结肠腺瘤息肉蛋白突变经PI3K/AKT信号通路影响犬肾细胞MDCK的细胞粘附(英文)

结肠腺瘤息肉蛋白(APC)是一个肿瘤抑制因子,它不仅参与Wnt信号通路的传导,而且对细胞粘附、细胞骨架的组织和迁移等都有影响.APC突变发生于大多数结肠癌中.为了探讨APC突变对细胞粘附的影响及机制,本研究利用细胞粘附实验分析了MDCK-APC-N1和对照MDCK-GFP稳定表达细胞株系的细胞粘附情况.实验结果显示,在MDCK细胞中过表达APC-N1导致细胞-细胞间的粘附减少,细胞-基质间的粘附增加.荧光定量PCR和Western印迹实验表明,在MDCKAPC-N1细胞中,E-cadherin表达水平降低,CD29、P-FAK(Y397)、β-catenin和P-AKT(T308)表达水平升高.在MDCK-APC-N1细胞中,敲减β-catenin导致E-cadherin表达量升高,而CD29表达没有明显变化.进一步利用PI3K抑制剂LY294002处理MDCK-APC-N1细胞,结果发现,E-cadherin表达量明显升高,CD29表达量明显降低.这些结果揭示,APC-N1可活化PI3K/AKT信号通路,进而改变粘附蛋白E-cadherin和CD29影响细胞粘附.     

结肠腺瘤息肉蛋白突变经PI3K/AKT 信号通路影响犬肾细胞MDCK的细胞粘附

结肠腺瘤息肉蛋白（APC）是一个肿瘤抑制因子,它不仅参与Wnt信号通路的传导,而且对细胞粘附、细胞骨架的组织和迁移等都有影响.APC突变发生于大多数结肠癌中.为了探讨APC突变对细胞粘附的影响及机制,本研究利用细胞粘附实验分析了MDCK-APC-N1和对照MDCK-GFP稳定表达细胞株系的细胞粘附情况.实验结果显示,在MDCK细胞中过表达APC-N1导致细胞-细胞间的粘附减少,细胞-基质间的粘附增加.荧光定量PCR和Western印迹实验表明,在MDCK-APC+N1细胞中,E-cadherin表达水平降低,CD29、P-FAK (Y397)、β-catenin和 P-AKT (T308)表达水平升高. 在MDCK-APC-N1细胞中,敲减β-catenin导致E-cadherin表达量升高,而CD29表达没有明显变化.进一步利用PI3K抑制剂LY294002处理MDCK-APC-N1细胞,结果发现,E-cadherin表达量明显升高,CD29表达量明显降低.这些结果揭示,APC-N1可活化 PI3K/AKT 信号通路,进而改变粘附蛋白E-cadherin和CD29影响细胞粘附.     

家族性腺瘤息肉病的遗传病因学研究进展

家族性腺瘤息肉病(FAP)是第二常见的遗传性结直肠癌综合征,多在青春期发病,发病率约1/10000,主要临床表现为大肠中多发的腺瘤性息肉,是一种结直肠癌的癌前病变,如果不予治疗,几乎100%的患者会发展成为结直肠癌。一直以来,FAP被认为是一种常染色体显性遗传疾病,发病由APC基因胚系突变引起。根据临床特点的不同,FAP患者可以分为经典型FAP(CFAP)和轻表型FAP(AFAP)。然而近年来,在一些无APC基因胚系突变的FAP患者中发现了Mut YH基因的双等位基因突变。这种由于Mut YH基因双等位基因突变而无APC生殖突变所引起的临床综合征定义为Mut YH基因相关性息肉病[2](MAP)。MAP为常染色体隐性遗传,是一种特殊类型的FAP。另外,很多研究表明,APC基因的突变位点与结肠腺瘤病的严重程度、癌变的风险程度和某些肠外表现相关。MAP的发现和对FAP基因型-表型相关性的研究,完善了对FAP遗传病因学的认识,对于FAP患者及高危亲属的合理防治和预后具有重要的意义。     

经典Wnt信号途径与结直肠肿瘤发生

癌发生的主要原因是控制细胞生长和存活的信号转导途径被异常激活,而这些信号途径在正常胚胎发育中起重要作用.经典的Wnt信号转导途径是其中最重要的通路之一,目前认为其成分主要包括：细胞外因子（Wnt）、跨膜受体（卷曲蛋白Frizzled,Fz）、辅助受体（低密度脂蛋白受体相关蛋白-5和-6,LRP5/6）、β-链蛋白（β-catenin,β-cat）、结肠腺瘤样息肉病（adenomatous polyposis coli,APC）蛋白、T细胞因子（TCF）等一系列蛋白质.多数结直肠癌患者的转化细胞存在APC基因缺失、突变或失活,导致β-cat在核内的累积,从而影响相关基因转录,这是结直肠癌发生的关键因素之一.对Wnt途径的进一步研究将为探索结直肠癌的发病机制以及寻找有效的诊治手段提供新视觉.     

