虎仗原生质体分离纯化及电融合初步研究

以野生虎杖根状茎芽为外植体诱导虎杖愈伤组织,选取生长状况良好的愈伤组织作为原生质体分离材料,通过L16(44)正交试验对虎杖原生质体分离条件进行优化.结果表明:1.4%纤维素酶R-10,0.1%果胶酶,17%甘露醇的酶液,酶解时间7h,虎杖原生质体分离效果最好.在80r/min振荡分离后虎杖原生质体得率为46.2%.以800r/min的离心速度纯化,纯化的原生质体得率为43.8%,其中原生质体的成活率为75%.通过对虎杖原生质体进行融合,原生质体的融合率为20.2%.     

蕨麻愈伤组织原生质体制备条件的优化

以青海‘蕨麻4号’诱导培养的愈伤组织为材料,采用4因素3水平L9(34)正交实验,研究酶类组合、酶解时间、甘露醇浓度及离心速度等主要因素对蕨麻原生质体分离的影响,建立高效、稳定的蕨麻原生质体分离体系,为进一步通过原生质体融合、基因工程等方法对蕨麻进行品种改良奠定基础。结果表明:各因素对蕨麻原生质体产量的影响顺序为:酶类组合酶解时间甘露醇浓度离心速度;青海‘蕨麻4号’愈伤组织原生质体的最适酶解条件为:2.0%纤维素酶+0.75%果胶酶,40r/min振荡酶解10h,甘露醇浓度为0.5mol/L,离心转速为1 000r/min时原生质体的产量达最大(8.96×10~5 cells/g),活力为92.77%。     

新疆杨愈伤组织原生质体的游离与纯化

目的:以愈伤组织为材料,研究新疆杨原生质体的游离、纯化。方法:以新疆杨愈伤组织为材料,采用简单试验设计和方差分析方法,对新疆杨原生质体游离的影响因素进行研究,并利用二乙酸荧光素染色法观察原生质体活力。结果:适宜新疆杨愈伤组织原生质体游离的较适宜条件是:CPW+2.0%纤维素酶R-10+1.0%离析酶R-10+1.0%果胶酶Y-23+0.6 mol/L甘露醇,酶解温度27℃,酶解时间8 h。在此条件下,原生质体产量达8.5×106个/(g.FW),活力达83.6%。原生质体纯化可采用蔗糖等密度离心法,较适蔗糖浓度为30%。结论:研究筛选出的酶解因素组合与等密度离心条件较适宜新疆杨愈伤组织原生质体的游离和纯化。     

菠菜原生质体游离与纯化的研究

以菠菜为实验材料进行原生质体分离、纯化、活力鉴定。结果表明:1.5%纤维素酶OnozukaR-10+1%果胶酶Pectolase+0.5mol/L甘露醇+CPW盐的酶液,酶解时间5h,菠菜原生质体的获得率高。纯化时,适当降低离心时间有利于原生质体纯化过程中产量及活力的保持,500r/min离心5min,效果较好。     

黄芪原生质体分离技术

以黄芪叶片和愈伤组织为材料,对黄芪原生质体的制备分离技术进行了研究。结果表明:采用黄芪叶片制备原生质体远远优于黄芪愈伤组织,能够获得大量高活力的原生质体;采用2%纤维素酶+0.5%半纤维素酶+0.5%果胶酶的混合酶水解12h就能达到较好的分离效果,获得高质量的黄芪原生质体,然后进行原生质体的培养。     

南蛇藤原生质体培养及植株再生

以4℃低温暗处理24 h的南蛇藤胚性愈伤组织为分离原生质体的原材料,用MS培养基进行液体浅层静置、固液双层以及琼脂糖包埋培养原生质体,获得再生愈伤组织并分化成苗,建立了原生质体培养体系。结果表明,低温暗处理利于高产率高质量原生质体的获得;0.5%纤维素酶+0.5%果胶酶+5 mmol.L-1MES为酶的最佳配方;12 h为最佳酶解时间;13%为甘露醇最佳浓度;静置12 h+振荡0.5 h为最佳酶解方式;液体浅层静置培养取得了较好的原生质体培养效果;MS+6-BA2.0 mg.L-1+IBA 0.1 mg.L-1为愈伤组织最佳分化培养基;1/2MS+NAA0.1 mg.L-1为最佳生根培养基。     

