沉默Smad8基因对小鼠卵泡颗粒细胞增殖的影响

SMAD8(又称SMAD9)蛋白质是TGF-β/SMADs信号通路中重要的转录因子。该研究利用RNA干扰技术沉默Smad8基因,探讨该基因对小鼠卵泡颗粒细胞增殖的影响。免疫组化技术对SMAD8在小鼠卵泡的表达进行定位,设计并合成Smad8-si RNA转染小鼠颗粒细胞,荧光定量PCR(q PCR)和Western blot检测Smad8基因沉默效率,CCK-8法分析颗粒细胞增殖能力,ELISA检测细胞上清中雌二醇(E2)和孕酮(P4)浓度,q PCR检测颗粒细胞促卵泡素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)、促黄体素受体(luteinizing hormone receptor,LHR)以及与细胞增殖相关的细胞周期调控蛋白基因Cyclin D2和CDK4 m RNA水平。结果显示,SMAD8仅表达于卵泡的颗粒细胞,Smad8-si RNA有效抑制了Smad8的表达(P0.01),Smad8沉默后颗粒细胞的增殖能力明显减弱,细胞上清中E2水平显著下降,P4水平未受影响,颗粒细胞LHR、Cyclin D2和CDK4 m RNA水平明显降低,FSHR m RNA无明显变化。以上结果表明,沉默Smad8基因降低了小鼠颗粒细胞的增殖能力,其机制可能与沉默Smad8调低了颗粒细胞增殖分化相关的E2合成以及LHR、Cyclin D2和CDK4的表达下降有关。     

RNAi抑制Smad4基因表达对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响

Smad蛋白家族是TGF-β/Smad信号通路中的重要成员,其中Smad4在该信号转导途径中起着关键作用。本研究利用RNAi技术沉默Smad4基因,探讨其对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响。设计并合成靶向Smad4的小分子干扰RNA,在脂质体的介导下转染猪卵巢颗粒细胞,荧光定量PCR检测Smad4 mRNA的表达情况;MTT(四甲基偶氮唑盐)比色法分析检测细胞活性;TUNEL(原位末端核苷酸标记法)及Annexin-V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况;荧光定量PCR检测Bcl-2、Bax的mRNA表达水平。研究显示,Smad4-siRNA能有效抑制Smad4的mRNA表达(P0.01),细胞活性由0.31减少到0.27,凋亡率由17.0%增加到22.1%,Bcl-2的mRNA表达显著下调。结果说明沉默Smad4基因可以促进猪卵巢颗粒细胞的凋亡,其机制可能与调控Bcl-2表达有关。     

高原鼢鼠肝脏组织细胞周期相关基因的进化和表达

高原鼢鼠Myospalax baileyi是一种世居青藏高原的地下鼠,对严重的低氧环境有很强的适应性。低氧诱导细胞周期G1、G2期阻滞。为了探讨高原鼢鼠适应低氧环境的分子机制,应用生物信息学方法对p53下游细胞周期基因p21、CyclinD1、CyclinE、CDK6、CDK2、14-3-3-σ、Gadd45α、B99和CyclinB1的序列和编码的氨基酸序列进行了进化分析,并以SD大鼠Rattus norvegicus为对照,研究了这些基因在不同海拔(3300 m、2260 m)条件下的表达模式。结果表明:(1)高原鼢鼠细胞周期相关基因的序列与以色列鼹鼠Nannospalax galili同源性最高,达到90%以上;p21、CyclinD1、CyclinE和CyclinB1编码蛋白与以色列鼹鼠存在明显的趋同进化位点;SIFT评估发现,p21和CyclinB1氨基酸序列分别在第27号位点和第105号位点的变异对细胞周期调控功能有显著影响;(2)与低海拔条件相比,在高海拔条件下,高原鼢鼠肝脏组织中与G1期相关的基因p21表达水平显著上升,p21下游基因CyclinD1、CyclinE、CDK6和CDK2表达水平显著下降,而在SD大鼠中没有显著变化;与G2期相关的基因Gadd45α、B99、14-3-3-δ和CyclinB1在高原鼢鼠和SD大鼠中随海拔变化不发生明显变化。在不同海拔条件下,高原鼢鼠肝脏组织中的上述细胞周期相关基因的表达水平均极显著高于SD大鼠(P<0.01)。以上结果提示,高原鼢鼠经过长期的低氧适应,通过上调p21基因的表达抑制下游CyclinD1、CyclinE、CDK6和CDK2基因的表达,导致细胞周期G1期阻滞,从而提供充足的时间进行DNA修复,保证了DNA复制的准确性;同时高原鼢鼠肝脏组织中细胞周期的调控不仅与细胞周期基因的表达水平有关,而且可能与细胞周期因子p21的第27号位点和CyclinB1的第105号位点的变异有关。     