应用蛋白截短技术检测APC基因胚系突变

建立蛋白截短检测技术,分析家族性腺瘤样息肉病（FAP）发病相关基因APC基因的胚系突变,研究基因突变型与FAP疾病表型的关系。经临床诊断的22例FAP患者及43例散发性大肠癌患者,分别取外周静脉血和正常结肠粘膜组织,常规提取基因组DNA。应用蛋白截短检测技术,分段分析APC基因巨大的第15外显子,对检出截短蛋白的样本进行测序,以确定突变位点及突变性质。22例FAP患者中,5例患者存在APC基因第15外显子的胚系突变,均为碱基缺失造成的移码突变,导致截短蛋白的产生;43例散发性大肠癌患者中未检测到APC基因第15外显子的胚系突变。蛋白截短检测技术是一种高效的基因突变分析技术,适用于大片段基因（如APC基因第15外显子）截短型突变的检测,可作为FAP症状出现前的常规基因诊断技术的一项有效补充。     

结肠腺瘤性息肉病蛋白通过与SMAP/KAP3相互作用与微管结合

结肠腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli,APC)的突变导致家族性结肠息肉腺瘤病和散发性结肠癌,APC基因编码一个具有多个结构域、多种磷酸化状态的大分子蛋白质.APC蛋白可通过C段直接或间接与微管结合,同时还可以通过中段与微管结合,但其结合的机制目前还不清楚.为进一步研究APC与其他蛋白质的相互作用,利用酵母双杂交技术运用APC中段（1 500 bp～4 800 bp）构建诱饵质粒,筛选人胎脑cDNA文库,得到一个与APC相互作用的蛋白SMAP/KAP3,SMAP/KAP3是驱动蛋白KIF3A/3B的相关蛋白.通过免疫共沉淀和双色免疫荧光共定位的方法,证实了APC与SMAP/KAP3在体内的相互作用,提示APC可能通过SMAP/KAP3-KIF3A/B参与沿微管的运动.     

肿瘤抑制蛋白APC的结构与功能

肿瘤抑制蛋白APC(adenomatous polyposis coli)是一种多功能蛋白,它不仅参与Wnt信号途径,调节β-链蛋白(β-catenin)的降解,同时也调节细胞骨架运动,影响细胞的迁移、黏合和分裂等。APC和其他相关因子之间的平衡对于肠上皮细胞的正常发育是十分重要的,这种平衡一旦被打破可能导致结肠功能的破坏及癌症的发生。该文着重介绍APC蛋白的结构及对细胞生长的影响。     

肠道菌群及其代谢产物 与结肠腺瘤性息肉相关性的研究进展

结肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的消化道恶性肿瘤,其发病率和病死率都极高。从结肠息肉发展到结肠癌一般需要10～15年,且大多遵循息肉-腺瘤-癌症的发展过程,结肠腺瘤性息肉(colorectal adenomatous polyps,CAP)被认为是结肠癌的癌前病变。有研究显示肠道菌群的改变与肠道腺瘤性息肉样变及癌症的发生发展有密切的相关性。根据肠道菌群在不同病理状态下的富集程度,可以进一步分析其与结肠病变之间的关系。本文就肠道菌群的构成,CAP患者粪便和腺瘤组织中肠道菌群富集的改变,以及肠道菌群代谢产物对CAP患者的影响等内容进行综述,为结肠腺瘤性息肉的早期诊断和治疗提供依据。     

多靶测试法可早期发现结肠癌

结肠直肠癌最常见的临床检测法便是检测病人粪便中的血 .但此法有明显的缺点 ,即只能检出 30 %～40 %结肠直肠癌 ,且假阳性为 5%～ 1 0 % .还有一个检测法是检查粪便中结肠和直肠脱落细胞中突变的ＤＮＡ .但该项检测法的缺点是只能检测出几个相关基因突变中的一个突变 .现在有一种新技术 ,称为多靶测试法 ,它可以检出 4个突变的有病基因 .此外 ,多靶测试法并搜寻在粪便中的、来自结肠或直肠细胞的长片段ＤＮＡ .在粪便中 ,健康的结肠细胞发生自杀或称凋亡 ,即细胞中的ＤＮＡ被切割成小片段 ,而结肠癌细胞在粪便中不发生凋亡 ,故保持长片段Ｄ…     