沙冬青子叶原生质体瞬时表达体系的建立及其AmDREB1蛋白的亚细胞定位

以沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.ex Kom.)Cheng f.)幼苗的子叶为材料,对其原生质体的分离、纯化和瞬时表达体系进行了研究。结果表明,子叶原生质体分离的最佳酶解液组成为CPW溶液+3.0%纤维素酶R-10+0.5%离析酶R-10+0.3%半纤维素酶+9.0%甘露醇(p H5.8);最佳酶解条件为室温、避光、40 r/min轻摇14 h。采用W5溶液作为漂洗液将酶解物稀释后进行过滤,将过滤液在4℃、700 r/min条件下离心5 min,所得纯化原生质体的产量约为2.50×106cells/g,活力达到90%;以纯化的原生质体作为受体,利用聚乙二醇(PEG)介导法成功将植物瞬时表达载体p BI-GFP导入其中,转化效率达到50.8%。利用本研究建立的原生质体瞬时表达体系,检测到沙冬青脱水应答转录因子Am DREB1定位于细胞核内。     

霸王的原生质体培养的研究

目的：为利用原生质体融合技术转移霸王抗旱基因。方法：采用酶解法分离霸王原生质体,比较了霸王子叶和愈伤组织游离原生质体的产量和活力,不同渗透压和起始密度对原生质体分裂频率的影响。结果：愈伤组织游离的原生质体产量和活力均高于子叶,原生质体产率可达2.4×106个/g.FW,活力达89%。采用液体浅层培养,在附加2,4-D（2mg/L）、6-BA（1.0mg/L）、2%蔗糖和甘露醇（0.4mol/L）的DPD培养基中,原生质体分裂频率最高,达68.6%。转移到附加2-iP（3mg/L）、KT（1.0mg/L）、6-BA（1.0mg/L）的分化培养基上,获得2个再生苗。结论：采用酶解法游离霸王愈伤组织,可获得高活力和高分裂频率的霸王原生质体。     

甘蓝型油菜与芝麻菜体的细胞杂交

为拓宽油菜育种的基因资源库, 改良油菜品种, 以甘蓝型油菜(Brassica napus)花油3号下胚轴和芝麻菜(Eruca sativa)下胚轴为材料分离制备原生质体; 然后采用PEG-高Ca2+-高pH法进行原生质体融合, 当PEG浓度为35%, 原生质体融合密度为5×105个/mL时, 融合25 min时, 融合率可达18.2%。融合后在培养密度为1×105个/mL时, 以附加1.0 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+ 200 mg/L肌醇+300 mg/L水解酪蛋白的改良的KM8p为融合体培养基, 以0.1 mol/L 蔗糖+0.2 mol/L葡萄糖+0.2 mol/L甘露醇作渗透稳定剂进行液体浅层培养, 效果较好, 愈伤组织再生率最高为6.8%。将融合体再生的小愈伤组织转移至培养基(B5无机盐+0.087 mol/L蔗糖+0.2 mg/L 2, 4-D+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+ 0.5% Agar, pH 5.8)上增殖培养, 待愈伤组织长至直径为3~5 mm时, 及时将其转至分化培养基(MS无机盐+0.087 mol/L 蔗糖+0.1 mg/L IAA+0.8 mg/L 6-BA+0.8% Agar, pH 5.8)中诱导不定芽再生, 芽分化率为35.7%。当不定芽长为2~3 cm时, 将其切下转入附加0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA的1/2MS生根培养基中诱导生根, 14 d左右即可形成再生植株, 生根率可达88%。同时, 以紫外线(60 μW/cm2)照射芝麻菜原生质体, 进行不对称融合, 照射2 min的获得了愈伤组织和再生植株, 照射4 min的只获得愈伤组织, 而照射5 min以上的没有获得愈伤组织, 但其愈伤组织再生、增殖及植株再生均不如对称融合。从细胞学鉴定的21块杂种愈伤组织上再生出16株杂种植株。     

甘蓝型油菜与芝麻菜体的细胞杂交

为拓宽油菜育种的基因资源库, 改良油菜品种, 以甘蓝型油菜(Brassica napus)花油3号下胚轴和芝麻菜(Eruca sativa)下胚轴为材料分离制备原生质体; 然后采用PEG-高Ca2+-高pH法进行原生质体融合, 当PEG浓度为35%, 原生质体融合密度为5×105个/mL时, 融合25 min时, 融合率可达18.2%。融合后在培养密度为1×105个/mL时, 以附加1.0 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+ 200 mg/L肌醇+300 mg/L水解酪蛋白的改良的KM8p为融合体培养基, 以0.1 mol/L 蔗糖+0.2 mol/L葡萄糖+0.2 mol/L甘露醇作渗透稳定剂进行液体浅层培养, 效果较好, 愈伤组织再生率最高为6.8%。将融合体再生的小愈伤组织转移至培养基(B5无机盐+0.087 mol/L蔗糖+0.2 mg/L 2, 4-D+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+ 0.5% Agar, pH 5.8)上增殖培养, 待愈伤组织长至直径为3~5 mm时, 及时将其转至分化培养基(MS无机盐+0.087 mol/L 蔗糖+0.1 mg/L IAA+0.8 mg/L 6-BA+0.8% Agar, pH 5.8)中诱导不定芽再生, 芽分化率为35.7%。当不定芽长为2~3 cm时, 将其切下转入附加0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA的1/2MS生根培养基中诱导生根, 14 d左右即可形成再生植株, 生根率可达88%。同时, 以紫外线(60 μW/cm2)照射芝麻菜原生质体, 进行不对称融合, 照射2 min的获得了愈伤组织和再生植株, 照射4 min的只获得愈伤组织, 而照射5 min以上的没有获得愈伤组织, 但其愈伤组织再生、增殖及植株再生均不如对称融合。从细胞学鉴定的21块杂种愈伤组织上再生出16株杂种植株。     