CDK4基因沉默对非小细胞肺癌A549 增殖和代谢的影响

目的:通过特异性小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA),使CDK4基因沉默,探讨该基因沉默对肺癌A549细胞增殖和代谢的影响及其可能的作用机制。方法:将靶向CDK4小干扰RNA(si RNA-CDK4)和阴性对照干扰片段(si RNA-control)成功转染A549细胞后,利用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法分别检测CDK4在m RNA和蛋白水平的变化;细胞计数法、CCK-8法和软琼脂糖克隆形成实验检测A549增殖的变化和克隆形成能力;FCM法检测A549细胞的细胞周期;18F-FDG摄取实验、乳酸检测试剂盒及海马技术检测A549细胞中葡萄糖、乳酸的量及氧耗的变化;利用RT-PCR检测CDK4基因沉默后A549细胞中糖代谢相关酶m RNA水平的变化。结果:将靶向CDK4小干扰RNA(si RNA-CDK4)转染A549细胞后,可明显抑制CDK4的m RNA和蛋白表达(P0.001,P0.01)。CDK4蛋白抑制后,细胞增殖在48、72和96 h均明显降低(P值均0.05),G1期细胞比例明显增多,S期细胞比例明显减少(P值均0.05);18F-FDG摄取量下降(42.21±1.90)%(P0.05),乳酸的生成量减少(29.39±5.35)%(P0.05),而细胞的基础耗氧量增加(67.17±3.58)%(P0.01);糖酵解相关酶PFKFB3、PKM2、LDHA在m RNA水平均明显减低(P0.001,P0.01,P0.001)。结论:抑制CDK4表达可明显降低糖酵解水平,并增加耗氧量;同时可引起细胞周期阻滞,抑制肿瘤细胞增殖。其机制可能与CDK4直接或间接调节糖酵解相关酶的表达有关。     

猪miR-331-3p过表达载体的构建及其对细胞增殖的影响

本研究旨在阐明猪miR-331-3p对细胞增殖的影响,探讨其对细胞增殖的作用机制首先构建了miR-331-3p的过表达载体pcDNA 3.1 (+)-miR-331-3p,并将将PK15细胞分为4组,分别为实验组、实验组对照组、抑制剂组和抑制剂对照组。实验组和对照组分别转染pcDNA 3.1(+)-miR-331-3p和pcDNA 3.1(+)。抑制剂组和抑制剂对照组分别转染miR-331-3p Inhibitor和miR-331-3p阴性对照(miR-331-3p NC)。通过在各组添加CCK-8试剂绘制细胞增殖曲线,并使用PI染色检测细胞所处周期比例。同时,利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测生长抑制蛋白家族成员5 (Inhibitor of growth family member 5,ING5)、细胞周期蛋白依赖性激酶2 (Cyclin dependent kinase 2,CDK2)、细胞周期蛋白依赖性激酶3 (Cyclin dependent kinase 3,CDK3)、细胞周期蛋白依赖性激酶4 (Cyclin dependent kinase 4,CDK4)、细胞周期蛋白B (Cyclin B)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(Cyclindependentkinaseinhibitor1A,CDKN1A)的表达变化。结果表明,实验组miR-331-3p表达量显著升高,细胞增殖曲线表明48 h和72 h时细胞数目均呈现出实验组实验对照组和抑制剂对照组抑制剂组的趋势(P0.05)。与实验对照组相比,实验组处于G0/G1期的细胞比例下调,S期和G2/M细胞的比例上调,抑制剂对照组趋势与之相反;同时,实验组中与促进增殖的基因CDK2、CDK3、CDK4和CyclinB的mRNA表达水平均显著升高,而抑制增殖的基因ING5和CDKN1A均表现出显著下降的趋势。本研究成功构建了miR-331-3p过表达载体,且发现miR-331-3p具有促进猪肾上皮细胞增殖的能力,研究结果为深入研究miR-331-3p在猪生长发育中的作用机制奠定了基础。     

