原代小鼠肝脏细胞的高效分离纯化与培养*

摘要目的：建立一种能稳定获得高活力和高纯度原代小鼠肝脏细胞的分离、纯化及培养方法。方法：应用改良的Seglen 二步法原 位灌注和机械离心分离肝脏细胞,并用改良的高糖DMEM培养基进行培养。台盼蓝拒染法检测接种时肝脏细胞的存活率,倒置 显微镜动态观察肝脏细胞形态变化,应用免疫荧光技术对肝脏细胞进行Albumin 染色。结果：每只小鼠可获取肝脏细胞的总产量 平均为1.35× 106 / g体重,肝脏细胞存活率＞ 90%。倒置显微镜下观察贴壁前肝细胞直径为35.14 滋m± 4.35 滋m,肝脏细胞在接种 后3 h基本完成贴壁;肝脏细胞接种后24h,所有肝脏细胞均强阳性表达成熟肝脏细胞标志物Albumin,肝细胞纯度＞ 95%。结 论：改良的分离纯化及培养方法能稳定获得高产量、高活率及高纯度的小鼠肝脏细胞。     

一种高效经济的小鼠胰岛细胞分离纯化新技术

目的:建立一种经济高效的小鼠胰岛细胞分离纯化方法,为进行NOD小鼠的胰岛移植提供实验条件.方法:将5-7周龄、体重20～25 g的雄,陛昆明小鼠的胆总管结扎,并逆行Hank's液和胶原酶P灌注和分离消化,依次加入84%、67%、50%浓度的Histopaque介质后进行不连续密度梯度离心纯化胰岛细胞.双硫腙(dithizon,DTZ)和台盼兰染色分别鉴定胰岛细胞.用含5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养液体外培养胰岛细胞,培养后的第3、5、7、9、11天取细胞上清检测胰岛素水平,并用16.7mmol/L的高浓度葡萄糖进行刺激,检测胰岛素水平确定胰岛细胞功能.结果:每个胰腺的胰岛细胞收获量在1200±124个,且纯度和活性均大于90%;体外培养9天内胰岛细胞基础胰岛素分泌水平无显著差异,至第11天时则明显减少(P＜0.05);应用16.7mmol/L葡萄糖刺激后,第5、7、9、11天的胰岛素分泌水平较第3天的明显减少(P＜0.05),然而在第7天、9天、11天时的胰岛素水平较第5天时显著降低.结论:胆总管逆行注射Hank's液和胶原酶P消化消化和不连续密度梯度Histopaque纯化的方法可以获得大量状态良好的胰岛,且胰岛细胞数量多,分泌状态良好.本分离方法是一种经济高效的胰岛细胞分离方法,同时离体后于5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养第3天胰岛细胞胰岛素储备功能最佳,为移植研究的最佳状态.     

正常人肝脏星形细胞的分离,培养及鉴定

参考Friedman等分离人肝脏星形细胞(HSC)的方法,采用校正密度的淋巴细胞分离液进行一步梯度离心,成功地分离得到了正常人HSC。HSC的收获量约为1×10~7个/10克肝脏组织,存活率在95％以上,纯度达85％以上。传代后纯度接近100％。对人HSC的标志物进行检测发现,结蛋白不宜作为鉴定初分离的及原代培养初期人HSC纯度的指标,而α-平滑肌肌动蛋白可作为鉴定激活的人HSC的可靠指标。     

一种高效、快捷、经济的小鼠胰岛细胞分离纯化方法

采用改良的胶原酶P胆总管内逆行灌注膨胀胰腺的分离方法,比较Ficoll-400不连续密度梯度离心法和人工挑取法两种纯化胰岛的方法,用双硫腙(DTZ)对胰岛细胞团进行特异性染色计算胰岛产量及纯度,用台盼蓝染色判定胰岛细胞活性,使用间接免疫荧光法检测体外培养7 d后胰岛的功能.采用人工挑取法平均每只小鼠可获取的胰岛细胞团(245±35.6个)明显高于密度梯度离心法(120±26.3个)(n=5,P<0.05),两种方法分离纯化的胰岛活力均大于98%;但人工挑取法获得胰岛细胞团的纯度(100%)要高于密度梯度离心法(90%);纯化胰岛所用时间,采用人工挑取法(22±4 min)也少于密度梯度离心法(31±3 min).间接免疫荧光染色检测体外培养7 d后的胰岛细胞团,两种方法分离纯化的胰岛细胞团均具有良好的功能.胶原酶P胆总管内灌注消化分离法联合人工挑取纯化胰岛细胞团的方法,是一种高效、快捷、经济的小鼠胰岛细胞团分离纯化方法.     