苜蓿根癌农杆菌转化系原生质体培养研究

首蒂是一种重要的豆科牧草。1980年,Kao等首次由首精叶向原生质体通过胚状体途径再生植株获得成功'",此后有关首请原生质体再生植株的报道已经涉及很多不同品种'。本工作对首带胭脂碱型农杆菌转化愈伤组织进行了原生质体培养,建立起一种简便有效的培养方法;并分析了碘乙酸胺对原生质体的作用,为融合实验打下了基础。1材料与方洁以本实验室得到的首精（Medicago。tiva）根瘤农杆菌（Agrohacteriumtumdeciens）702菌株转化系为材料。取2g转代12d的颗粒状黄绿色愈伤组织转人10mL酶液,于黑暗、25C、50r／min条件下游离6h。酶液组成为2…     

不同因素对两株细菌原生质体制备的影响

为了获得较多的原生质体用于原生质体融合,进行了酶解时间与浓度、稳定剂、菌龄、pH值等因素对革兰氏阳性菌株芽胞杆菌KR和革兰氏阴性菌株假单胞菌B13的原生质体制备影响的研究,结果表明:在以0.6mol/L蔗糖为稳定剂,pH8.0,溶菌酶浓度8mg/ml,37℃,酶解80min的条件下,芽胞杆菌KR原生质体得率为31.6%;在以.0.6mol/L NaCl为稳定剂,pH7.0,溶菌酶浓度6mg/ml,37℃,酶解45min假单胞菌B13原生质体得率最高,为95.2%。     

葡萄原生质体分离及瞬时转化体系的建立

为了建立葡萄原生质体进行遗传转化的技术,该研究以葡萄品种‘黑香蕉’的叶片和愈伤组织为材料,分析纤维素酶和离析酶的浓度与配比、渗透压和酶解时间等主要因素对葡萄原生质体分离的影响,探讨建立稳定、高效的葡萄原生质体分离与瞬时转化体系,为鉴定目标基因的功能奠定基础。结果表明:(1)葡萄叶片原生质体的分离以3.0%纤维素酶和0.75%离析酶的酶组合,在0.6mol/L甘露醇溶液中,酶解14h为宜,每克游离产量为4.09×106个原生质体,活力为83.12%。(2)葡萄愈伤组织原生质体的分离以2.0%纤维素酶和0.5%离析酶的酶组合,在0.5mol/L甘露醇溶液中,酶解14h为宜,每克游离产量为6.05×106个原生质体,活力为84.13%。(3)利用该方法得到的葡萄原生质体为受体,采用40%PEG-4000介导转化质粒载体pEZS-NL,目标基因瞬时表达产物检测表明,GFP蛋白表达稳定、清晰。该研究建立的葡萄原生质体制备和转化体系,可以用较少量的质粒DNA获得外源基因在原生质体内的表达,为葡萄功能基因的研究提供技术支持。     

水稻原生质体制备条件的优化及其细胞壁变化的快速检测

以疣粒野生稻和栽培稻02428的成熟种子为材料,对愈伤组织的诱导和继代、胚性悬浮细胞系建立、原生质体制备、再生细胞团分化及植株再生进行研究。结果表明：（1）水稻愈伤组织诱导的最佳2,4-D浓度为0.014 mmol/L;（2）胚性悬浮细胞系建立的最佳条件为AA 悬浮培养基+ 0.009 mmol/L 2,4-D ,每25 mL液体培养基加入0.4 g愈伤组织的初始接种量,7 d的继代周期;（3）原生质体制备的最佳条件为20 g/L纤维素酶+ 1 g/L果胶酶,酶解5 h,800 r/min离心5 min;（4）用荧光增白剂（VBL）细胞壁染色液可以快速、准确的检测原生质体制备及培养过程中细胞壁的变化情况。     

‘陇东’紫花苜蓿原生质体最佳分离条件

以‘陇东’紫花苜蓿（Medicago sativa L.cv.‘Longdong’）下胚轴愈伤组织为材料,研究酶液组合、酶解时间、酶液渗透压、愈伤组织继代培养时间及预处理措施对原生质体分离效果的影响。结果表明：获得产量最高（8.8×105个·g-1）、活力最高（88.55%）的原生质体最佳酶液组合为2%纤维素酶＋0.5%果胶酶＋0.3%崩溃酶、酶解时间为10h、酶液渗透压即甘露醇浓度为0.55mol·L-1,愈伤继代培养天数为12d、预处理措施为4℃、黑暗条件下放置24h。     

