大腹园蛛次壶腹腺丝的表达

基于大腹园蛛次壶腹腺丝Minor Ampullate Spidroin全长编码基因最新报道,研究了该基因的表达。利用PCR扩增该基因重复区一段长1 348 bp的片段P1,融合his-tag标签,构建酵母表达载体,在毕赤酵母菌GS115进行表达。同时构建大肠杆菌表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,P1在两种表达系统中均可实现表达。研究结果显示:P1在GS115中的表达经优化后产量、产率有较大提高,且远高于BL21(DE3)中的表达,相应的纯化效率GS115也远高于对照BL21(DE3)的表达。研究表明酵母表达系统更适合重复度高、且富含Gly/Ala的天然蛛丝蛋白基因的表达,为表达全长天然MiSp编码序列提供前期实验基础,也为大规模蛛丝蛋白的重组表达建立了平台。     

盐离子对次壶腹腺丝蛋白重组模块的影响

为研究不同生理环境对蛛丝蛋白组装及成丝的影响,首次以MiSp序列为对象,研究其NTR1SR2CT重组模块在不同种类(浓度)盐离子条件下的聚集和成纤维特性及其在成纤维过程中二级结构的变化。基于大腹园蛛MiSp全长序列构建NTR1SR2CT模块,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21中成功表达。借助8 mol/L尿素裂解包涵体进行变性纯化得到NTR1SR2CT重组蛋白。NTR1SR2CT重组蛋白二级结构主要为无规则卷曲(Random coil)或α螺旋(Helix),在自然成丝及冻干过程中部分random coil或helix转变为β折叠(β-sheet),甲醇能促进该转变过程。另外,钾离子和磷酸根离子有利于NTR1SR2CT重组蛋白聚集从而促进丝纤维的形成。研究结果为成丝机理研究奠定了基础,同时也为工业化生产高品质的蛛丝纤维提供了条件。     

Mx基因稀有密码子和mRNA结构及大肠杆菌表达 优化

通过对稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构的分析, 构建了4种重组表达菌株BL21(DE3)/pET-Mx, Rosseta(DE3)/pET-Mx, BL21(DE3)/pGEX-Mx和Rosseta(DE3)/pGEX-Mx, 在大肠杆菌中进行Mx基因的表达, Rosseta(DE3)/pET-Mx和Rosseta(DE3)/pGEX-Mx重组表达菌中都获得了表达, Western blotting检测到了特异的75 kDa表达产物。实验结果证明稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构对Mx 蛋白表达都有影响, 选择适用于稀有密码子表达的菌株Rosetta(DE3)有利于Mx蛋白的表达, 同时翻译起始区二级结构能值较低的表达载体pGEX-Mx获得的表达量明显增高。实验中首次获得了重组表达鸡全长Mx蛋白的大肠杆菌重组菌。     

A型肉毒毒素轻链的原核表达、纯化及活性鉴定

目的:在大肠杆菌中表达、纯化A型肉毒毒素轻链(Bo NT/A LC),研究其生物学活性。方法:根据Gen Bank中报道的Bo NT/A LC基因序列设计特异引物,从肉毒梭菌中扩增Bo NT/A LC基因片段,构建重组大肠杆菌p ET-32a Bo NT/A LC/BL21(DE3)Rosetta,IPTG诱导目的蛋白高效表达,表达产物经Ni螯合亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定目的蛋白,并利用相应底物对纯化产物进行生物活性分析和酶活动力学测定。结果与结论:构建了重组大肠杆菌p ET-32a Bo NT/A LC/BL21(DE3)Rosetta,原核表达获得高水平可溶性重组Bo NT/A LC,纯化得到纯度较高的蛋白质,重组Bo NT/A LC的酶活略高于A型肉毒毒素全毒素,可作为试剂用于Bo NT/A LC抑制剂高通量体外检测方法研究。     

乳糖诱导高分子量重组蛛丝蛋白发酵培养基优化

在M9培养基的基础上,以乳糖为诱导剂,对基因重组蛛丝蛋白工程菌pNSR32/BL21(DE3)的发酵培养基进行了优化。利用单因子实验和正交试验优化出表达高分子量重组蛛丝蛋白的最优培养基配方,结果表明：优化的碳源为0.3%的甘油,氮源为3%的酵母膏、0.75％的蛋白胨和0.05％(NH4)2SO4及少量的无机盐。优化培养基有利于菌体的生长和目的蛋白的表达,表达重组蛛丝蛋白达总蛋白量的20%。     