巴德-毕氏综合征有关致病基因与病理的研究进展

巴德-毕氏综合征(Bardet-Biedl syndrome,BBS)是一种罕见的常染色体隐性遗传病,具有高度的遗传异质性。迄今为止,已发现18个BBS基因,其突变均可导致BBS表型。已有研究发现,BBS是一种与纤毛相关的疾病。BBS基因的突变或缺陷可能影响纤毛结构或功能,从而导致BBS表型。现就主要针对纤毛的结构、形成过程进行解析,探讨纤毛缺陷和BBS基因、蛋白之间的相互关系,试图更全面地阐述BBS与纤毛缺陷之间的关系。     

甘油二酯激酶α在结直肠癌中的表达及其与PKC、TNFα的相关性

目的探讨甘油二酯激酶α(DGKα)在结直肠癌中的表达及其与蛋白激酶C(PKC)、肿瘤坏死因子α(TNFα)表达的相关性。方法应用免疫组化方法检测DGKα、PKC和TNFα在48例结直肠癌、癌旁正常组织和9例腺瘤性息肉中的表达。结果 DGKα在结直肠癌组织和癌旁正常组织有表达,结直肠癌组织中DGKα阳性表达率(79.2%)显著高于腺瘤性息肉(阴性)和癌旁正常组织(33.3%,P0.05);PKC主要分布在结直肠癌和癌旁正常组织中,结直肠癌组织中PKC阳性表达率(35.4%)显著高于腺瘤性息肉(阴性),与癌旁正常组织(20.8%)相比无显著性差异(P0.05);TNFα在三种组织中均表达阳性,结直肠癌组织中TNFα阳性表达率(95.8%)显著高于腺瘤性息肉(55.6%,P0.05),与癌旁正常组织(87.5%)相比无显著性差异(P0.05);结直肠癌组织中,DGKα与PKC的表达呈负相关(r=-0.437,P0.05),与TNFα的表达没有相关性(r=0.185,P0.05)。结论DGKα在结直肠癌组织中的表达高于腺瘤性息肉,DGKα可能抑制了PKC的活性,但对TNFα没有明显的抑制作用,在临床病理鉴别诊断中有辅助价值。     

c-myc癌基因在大肠组织中表达的免疫组织化学和原位杂交研究

本文应用 c-myc 癌基因蛋白免疫组织化学和 mRNA 原位杂交方法研究了 c-myc 癌基因在大肠组织中的表达,并以胎盘作为阳性对照。发现在胎盘合体滋养叶细胞和结肠粘膜表面上皮都有 c-myc 癌基因的表达。结肠肿瘤 c-myc 表达增加,腺癌表达高于腺瘤。腺瘤中以绒毛状腺瘤表达最高。研究表明 c-myc 癌基因表达并不绝对与细胞增殖状态相关。     

MDCK细胞和MDCK-G1细胞感染H1N1流感病毒后病毒滴度和细胞转录组表达差异分析

目的通过分析细胞表达基因及其相关信号通路的差异等信息,探索MDCK和MDCK-G1细胞株在接种H1N1流感病毒后出现病毒滴度和细胞生长趋势差异的内在生物学特性等原因。方法通过Illumina测序平台对2株细胞进行转录组测序(RNA sequencing, RNA-seq)和测序结果生物信息学分析后,选择了17个差异基因进行实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)验证。结果 MDCK和MDCK-G1细胞差异基因(differentially expressed genes, DEGs)|log_2(FoldChange)|0和padj≤0.05总数为2 786个。相比于MDCK细胞,MDCK-G1细胞有967个基因的表达显著上升,1 819个基因的表达显著下降。差异基因通过基因本体(Gene Ontology, GO)数据库富集功能注释和京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)进行通路分析发现,2株细胞在免疫调控和细胞生长周期调控上均存在差异,qRT-PCR验证的17个基因中有16个基因的表达趋势与转录组测序结果一致。结论 2株细胞的转录谱存在显著差异。     