靶向Smad4基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的:构建编码Smad4mRNA的shRNA真核表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法:根据GenBank提供的人Smad4基因的mRNA序列构建2个shRNA质粒表达栽体和1个阴性对照质粒表达载体,并通过基因测序进行鉴定.经鉴定后转染体外培养人成纤维细胞,western-blot检测Smad4蛋白水平抑制表达效果.结果:构建质粒表达载体测序结果显示,插入片段测序结果与合成的shRNA序列一致;靶向Smad4基因shRNA质粒表达栽体对所转染的人成纤维细胞中Smad4蛋白水平表达均有抑制作用,其中shRNA1最为明显.结论:成功构建了靶向Smad4基因shRNA质粒表达栽体,其中抑制Smad4基因表达效果最为明显的是shRNA1,为进一步研究Srnad4基因的RNA干扰奠定了基础.     

敲减VEGFR-1基因抑制乳腺癌细胞增殖的研究

目的:体外水平探讨利用化学修饰的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲减VEGFR-1基因治疗乳腺癌的可行性和特异性.方法:采用阳离子脂质Lipofectamine2000TM作为转染试剂将同时针对人和大鼠VEGFR-1基因的小干扰RNA转染人乳腺癌细胞系MCF-7和大鼠乳腺癌细胞系SHZ-88,敲减VEGFR-1基因的表达;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,半定量RT-PCR,蛋白印迹试验等检测VEGFR-1mRNA和蛋白表达及细胞增殖变化.结果:靶向VEGFR-1基因的siRNA转染细胞后,两种细胞增殖均被抑制,同浓度两细胞株指标无显著差异,VEGFR-1mRNA和蛋白的表达均明显降低.各对照组指标则无显著变化.结论:化学修饰的siRNA介导的RNAi能成功敲减VEGFR-1基因的表达、抑制乳腺癌细胞增殖.     

RNA干扰Ｃyclin D1基因表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和G1期调控的影响

为研究siRNA干扰瘢痕疙瘩成纤维细胞cyclin D1基因表达,对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、细胞周期和G1期调控的影响,构建了靶向cyclin D1的siRNA表达质粒.利用LipofecmmineTM2000转染体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞,应用荧光定量PCR、RT-PCR检测cyclin D1 mRNA的干扰效果,应用MTT法、流式细胞仪检测细胞增殖和细胞周期的变化,应用免疫组织化学染色检测成纤维细胞中cyclin D1、CDK4、P16、pRb蛋白表达的影响.主要结果如F:a.靶向cyclin D1的特异性siRNA序列可以高效地抑制成纤维细胞cyclin D1基因表达,对照组与实验组在mRNA水平其表达抑制率分别为63.68%和92.83%(P<0.01);b.可以显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖,改变细胞周期分布,G0/G1期细胞比例显著高于各对照组(P<0.05),细胞分裂被阻滞;c.免疫组化染色发现,转染72 h后,过表达的cyclin D1、CDK4和pRb蛋白,在瘢痕疙瘩成纤维细胞中均出现了不同程度的表达下调,而低表达的P16则呈上调表现.由上述结果可见,构建的靶向cyclin D1的RNAi表达质粒,可有效地抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞cyclin D1基因表达,通过改变Gl期相关周期蛋白的水平,影响G1/S期的进程,显著地抑制成纤维细胞的增殖.     

