纯化得到高纯度的重组人Hepassocino方法：将人Hepassocin基因克隆到原核表达载体pET40b（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,于28℃经0．1mmol／LIPTG诱导6h,表达Ds-bC-Hepassocin融合蛋白,经镍柱纯化可溶性融合蛋白,用肠激酶切除融合蛋白的DsbC-His标签,再用镍柱纯化分离酶切后的Hepassocin,通过超滤进一步纯化并浓缩,用Western blot验证纯化后的Hepassocin。结果：构建了pET40b-Hepassocin原核表达载体,经诱导表达、亲和层析和肠激酶切除融合标签,获得了相对分子质量约32000的可溶性高纯度蛋白,Western blot鉴定证实该蛋白为不含融合标签的重组人Hepassocin。结论：实现了人Hepassocin的原核可溶性表达,通过纯化获得了较高纯度的重组人Hepassocin,为制备其单克隆抗体,进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

重组蛋白ES-Kringle5的表达、纯化及活性检测

目的：利用基因工程方法原核表达重组融合蛋白ES-Kringle5并进行纯化及活性检测。方法：ES-Kringle5是将内皮抑素N端的前27个氨基酸与Kringle5通过连接肽相连的重组融合蛋白,合成该重组蛋白的基因片段并插入载体pMD18-T中,然后克隆至大肠杆菌表达载体pET25b中并转化E.coli BL21（DE3）。乳糖诱导表达后经Ni-NTA亲和层析纯化后获得目的蛋白。通过抑制HUVEC细胞增殖实验检测其生物学活性。结果：重组质粒构建正确。利用乳糖诱导表达并降低诱导温度能增加目的蛋白的产量及可溶性表达。纯化后的重组蛋白纯度大于95%。生物学活性证明该重组蛋白具有抑制HUVEC的增殖能力。结论：具有生物学活性的重组蛋白ES-Kringle5可在大肠杆菌中高效表达,为研究其体内药效、药代及安全性评价奠定了基础。     

APOBEC3G蛋白的原核表达及纯化

目的：原核表达重组APOBEC3G蛋白,为其功能及免疫原性研究奠定基础。方法：提取H9细胞全细胞基因组RNA,通过RT-PCR获得目的基因,经纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,并对表达条件和纯化条件进行优化;利用Western Blot分析鉴定目的蛋白。结果：构建了APOBEC3G蛋白的原核表达载体Apo-His-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以可溶性蛋白形式存在;经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化,获得了高纯度的重组APOBEC3G蛋白,蛋白浓度可达1．2mg／mL;Westem Blot显示获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化了可溶性APOBEC3G蛋白,为进一步对其进行免疫原性和功能研究奠定了基础。     

HIV-1 Vpu蛋白的原核表达、鉴定和纯化

目的：克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）Vpu蛋白,为其功能及免疫学研究奠定基础。方法：PCR扩增Vpu基因,纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,免疫印迹鉴定目的蛋白,亲和层析纯化蛋白。结果：构建了HIV-1Vpu蛋白的原核表达载体Vpu-pET32a,并在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白呈可溶性形式存在,免疫印迹检测显示为目的蛋白,经Ni—NTAAgarose纯化获得了高纯度的目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达了可溶性HIV-1Vpu蛋白,为进一步进行HIV-1Vpu蛋白的免疫原性和功能研究奠定了基础。     

分子伴侣共表达对嗜热环糊精葡萄糖基转移酶异源可溶性表达的影响

【目的】通过优化表达条件,提高嗜热环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的可溶性表达和胞外酶活性。【方法】构建含cgt基因的重组表达质粒p ET-28a(+)-omp A-cgt,筛选最适诱导温度,并构建5种分子伴侣共表达系统(p KJE8、p KJE7、p Gro7、p Tf16和p G-Tf2,5种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒p ET-28a(+)-omp A-cgt共表达),筛选最适分子伴侣质粒,优化共表达条件。【结果】通过SDS-PAGE分析和测定胞外酶活,CGTase基因在大肠杆菌中实现表达,且具有一定量的重组CGTase分泌至胞外;25°C诱导时CGTase的可溶性表达和在胞外上清中的酶活都最高;分子伴侣质粒p KJE8使酶的胞外活性提高了48.6%,效果最为显著;当L-阿拉伯糖浓度为0.5 g/L时,分子伴侣质粒p KJE8使酶的胞外活性提高了68.5%。【结论】通过优化表达条件及使用分子伴侣共表达系统提高了环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达和胞外酶活,为该酶进一步相关研究奠定了基础。     

PHD2基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

目的构建PHD2基因原核表达载体pET-43.1b（＋）-PHD2,实现Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达。方法用SacⅠ酶切pET-43.1b（＋）制备线性化载体,设计与线性化载体两端具有至少15个同源序列的特异性引物,以真核重组质粒pCMV6-Entry-EGLN1为模板,PCR法扩增PHD2目的基因。采用In-Fusion技术构建原核表达载体pET-43.1b（＋）-PHD2,并将其导入大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达。用SDS-PAGE和Western blot分析并鉴定表达出的融合蛋白。用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白。结果成功构建了PHD2原核表达载体;SDS-PAGE结果显示融合蛋白以可溶性形式表达;Western blot鉴定表明融合蛋白可以与PHD2单克隆抗体特异性结合。结论实现了Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达,为PHD2生物学功能的研究奠定了基础。