在大肠杆菌中表达有活性的人STK11蛋白

STK11蛋白(serine/threonine kinase11)是近年来发现的具有多种重要功能的蛋白,可参与调控细胞周期、p53介导的细胞凋亡、ras诱导的细胞转化、细胞极化等多种生物学过程。利用大肠杆菌高效表达有活性的人STK11蛋白,可为其结构和功能的深入研究打下良好基础。利用本室克隆的人STK11 cDNA和原核表达载体pET-44a( )构建带有Nus融合标签的诱导型表达载体pET-Nus-STK11,在不同的大肠杆菌宿主中诱导表达。SDS-PAGE和Western blot检测表明,在BL21(DE3)宿主中表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的8.9%;在Rosetta-gami(DE3)pLysS宿主中主要表达为可溶性蛋白,占菌体总蛋白的16.7%。而经纯化和包涵体蛋白复性处理后,以Chariot介导重组融合蛋白进入人肝癌细胞SMMC-7721检测其对细胞生长和细胞周期的影响。与对照组相比,BL21(DE3)中表达的Nus-STK11蛋白几乎无抑制活性;而Rosetta-gami(DE3)pLysS中表达的Nus-STK11蛋白可以显著抑制SMMC-7721细胞的生长,抑制率达47.05%,并导致细胞周期的G0/G1期阻滞,证实表达的重组融合蛋白具有明显的生物学活性。上述结果为在大肠杆菌中成功表达有活性的重组STK11蛋白的首次报道。     

重组抗凝蛋白-新蛭素的原核表达研究

目的:重组新蛭素(EH)是在抗凝蛋白水蛭素的氨基末端添加3个氨基酸(EPR)的衍生物,以往EH的表达工艺沿用水蛭素的酵母表达工艺,生产周期长、目标蛋白表达效率相对较低。而水蛭素类的蛋白在大肠杆菌中往往以包涵体形式表达,后期的分离纯化收率较低,无法适应产业化。为了提高EH的生产效率,探索了EH在大肠杆菌中的可溶性表达。方法:首先通过PCR的方法获得eh的cDNA,PCR产物连接入原核表达载体pET-22或pET-24中获得重组表达质粒,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或BL21(plySs),获得重组工程菌BL21(DE3)-pET-24-eh,BL21(DE3)-pET-22-eh,BL21(plySs)-pET-22-eh。重组工程菌进行IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果:EH在3个重组工程菌中均可实现可溶性表达。表达水平较高的为BL21(DE3)-pET-24-eh工程菌;之后通过优化诱导温度,时间,诱导剂浓度、诱导前菌种密度,确定最佳条件为:37℃,诱导6h,IPTG浓度为0.4μmol/L,诱导前菌种密度在OD₆₀₀=1左右。诱导产物经分离纯化,其纯度可达96.93%。最后通过蛋白含量测定及抗凝活性检测,确定表达的EH蛋白本身无抗凝活性,被FXa裂解后可以释放出水蛭素的抗凝活性。结论:实现了EH在大肠杆菌中的可溶性表达,表达周期短,有望提高EH的生产效率,为EH的产业化奠定了基础,也为水蛭素类产品的生产提供了新的工艺途径。     

棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的原核表达及蛋白纯化鉴定

为获得大量高纯度的GhCOMT2蛋白以便研究其功能和性质,以pMD18-GhCOMT2质粒为模板,PCR扩增GhCOMT2基因的cDNA编码区,构建原核表达载体pET-28a-GhCOMT2,经酶切鉴定并测序后转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,并采用Western blotting方法鉴定表达产物.结果表明:在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhCOMT2蛋白,大小约为40.062 kD,浓度为0.62 mg/mL.重组蛋白的最佳诱导条件为:0.2 mmol/L IPTG在16℃诱导12 h.重组蛋白以可溶形式高效表达,用蛋白标签亲和层析柱(His TrapTM HP)获得纯化重组蛋白,Western blotting分析表明其能与His多克隆抗体起特异性反应.     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