稳定表达人SidT2基因细胞系的建立及其dsRNA转运功能的研究

目的:构建稳定表达人SidT2基因的BHK及MDCK细胞系,探讨SidT2基因过表达与细胞转运双链RNA(dsRNA)能力的关系。方法:根据人SidT2基因序列设计引物,克隆其编码区序列,经双酶切后与pEGFP-N3载体连接,构建其真核表达载体,分别瞬时转染BHK及MDCK细胞,并使用G418筛选稳定表达细胞系;在此基础上,体外转录合成绿色荧光蛋白(GFP)dsRNA,以GFP基因为报告基因,进一步分析过表达人SidT2基因对BHK及MDCK细胞转运dsRNA能力的影响。结果:经基因克隆、酶切、连接后,构建了人SidT2基因真核表达载体pEGFP-SidT2;经瞬时转染及G418筛选,获得稳定过表达人SidT2基因的BHK及MDCK细胞系,实时荧光定量RT-PCR分析表明,其SidT2基因转录水平分别提高71、64.5倍;稳定表达SidT2基因后,在培养液中添加GFP dsRNA,GFP荧光强度较对照细胞分别降低88.1%、73.7%,表明稳定表达SidT2基因的BHK、MDCK细胞转运dsRNA的能力显著增强。结论:构建了稳定表达人SidT2基因的BHK及MDCK细胞系,SidT2基因过表达可显著提高外源性dsRNA的转运能力。     

VANGL2在人hUVEC细胞中初级纤毛装配和解聚的作用

动脉粥样硬化是心血管疾病的主要发病原因。大量研究显示,动脉粥样硬化的形成与内皮细胞的初级纤毛相关。探讨内皮细胞中的初级纤毛装配和解聚的机制,对于揭示动脉粥样硬化的发病机制具有重要的理论和实践意义。目前,作为平面细胞极化(PCP)信号通路的特有组分VANGL平面细胞极性蛋白2(VANGL2)在内皮细胞中与初级纤毛相关的研究甚少。因此,本研究构建VANGL2的慢病毒稳定干扰和过表达人脐静脉内皮细胞(hUVEC)系。从形态学上对初级纤毛分布的情况进行标记,同时用免疫荧光对VANGL2可能相互作用的蛋白质进行共定位检测,并利用免疫印迹进一步对其下游蛋白质蓬乱蛋白(DVL2)、初级纤毛装配相关蛋白质巴特-比德尔综合征8(BBS8)和纤毛内转运系统88(IFT88)、初级纤毛解聚相关蛋白质运动蛋白家族成员2A(KIF2A)和143位点处丝氨酸磷酸化的蓬乱蛋白(pDVL2)进行检测,用免疫共沉淀检测与VANGL2、下游蛋白质DVL2相互作用的蛋白质。结果表明,免疫荧光标记初级纤毛的荧光图显示,过表达VANGL2后初级纤毛数量显著增多(P0.05),其长度也较其他组更长,其定位方向更倾向于VANGL2富集的位置,并位于初级纤毛的基部。免疫荧光共定位显示,BBS8、IFT88均与VANGL2共定位,在过表达VANGL2组中均呈极性分布,PLK1也与VANGL2存在共定位情况,但整体上PLK1的表达量较低。免疫印迹结果显示,过表达VANGL2时,其下游蛋白质DVL2上调(P0.01)。同时,初级纤毛解聚相关蛋白质KIF2A也上调(P0.01)。此外,与初级纤毛解聚途径激活有关的pDVL2下调(P0.05),初级纤毛装配相关的蛋白质BBS8、IFT88发生上调(P0.01)。免疫共沉淀结果显示,VANGL2与DVL2存在相互作用关系,且VANGL2和DVL2均与KIF2A相互作用,但DVL2与KIF2A相互作用的程度较强。综上结果表明,VANGL2可能通过上调DVL2并增加DVL2与KIF2A的相互作用而促进初级纤毛的解聚过程。同时,通过下调pDVL2、上调初级纤毛装配相关蛋白质BBS8和IFT88而增加初级纤毛的装配过程。但在过表达VANGL2组中,初级纤毛装配的过程比解聚占优势,两者最终的平衡决定初级纤毛的发生情况,为进一步研究VANGL2在内皮细胞中初级纤毛装配和解聚的机制研究提供见解。     