小鼠大脑皮质星形胶质细胞原代培养与鉴定

为探讨简便、高效的大脑皮质星形胶质细胞体外培养方法,本研究取新生24 h内的ICR小鼠大脑皮层,采用物理方法将其分成约1 mm^3,震荡过滤后进行培养。通过拍照的方式记录原代培养1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和原代培养14 d后再传代培养14 d(记为P2-14 d)细胞形态;通过实时定量PCR和Western blotting比较原代培养1周、2周、3周、4周、5周和原代培养2周后再传代培养2周(即P2-2)的星形胶质细胞内胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)基因和蛋白水平变化。选取GFAP、S100-β和谷氨酸转运蛋白(excitatory amino acid transporter 1,EAAT1)标记星形胶质细胞,微管相关蛋白(microtubuleassociated protein 2,MAP-2)、离子钙接头蛋白-1(ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba-1)和髓鞘相关糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)抗体分别标记神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞。通过免疫荧光染色鉴定细胞种类及纯度。研究结果显示细胞生长良好,原代培养4周星形胶质细胞内GFAP比2周、3周、5周和传代培养2周的细胞更加稳定。经免疫荧光鉴定,星形胶质细胞纯度在95%以上。本实验采用相对较简单经济的方法培养出高纯度且生理状态相对较稳定的原代星形胶质细胞,该细胞模型不仅可以用于星形胶质细胞生理功能研究,还可以用于中枢神经系统相关疾病的体外研究。     

小鼠主动脉血管平滑肌原代细胞的分离培养及鉴定

目的:血管平滑肌细胞在人类心血管疾病中具有重要的作用,而作为重要的遗传学研究模式生物的小鼠血管平滑肌材料有限,因此建立一种简单高效的小鼠血管平滑肌原代细胞分离培养方法很重要。方法:分离小鼠主动脉中膜层,胶原酶消化法获得原代平滑肌细胞,免疫荧光方法检测细胞的纯度和分化状态;分离平滑肌细胞特异的报告小鼠的平滑肌细胞,LacZ染色鉴定。结果:用该方法分离的原代平滑肌细胞生长迅速,3d后即可达5×106个。免疫荧光显示,细胞传至第3代后纯度在98%以上,细胞传至8代分化状态没有改变。LacZ染色鉴定报告小鼠分离的3代平滑肌细胞98%以上显示特异的蓝染。两种实验证明,应用此方法分离原代平滑肌细胞可以满足平滑肌体外功能实验的需求。结论:与传统的组织块培养法相比,该方法操作简便、经济,可以获得更多高纯度的血管平滑肌细胞。     

小鼠胚胎原代细胞制作方法的改进

室温下采用短时重复消化及双因子终止等步骤制作小鼠胚胎原代细胞．结果表明：该法制作简单可靠,细胞收获量大、接种成活率高、贴壁生长形态好。     

小鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养及鉴定

目的:建立分离培养小鼠原代主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的方法并检测其生长特性。方法:剥离小鼠主动脉中膜层,分别采用组织块培养法及胶原酶消化法分离培养小鼠主动脉来源的原代VSMC,免疫荧光法检测细胞的纯度和分化状态;3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法测定小鼠主动脉VSMC传代细胞的生长、增殖特性。结果:组织块培养法培养组织块8d后,细胞从组织块边缘爬出,18 d后细胞汇合度达到80%以上后传代;胶原酶消化法分离培养的细胞生长7 d后,汇合度可达80%,此时进行传代;2种方法获得的细胞进行免疫荧光染色,结果显示细胞传至第3代时纯度在95%以上,传至第8代时分化状态并没有改变;MTT法显示细胞生长3~5 d时处于指数生长期。结论:本研究建立了2种可靠稳定的分离和培养小鼠主动脉VSMC的方法,VSMC纯度高,多次传代后细胞特征稳定。     

家兔肾脏内髓集合管细胞的分离与原代培养

目的：为了分离,培养肾脏内髓集合管（ＬＭＣＤ）细胞。方法;本文采用胶原酶消化和低渗溶解等步骤分离家兔肾脏加ＩＭＣＤ细胞,分离ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基、３７℃,５％ＣＯ２的空气环境中培养;经透射电镜和角蛋白抗体免疫细胞化学等鉴定。结果：几乎所有的培养细胞均被染为棕黄色;电镜观察培养的细胞核大,呈菜成椭形。胞浆少,细胞器少见。细胞膜表面存在许多短而粗的微绒毛。与原ＩＭＣＤ细胞的形态和免疫细胞化学特征相符     

小鼠和兔原代乳腺上皮细胞的培养

目的：对小鼠和兔的原代乳腺上皮细胞进行培养。方法：取小鼠和免的乳腺组织,用加葡萄糖的PBS稀释胶原酶Ⅲ作消化液、分三个阶段进行消化,选择离心后的小细胞团,用含激素的培养液培养。结果：在基本培养液中添加10ng／ml的表皮生长因子和5μg／ml的胰岛素可以使乳腺上皮细胞富集．结论：成功地培养出了小鼠和免的原代乳腺上皮细胞。     