表达猪瘟病毒保护性抗原E0蛋白用以建立猪瘟抗体诊断方法,在标记疫苗(Marker vaccine)的研制和应用上具有重要的血清学鉴别功能,对于监测猪瘟病毒的流行情况和疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要作用.将猪瘟兔化弱毒株(HCLV)E0基因分别插入原核表达质粒pGEX4T,pET30,pMAL-p2X中,并分别以BL21和BL21-codonplus(DE3)-RP, BL21(DE3)和BL21-codonplus(DE3)-RP,TB1和BL21-codonplus(DE3)-RP为表达菌株.通过摸索IPTG诱导浓度,诱导温度,菌体收获时间,确定E0基因能在pGEX4T/ BL21-codonplus(DE3)-RP和pMAL-p2X/ BL21-codonplus(DE3)-RP中获得高效表达,表达产量分别占菌体总蛋白的15%和30%,表达的重组蛋白主要为包涵体形式.分别采用B-per试剂和超声波裂解配以曲通尿素对包涵体进行洗涤两种方法在pGEX表达系中取得了较好的效果.使用分步透析法对变性的包涵体进行复性,将复性蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST-E0融合蛋白.以GST-E0融合蛋白为诊断抗原,通过摸索抗原包被浓度,抗体血清稀释倍数初步建立了用间接ELISA检测猪瘟血清E0抗体的方法,为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定基础.     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

表达猪瘟病毒保护性抗原E0蛋白用以建立猪瘟抗体诊断方法,在标记疫苗(Marker vaccine)的研制和应用上具有重要的血清学鉴别功能,对于监测猪瘟病毒的流行情况和疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要作用.将猪瘟兔化弱毒株(HCLV)E0基因分别插入原核表达质粒pGEX4T,pET30,pMAL-p2X中,并分别以BL21和BL21-codonplus(DE3)-RP, BL21(DE3)和BL21-codonplus(DE3)-RP,TB1和BL21-codonplus(DE3)-RP为表达菌株.通过摸索IPTG诱导浓度,诱导温度,菌体收获时间,确定E0基因能在pGEX4T/ BL21-codonplus(DE3)-RP和pMAL-p2X/ BL21-codonplus(DE3)-RP中获得高效表达,表达产量分别占菌体总蛋白的15%和30%,表达的重组蛋白主要为包涵体形式.分别采用B-per试剂和超声波裂解配以曲通尿素对包涵体进行洗涤两种方法在pGEX表达系中取得了较好的效果.使用分步透析法对变性的包涵体进行复性,将复性蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST-E0融合蛋白.以GST-E0融合蛋白为诊断抗原,通过摸索抗原包被浓度,抗体血清稀释倍数初步建立了用间接ELISA检测猪瘟血清E0抗体的方法,为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定基础.     

Cultivation at 6-10°C is an effective strategy to overcome the insolubility of recombinant proteins in Escherichia coli

Protein expression in Escherichia coli at 15-25°C is widely used to increase the solubility of recombinant proteins. However, many recombinant proteins are insolubly expressed even at those low temperatures. Here, we show that recombinant proteins can be expressed as soluble forms by simply lowering temperature to 6-10°C without cold adapted chaperon systems. By using E. coli Rosetta-gami2(DE3), we obtained 1.8 and 0.9mg of Cryptopygus antarticus mannanase (CaMan) and cellulase (CaCel) from 1l culture grown at 6 and 10°C, respectively. Cultivation at 10°C also led to successful expression of EM3L7 (a lipase isolated from a metagenomic library) in a soluble form in E. coli BL21(DE3). Consequently, E. coli cultivation at 6-10°C is an effective strategy for overcoming a major hurdle of the inclusion body formation.     

人微管结合蛋白4微管结合区的体外表达

目的：构建表达人微管结合蛋白4微管结合区（Microtubule-binding domain,MTB）的大肠杆菌工程菌。方法：将1.27Kb编码MTB的DNA片段按正确方向亚克隆到原核生物表达载体pET-3α。得到表达质粒JS3,并转化大肠杆菌BL21（DE3）。结果：IPTG诱导下,表达产物的SDS-PAGE分子量大约是40kD,并能被抗MAP4抗体特异地识别。此外,重组MTB蛋白能在体外结合微管。结论：人微管结合蛋白4微管结合区具有微管结合活性。     

链球菌蛋白G的构建、重组表达及鉴定

化学合成链球茵蛋白G的C3D基因片段,通过分子生物学的方法对蛋白G（proteinG）的C3片段进行PCR扩增,拼接形成含有两个和三个重复C3片段的重组链球茵蛋白G,C3片段间以链接区D连接,即形成C3DC3和C3DC3DC3的形式,进而克隆到质粒pET21中,在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。重组表达的蛋白经过DEAE—Sepharose和IgG—Sepharose纯化,得到纯化的重组蛋白。采用非竞争性酶免疫法对重组蛋白与不同来源IgG的结合常数进行测定,实验结果显示两种重组链球茵蛋白G均可有效地与小鼠、兔及山羊等多种不同来源抗体特异性结合。这些实验结果为下一步研究奠定了基础。     