siRNA沉默SIRT1基因对宫颈癌细胞HeLa增殖和凋亡的影响

化学合成靶向SIRT1基因的小干扰RNA,脂质体法转染人宫颈癌细胞株HeLa,观察小干扰RNA沉默SIRT1基因对HeLa增殖及细胞凋亡的影响。在优化siRNA SIRT1转染条件的基础上,应用RT-PCR和Western blot分别检测各组SIRT1 mRNA、SIRT1蛋白及凋亡相关蛋白的表达;CCK-8法检测细胞增殖抑制率;Hoechst荧光染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果表明,siRNA SIRT1转染细胞组SIRT1 mRNA水平和蛋白表达量明显低于对照组;siRNA SIRT1转染组细胞增殖受抑制,细胞凋亡率明显增加;凋亡相关蛋白P53、P21表达上调,Survivin表达下调。上述结果表明:siRNA SIRT1诱导的HeLa细胞凋亡与P53、P21、Survivin通路关系密切,但siRNA SIRT1诱导HeLa细胞凋亡的详尽机制有待进一步研究。     

CircECH1通过充当miR-365-5p海绵抑制猪前体脂肪细胞增殖（英文）

环状RNA (circRNA)是一种共价封闭RNA,在脂肪发育过程中具有重要作用。本研究旨在探讨猪环状RNA ECH1 (circECH1)对前体脂肪细胞增殖的调控机制。本研究通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析、Sanger测序和RNase R酶消化法成功鉴定circECH1的稳定环状结构，其在马身猪各个组织中均有表达，并且其在脂肪组织中的表达量随日龄增加呈上升趋势。功能研究证明，干扰circECH1后，增殖相关基因PCNA、CDK1和MKi67极显著升高(P<0.01),增殖细胞数量极显著增加(P<0.01)。为进一步探究其分子机制，使用miRDB、miRWalk和RNAhybrid预测circECH1的下游靶基因。通过双荧光素酶报告基因分析和RNA结合蛋白免疫沉淀技术，验证circECH1能靶向结合miR-365-5p。在猪前体脂肪细胞中过表达miR-365-5p会增殖相关基因PCNA和CDK1的表达量极显著升高(P<0.01),增殖细胞数量极显著增加(P<0.01);干扰miR-365-5p后增殖相关基因PCNA、CDK1和MKi67的表达量极...     

葡萄糖6-磷酸脱氢酶调控细胞周期蛋白E1和细胞周期蛋白依赖性激酶2促进细胞增殖及其在肾透明细胞癌中的预后价值

肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是一种转移率高、预后差的细胞代谢性疾病,对其有效诊疗及预后分子标志物的研究十分重要。葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphatedehydrogenase, G6PD)在ccRCC中高表达,并提示患者不良预后,其促进ccRCC细胞增殖的分子机制有待进一步揭示。本研究发现,降低G6PD可抑制细胞周期G₁/S期转化并显著抑制ccRCC细胞增殖。G6PD可在细胞水平调控G₁/S期转化及增殖相关因子Cyclin D1,CDK4,CDK6,Cyclin E1和CDK2基因表达。TCGA数据库分析结果表明,ccRCC 中Cyclin D1,Cyclin E1 和 CDK2的mRNA 水平显著升高,而CDK4表达无明显差异,CDK6表达却显著降低。相关性分析结果显示,G6PD与Cyclin D1呈显著负相关(P<0.0001),G6PD与CDK4,CDK6之间无显著相关性(P>0.05),G6PD与Cyclin E1(P<0.0001)以及CDK2(P<0.05)显著正相关。进一步免疫组化检测结果表明,Cyclin E1和 CDK2在ccRCC肿瘤组织中表达显著升高。生存预后分析结果显示,Cyclin D1高表达提示ccRCC患者整体预后更为良好,CDK4和CDK6表达水平在ccRCC患者总生存率预测中无意义;而Cyclin E1和CDK2高表达均可提示ccRCC患者预后不良。进一步细胞水平检测发现,Cyclin E1、CDK2表达降低可显著逆转G6PD促进ccRCC细胞增殖的能力。综上,与增殖相关因子Cyclin D1,CDK4和CDK6相比,G6PD有可能通过促进Cyclin E1和CDK2表达升高而发挥促进 ccRCC肿瘤细胞增殖的作用,并且这3者的异常高表达有望成为ccRCC患者不良预后的独立生存预测因素。     