牛骨髓间充质干细胞的分离培养和初步鉴定

本试验采用全骨髓法和密度梯度离心法来分离纯化和体外培养牛骨髓间充质干细胞,并研究了不同培养基和血清对BMSCs的生长的影响以及对牛骨髓间充质干细胞的初步鉴定。结果表明,全骨髓法和密度梯度离心法均可获得纯化度较高的牛骨髓间充质干细胞,并且能够分化为脂肪样细胞,为利用MSCs作为种子细胞治疗多种疾病提供试验基础,同时可以利用骨髓间充质干细胞作为核供体进行核移植的研究和动物遗传资源的保存。     

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的建立一种从小鼠骨髓中分离培养间充质干细胞（MSCs）的高效方法。方法采取贴壁细胞分离法分离和纯化小鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）,检测mMSCs在不同诱导条件下向成骨细胞及脂肪细胞分化能力,用流式细胞术及显微镜分别检测mMSCs纯度和形态特征。结果mMSCs贴壁生长后形态较均一,细胞形态呈成纤维细胞样,流式细胞术检测：CD45、CD11b、CD44及CD29分别为（3.34）%、（2.41）%、（98.46）%及（99.36）%。第4代mMSCs经诱导后可向成骨细胞和脂肪细胞分化。结论通过贴壁培养可以从小鼠骨髓中分离培养出高纯度mMSCs,该方法效率高,稳定性好。     

建立同时分离培养小鼠肝细胞及肝星状细胞的技术

目的:建立一种简便、经济、高产的同步分离培养肝细胞以及肝星状细胞的方法。方法:在参照国内外方法的基础上加以改良,首先采用肝脏原位胶原酶灌注消化的方法,获得总细胞悬液,经多次低速离心分离肝细胞;再用Nycodenz作为分离介质,通过密度梯度离心法从非实质细胞中得到肝星状细胞。通过台盼蓝染色方法鉴定细胞的活力,用倒置相差显微镜、立体显微镜、CK-18、白蛋白免疫荧光细胞化学染色对培养的肝细胞形态以及功能进行检测。使用Desmin、α-SMA免疫荧光细胞化学对肝星状细胞进行鉴定。结果:成功的在体外同步分离、培养肝细胞及肝星状细胞,肝细胞产率为5-6×107/只小鼠,两只小鼠肝星状细胞产率达1×106个。细胞存活率及纯度均可达90%。肝细胞在培养24h后呈不规则铺路石样形态,此为典型的肝细胞形态,其标志分子CK-18以及白蛋白免疫荧光染色阳性。倒置相差显微镜下可见贴壁后的肝星状细胞呈典型的星形细胞形态,且其标志分子Desmin、α-SMA免疫荧光染色阳性。结论:改良的原位灌注以及分离方法可以同时分离并且培养具有高活性和功能的肝细胞和肝星状细胞。     

犊牛肝细胞的分离与原代培养

以初生犊牛作肝细胞供者,采用稍加改良的两步胶原酶灌流法和一步灌流结合组织块消化法分离获取肝细胞,并进行原代培养;以台盼蓝染色法测细胞活力,在倒置显微镜下观察肝细胞形态变化,采用Beckman全自动生化分析仪检测较好培养体系不同时间培养上清液中白蛋白、乳酸脱氢酶(LDH)、尿素的含量。结果显示,相比较于一步灌流结合组织块消化法,胶原酶消化法所获取的肝细胞形态完整、贴壁良好、活性高、功能强;LDH漏出量、白蛋白分泌及尿素合成等指标在1周内呈现规律性变化,第3和第4天时LDH漏出量最低,白蛋白分泌及尿素合成功能正常,表明所分离的肝细胞在培养第3￣4天功能最佳。     

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 10⁶ acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.     

木聚糖酶分离纯化技术

木聚糖酶应用广泛,其分离纯化是进行酶学性质研究、分子研究的前提条件,是成功确定氨基酸序列和三维结构的基础。综述微生物木聚糖酶分离纯化的方法,分析了常用方法在其分离纯化中的优缺点;强调了特异性分离纯化技术是高效的分离纯化方法;并对其它方法进行了概括。     

小鼠肝脏金属硫蛋白Metallothioneins的分离纯化与鉴定

由健康小鼠通过皮下注射一定量的氯化镉,取肝脏匀浆,离心,经SephadexG-50和DEAE-Sephadex A-50柱层析分离,即可获得MT-Ⅰ和MT-Ⅱ两种金属硫蛋白。经鉴定:两个分子各含18个巯基,结合4个Cd原子和3个Zn原子,无金属蛋白质Thionein的分子量约为6kD,半胱氨酸含量约占氨基酸总量的28％,所提取到的MT-Ⅰ和MT-Ⅱ经氨基酸组成,HPLC和PAGE分析皆证明为高度均一的,且与有关文献报道基本相符。其中MT-Ⅱ已获得晶体。