Expression, purification, and secondary structure characterization of recombinant KCTD1

Potassium channel tetramerization domain containing 1 (KCTD1) contains a BTB domain, which can facilitate protein-protein interactions that may be involved in the regulation of signaling pathways. Here we describe an expression and purification system that can provide a significant amount of recombinant KCTD1 from Escherichia coli. The cDNA encoding human KCTD1 was amplified and cloned into the expression vector pET-30a(+). The recombinant protein was expressed in E. coli BL21(DE3) cells and subsequently purified using affinity chromatography. To confirm that KCTD1 was correctly expressed and folded, the molecular weight and conformation were analyzed using mass spectroscopy, Western blot, and circular dichroism. Optimizing KCTD1 expression and investigating its secondary structure will provide valuable information for future structural and functional studies of KCTD1 and KCTD family proteins.     

C型产气荚膜梭菌β1、β2毒素基因的融合

利用PCR技术 ,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出 β1 和 β2 毒素基因 ,构建了含 β1 - β2 融合基因表达质粒的重组菌株BL2 1(DE3) (pETXB1_2 )。经酶切鉴定和序列测定证实 ,构建的重组质粒pETXB1_2含有 β1 - β2 融合基因 ,且基因序列和阅读框架正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的 β1 - β2 融合蛋白能够被 β1 、β2 毒素抗体识别。免疫实验结果表明 ,用β1 - β2 融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗 1MLD的C型产气荚膜梭菌C5 9_4 4毒素攻击 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。     

vMIP-ⅡN端重组肽的表达纯化及活性鉴定

病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ (viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)由卡波西肉瘤疱疹病毒编码,前期研究证明了vMIP-II N端21肽(NT21MP)选择性的阻断趋化因子CXCR4,从而抑制乳腺癌细胞趋化的活性。通过化学合成法获得编码vMIP-ⅡN末端的基因序列,与pGEX-KG（克隆位点的N 端有谷胱甘肽转移酶GST标签序列）连接构建原核表达载体,重组质粒在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中获得表达,免疫印迹显示重组蛋白GST-NT21MP主要在细菌裂解液上清中表达,可溶性部分经亲和层析、超滤、快速蛋白液相色谱（fast protein liquid chromatography,FPLC）纯化获得高纯度的GST-NT21MP蛋白。利用Transwell趋化试验测定GST-NT21MP的活性。结果显示,重组蛋白GST-NT21MP能够抑制乳腺癌细胞SK-BR-3的趋化活性,可作为治疗乳腺癌转移的潜在性靶向药物。     

Downregulation of T7 RNA polymerase transcription enhances pET‐based recombinant protein production in Escherichia coli BL21 (DE3) by suppressing autolysis

Escherichia coli BL21 (DE3) is an excellent and widely used host for recombinant protein production. Many variant hosts were developed from BL21 (DE3), but improving the expression of specific proteins remains a major challenge in biotechnology. In this study, we found that when BL21 (DE3) overexpressed glucose dehydrogenase (GDH), a significant industrial enzyme, severe cell autolysis was induced. Subsequently, we observed this phenomenon in the expression of 10 other recombinant proteins. This precludes a further increase of the produced enzyme activity by extending the fermentation time, which is not conducive to the reduction of industrial enzyme production costs. Analysis of membrane structure and messenger RNA expression analysis showed that cells could underwent a form of programmed cell death (PCD) during the autolysis period. However, blocking three known PCD pathways in BL21 (DE3) did not completely alleviate autolysis completely. Consequently, we attempted to develop a strong expression host resistant to autolysis by controlling the speed of recombinant protein expression. To find a more suitable protein expression rate, the high‐ and low‐strength promoter lacUV5 and lac were shuffled and recombined to yield the promoter variants lacUV5‐1A and lac‐1G. The results showed that only one base in lac promoter needs to be changed, and the A at the +1 position was changed to a G, resulting in the improved host BL21 (DE3‐lac1G), which resistant to autolysis. As a consequence, the GDH activity at 43 h was greatly increased from 37.5 to 452.0 U/ml. In scale‐up fermentation, the new host was able to produce the model enzyme with a high rate of 89.55 U/ml/h at 43 h, compared to only 3 U/ml/h achieved using BL21 (DE3). Importantly, BL21 (DE3‐lac1G) also successfully improved the production of 10 other enzymes. The engineered E. coli strain constructed in this study conveniently optimizes recombinant protein overexpression by suppressing cell autolysis, and shows great potential for industrial applications.