桦木酸对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响*

目的:利用不同浓度的桦木酸对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。方法:桦木酸设4个不同浓度(0、10、20、30 μg/ml),并采用常规化疗药物5-Fu处理作为阳性对照,以探究其对细胞增殖的影响。采用台盼蓝拒染法和吉姆萨染色法分别检测桦木酸对人胃癌SGC-7901细胞生长抑制率及克隆形成率;EdU法检测SGC-7901的细胞增殖;利用流式细胞术检测细胞周期, 应用qRT-PCR和Western blot分别检测细胞周期蛋白cyclin D1,cyclin B1的mRNA和蛋白表达水平。结果:不同浓度的桦木酸处理人胃癌SGC-7901细胞48 h后,其细胞生长抑制率显著升高(P＜0.05),克隆形成率和细胞增殖率均明显降低(P＜0.01),且呈剂量和时间依赖性;人胃癌SGC-7901细胞被阻滞在G1/G0期,细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1的mRNA和蛋白表达量也随桦木酸浓度升高而显著降低(P＜0.01)。且与5-Fu对照组相比,桦木酸浓度为20 μg/ml和30 μg/ml时,细胞增殖能力明显降低,细胞周期被抑制,细胞周期蛋白表达量均明显降低(P ＜0.05)。结论:桦木酸通过下调cyclin B1和cyclin D1基因表达,将人胃癌SGC-7901细胞阻滞在G1/G0期,从而抑制细胞增殖。     

Follicle stimulating hormone-induced DNA synthesis in the granulosa cells of hamster preantral follicles involves activation of cyclin-dependent kinase-4 rather than cyclin d2 synthesis

Although cyclin D2 mRNA synthesis precedes gonadotropin-induced DNA synthesis in quiescent granulosa cells in culture, it is unclear whether a similar mechanism exists for the granulosa cells of growing preantral follicles in cyclic animals. The objective was to evaluate whether the synthesis of cyclin D2 protein was a prerequisite for FSH-induced DNA synthesis in the granulosa cells of intact preantral follicles of cyclic hamsters. Preantral follicles from cyclic hamsters were cultured in the presence or absence of FSH, and cell cycle parameters were examined. FSH stimulated cyclin-dependent kinase (CDK)-4 activity by 2 h and DNA synthesis by 4 h without altering the levels of cyclin D2 in the granulosa cells. The FSH effect was mimicked by epidermal growth factor administered in vivo. Although FSH increased the levels of cyclin D2 mRNA, it also stimulated the degradation of cyclin D2 as well as p27(Kip1) and p19(INK4) proteins. FSH activation of CDK4 was mediated by cAMP and ERK-1/2. In contrast to granulosa cells in intact follicles, FSH or cAMP significantly increased cyclin D2 protein levels in cultured granulosa cells but failed to induce DNA synthesis. Collectively, these data suggest that granulosa cells of preantral follicles, which are destined to enter the S phase during the estrous cycle, contain necessary amounts of cyclin D2 and other G1 phase components. FSH stimulation results in the formation and activation of the cyclin D2/CDK4 complex leading to DNA synthesis. This mechanism may be necessary for rapid movement of follicles from preantral to antral stages during the short duration of the murine estrous cycle.     