沙打旺原生质体培养再生植株

用1%半纤维素酶,0.4%纤维素酶,0.1%果胶离析酶,CPW9M酶液分离沙打旺无菌苗下胚轴和子叶原生质体。K8P原生质体培养基悬滴培养。下胚轴原生质体形成小细胞团后用琼脂糖包埋培养,形成小块愈伤组织后转入增殖培养基M1、M2(改良MS培养基)上形成大块愈伤组织。经过两次诱导分化,在分化培养基M3(MS 0.7mg/L BA 0.2mg/L NAA),M4(MS 0.5mg/L BA 0.5mg/L KT 0.5mg/L ZT 0.2mg/L NAA)和M6(MS 3mg/L ZT 0.2mg/L IAA)上分化出苗,再生植株。由子叶分离的原生质体未能形成愈伤组织。     

玉米、小麦、水稻原生质体制备条件优化

玉米Zea mays L.、小麦Triticum aestivum L.、水稻Oryza sativaL.是三大重要粮食作物,对其原生质体制备条件的优化具有重要意义.以玉米(综3)、小麦(中国春)、水稻(日本晴)10日龄幼苗为材料,研究了叶肉细胞原生质体分离过程中的酶浓度、酶解时间和离心力大小等因素对产量和活力的影响.结果表明:酶浓度和酶解时间对原生质体产量影响显著,随着酶解液浓度和酶解时间的提高,原生质体产量增加,但细胞碎片同时增多.水稻经真空处理后,原生质体产量大幅度提高.通过正交实验设计得出如下结果:玉米叶肉细胞原生质体分离的最佳条件为:纤维素酶1.5％,离析酶0.5％,50 r/min酶解7h,100×g离心2 min收集,原生质体产量为7×106/g FW;小麦叶肉细胞原生质体分离的最佳条件为:纤维素酶1.5％,离析酶0.5％,50 r/min酶解5h,100×g离心2 min收集,原生质体产量为6×106/g FW;水稻叶肉细胞原生质体分离的最佳条件为:纤维素酶2.0％,离析酶0.7％,50 r/min酶解7h,1 000×g离心2 min收集,得到的原生质体产量为6×106/g FW.通过二乙酸荧光素染色发现原生质体活力均在90％以上.用PEG-Ca2+介导法将含有绿色荧光蛋白的质粒转化入原生质体,转化率可达50％ ～80％.     

普通小麦与簇毛麦不对称体细胞杂交的研究

以不同浓度(0～2.5mmol/L)碘乙酰胺(IOA)处理的小麦(Triticum aestivum L.)原生质体为受体,以经6krad(130rad/min)⁶⁰Co-γ射线处理的继代后4～5d期簇毛麦(Haynaldia villosa)愈伤组织原生质体为供体,使用PEG法诱导细胞融合。融合细胞经培养形成细胞团、愈伤组织或植株。通过形态学比较、染色体检查及同工酶分析,确认了得到的愈伤组织和再生植株为体细胞杂种。     

小麦与燕麦不对称体细胞杂交的研究

以小麦品种济南177的悬浮细胞系(长期继代培养已丧失分化能力)来源的原生质体混合同品种胚性愈伤组织(分化能力较强, 约70%)制备的原生质体为受体, 以经300 mW/cm²紫外线照射0.5, 1, 2, 3, 5 min的普通燕麦愈伤组织(分化频率很低, 约10%)原生质体作供体, 用PEG法诱导融合. 可高频率地获得体细胞杂种细胞系, 并分化获得绿色正常的再生植株, 经荧光原位杂交、 同工酶及5S rDNA间隔序列分析, 确认了它们为体细胞杂种. 单独使用小麦胚性悬浮系或愈伤组织为受体获得的杂种克隆均未能得到绿色植株.     

普通小麦与簇毛麦原生质体的紫外线融合

从来源于普通小麦品种济南177（Triticum aestivum cv.Jinan 177）悬浮细胞系的原生质体与来源于簇毛麦（Haynaldia villosa）胚性愈伤组织的原生质体融合获得体细胞杂种。供体簇毛麦原生质体在融合之前用紫外线照射30s或1min,紫外线剂量为360Цw/cm^2。仅由紫外线照射30s的组合获得再生愈伤组织克隆。细胞学、生物化学及PCR分析结果证实了再生克隆的杂种性质。用线粒体基因特异的探针进行的RFLP分析的结果表明,杂种中含有融合双亲的线粒体并且发生了重组。由杂种愈伤组织再生得到白化苗。讨论了紫外线对融合产物的影响。