Staurosporine-induced Growth Inhibition of Glioma Cells is Accompanied by Altered Expression of Cyclins, CDKs and CDK Inhibitors

Staurosporine was found to bring about complete growth inhibition of human glioma cell lines. U87 MG cells were arrested in S phase while U373 MG cells in G2/M phase on staurosporine treatment. Consistent with this observation, no change in G1 phase regulators viz., Cyclin D1, D3 and CDK4 was seen on staurosporine treatment. The levels of CDK2, CDC2, Cyclin A and Cyclin B proteins decreased, while the levels of CDK inhibitors viz., p21 and p27 were found to increase on staurosporine treatment. The mRNA levels of CDK2 and CDC2 genes were also found to decrease on staurosporine treatment. Thus apart from staurosporine’s known direct inhibitory effect on CDK2 and CDC2 activities, staurosporine was found to down-regulate activities of these two kinases by modulating the expression of the kinases themselves as well that of their activating partners (Cyclins) and their inhibitors.     

Benzo[a]pyrene-induced cell cycle progression is through ERKs/cyclin D1 pathway and requires the activation of JNKs and p38 mapk in human diploid lung fibroblasts

Treatment of cells with carcinogen Benzo[a]pyrene (B[a]P) allows cells to evade G1 arrest and induces cells abnormal proliferation. However, the mechanisms of its action at cellular level are not well understood. To address this question, normal human embryo lung diploid fibroblasts (HELF) were selected in the present study. We found that exposure of cells with 2.5 μM of B[a]P for 24 h resulted in a decrease of G1 population by 11.9% (P < 0.05) and a increase of S population by 17.2% (P < 0.05). Treatment of cells with B[a]P also caused dose-related activation of MAPK and induction of cyclin D1 protein expression, whereas the CDK4 protein levels were not significantly affected by B[a]P. Overexpression of cyclin D1 protein stimulated by B[a]P was significantly inhibited by 50 μM AG126 (an inhibitor of ERK1/2), but not by 25 μM SP600125 (an inhibitor of JNK1/2) or 5 μM SB203580 (an inhibitor of p38 mapk), suggesting that B[a]P-induced cyclin D1 expression was only regulated by ERK1/2 pathway. However, AG126, SP600125 or SB203580 led to cell cycle significantly arrested in G1 phase, indicating that ERK1/2, JNK1/2 and p38 mapk pathways are all required for B[a]P-induced G1/S transition. In addition, HELF cells transfecting with antisense cyclin D1 cDNA or antisense CDK4 cDNA showed significantly G1 arrest after B[a]P stimulation. These results suggested that B[a]P exposure accelerated the G1→S transition by activation of MAPK signaling pathways. Cyclin D1 and CDK4 are rate-limiting regulators of the G1→S transition and expression of cyclin D1 is predominantly regulated by ERK1/2 pathway in HELF cells.     

过表达Gpr3诱导猪颗粒细胞G1阻滞及凋亡

G蛋白偶联受体3（Gpr3）属于G蛋白偶联受体视紫质家族成员. Gpr3通过激活Gs蛋白介导的下游信号通路,维持卵泡卵母细胞减数分裂的前期阻滞,但在卵泡颗粒细胞中的作用不清. 为了明确Gpr3在猪卵泡颗粒细胞中的功能,构建了Gpr3基因的真核表达载体,利用过表达的方式激活其介导的信号通路,并利用MTT、流式细胞术和real-time PCR等方法检测了过表达Gpr3对猪卵泡颗粒细胞增殖及凋亡的影响. 结果显示,过表达Gpr3后,猪颗粒细胞的增殖水平显著下调,G0/G1期细胞的百分比增加,S期细胞减少,Cyclin B1和CDK1 mRNA的表达量也显著降低;同时,显著增加了颗粒细胞的凋亡率,在抑制Bcl-2表达的同时,促进了Bax的表达. 结果表明：过表达Gpr3在猪颗粒细胞中具有抑增殖促凋亡的作用,丰富了其在调节卵泡发育过程中的生物学功能.     

敲减NADPH氧化酶4能降低STAT3活性抑制人黑色素瘤A375细胞的增殖

NADPH氧化酶参与细胞活性氧族（ROS）的生成过程,而ROS与肿瘤细胞增殖密切相关. 为了阐明NADPH氧化酶影响黑色素瘤A375细胞增殖的分子机制,本文首先应用荧光定量PCR和Western 印迹证实NOX4为人黑色素瘤A375细胞的NADPH氧化酶功能核心亚基;随后根据NOX4基因设计3条干扰序列和对照序列并连接到pSuper-retro-puro载体,经鉴定后转化E.coli DH5α感受态细胞、筛选有效干扰序列并用于逆转录病毒包装,病毒液感染A375细胞并经嘌呤霉素筛选10 d,构建了NOX4缺陷的A375稳转细胞珠（A375 NOX4Δ）,其NOX4的mRNA和蛋白表达分别下降了66.02%和77.35%,伴随NADPH氧化酶活性和ROS水平分别下降了79.17%和64.16%;MTT、EdU法检测显示,A375-NOX4Δ细胞的增殖能力比A375-WT细胞明显降低、倍增时间延长,增殖细胞数量下降了68.27%（P＜0.01）,呈现G1→S期阻滞;Western blot检测表明A375 NOX4Δ细胞的 cyclin D1、CDK4分别下降了55.7%（P＜0.01）和64.8%（P＜0.01）,而P53、P21分别增加了6.89 倍（P＜0.01）和3.27 倍（P＜0.01）,STAT3、P-STAT3分别下降了51.80%（P＜0.05）和82.58%（P＜0.01）;电泳迁移率变动分析（EMSA）表明,A375 NOX4Δ细胞的STAT3-DNA结合活性明显降低. 上述结果提示,敲减A375细胞的NOX4表达可能通过减少ROS生成使得STAT3磷酸化水平及其结合DNA的活性下降,最终导致A375-NOX4Δ细胞增殖减少、呈现G1→S期阻滞,这为黑色素瘤发病机制研究提供了新思路及可能的药物作用靶点.     

G6PD通过细胞周期蛋白D1/D2调控人黑色素瘤细胞周期的进程

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)在人皮肤黑色素瘤A375细胞中处于高表达与高活性状态, 但G6PD在黑色素瘤发生发展过程中的作用及其具体机制尚不明确.本文在前期运用 siRNA方法构建G6PD敲减的黑色素瘤A375稳转细胞(A375-G6PDΔ)基础上,构建表达载体pBabe-puro-G6PDWT在A375-G6PDΔ细胞中过表达野生型的G6PD基因,从而构建G6PD表达恢复的稳转细胞(A375-G6PDΔ-G6PDWT).3株细胞A375-WT、A375-G6PDΔ和 A375-G6PDΔ-G6PDWT经G6PD酶活性测定、MTT测定、克隆形成实验、流式细胞仪分析细胞周期和Western 印迹检测.结果显示,A375-G6PDΔ-G6PDWT细胞的G6PD蛋白表达量 (0.847 ± 0.080)及其活性(0.394 ± 0.029)分别是A375-G6PDΔ的3.28倍(P＜0.01) 和7.34倍(P＜0.01),分别是A375-WT细胞的91-57%和2.12倍(P＜0.05).与A375-WT细 胞相比,A375-G6PDΔ细胞G0/G1期细胞数增加,S期细胞数减少,增殖指数PI降低了25-70%（P＜0.05）,细胞周期蛋白D1/D2、细胞周期蛋白E表达分别下降37.4%、54.3% (P＜0.01)和17.3%;而A375-G6PDΔ-G6PDWT细胞呈现G1/S期阻滞解除,细胞周期蛋白D1/D2蛋白分别恢复到A375-WT细胞的89.5%和87.6%,细胞周期蛋白E表达未见 恢复,呈现生长增殖和克隆形成率的恢复并接近于A375-WT细胞. 结果提示,G6PD通 过细胞周期蛋白D1/D2调控人皮肤黑色素瘤A375细胞G1期向S期转换的进程,这为黑色 素瘤发病机制的研究提供了新的思路.