条件性敲除APC基因小鼠肠道腺瘤模型的构建

腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposis coli,APC)基因是家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)的致病基因,APC基因的突变导致小鼠多处产生肿瘤,但肠道条件性敲除APC基因后,小鼠的表型并不清楚。该研究利用Cre-LoxP重组酶系统,在肠道绒毛和隐窝上皮细胞条件性敲除APC基因,并对小鼠表型进行鉴定和分析。将Villin Cre小鼠和APC~(fl/fl)小鼠合笼得到Villin Cre;APC~(fl/+)小鼠;有意思的是后者进一步与APC~(fl/fl)小鼠合笼,却没有得到Villin Cre;APC~(fl/fl)小鼠。进一步解剖Villin Cre;APC~(fl/+)小鼠,发现其自发产生肠道肿瘤,并能携瘤生存,免疫组化显示瘤体组织激活了Wnt信号通路。结果表明成功地构建了小鼠肠道条件性敲除APC基因腺瘤模型,为进一步研究APC基因在肠道发育以及肠道肿瘤的作用提供了优良的工具。     

出芽酵母Saccharomyces cerevisiae转录抑制因子Rdr1负调控细胞胁迫应答

Rdr1是出芽酵母Saccharomyces cerevisiae的一个转录抑制因子,参与控制细胞的多重药物耐受性,并可能与细胞胁迫应答相关．利用PCR方法扩增RDR1基因片段,将其克隆至高拷贝表达载体pYES2/NTA上并诱导Rdr1蛋白在酵母细胞中过表达．为了揭示转录抑制因子Rdr1在胁迫应答中的作用,比较了RDR1过表达细胞、RDR1缺失突变体细胞和野生型细胞在过氧化氢处理、热胁迫和高盐处理条件下的生长状态,结果显示,RDR1过表达导致细胞对上述3种胁迫作用更敏感,而RDR1缺失则使细胞对这些胁迫作用的耐受性不受影响或有一定增强．为了揭示上述不同细胞在胁迫条件下生长状态的差异与细胞内抗氧化酶活性之间的关系,测定并比较了RDR1过表达细胞、RDR1缺失突变体细胞和野生型细胞中超氧化物岐化酶(superoxide dismutase SOD)、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase G6PDH)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase GR)的活性．结果表明,RDR1缺失突变体细胞具高活性的SOD、过氧化氢酶、G6PDH和GR,而Rdr1过表达细胞中SOD、过氧化氢酶、G6PDH和GR的活性较低．RDR1对SOD和过氧化氢酶活性的影响要大于G6PDH和GR．细胞抗氧化酶活性的变化初步揭示,RDR1过表达细胞对胁迫的敏感和RDR1缺失突变体细胞对胁迫耐受性增加的原因．为转录抑制因子Rdr1在胁迫应答中的负调控作用及其机理提供了初步的遗传学和生物化学证据．     

苦荞凝集素靶向抑制结肠癌细胞HCT116增殖的机制北大核心CSCD

苦荞凝集素(tartary buckwheat lectin,TBL)是一类兼具核糖体失活蛋白N-糖苷酶活性和芦丁水解酶活性的糖蛋白,具有显著的抑制结肠癌细胞增殖的功能。先前研究表明,TBL可以下调结肠癌细胞HCT116中包括miR-135a和miR-135b在内的一些oncomiRs的表达,并且可以抑制结肠癌细胞HCT116的增殖。因此,我们推测TBL可能通过调控oncomiRs从而抑制HCT116细胞的增殖。本研究中,我们构建了包含miR-135a和miR-135b结合位点的腺瘤性结肠息肉病基因(adenomatous polyposis coli,APC)的3'-UTR区。双荧光素酶报告系统表明,经过TBL处理后,实验组的荧光素酶活性较对照组高,而且用miR-135a&b的反义核酸anti-miR-135a&b处理后和实验组有相似的结果。Western印迹分析表明,TBL处理HCT116细胞24 h后,细胞中APC和p-β-catenin的表达上调,总β-catenin的表达下调,且存在剂量依赖效应,而对GSK-3β的表达无明显影响。进一步探究了TBL进入细胞的方式,我们发现,加入TBL作用2 h后,其主要存在于HCT116细胞的表面,部分进入细胞内部,在细胞表面可以同半乳糖凝集素galectin-3竞争结合细胞膜表面受体,并且存在剂量和时间依赖性。这些结果表明:TBL以HCT116细胞表面的galectin-3受体为靶点,通过内吞作用进入细胞,进而调控HCT116细胞中miR-135a&b的表达,影响Wnt信号通路而抑制结肠癌细胞的增殖。     

MS4A12基因在结肠癌中的表达及对结肠癌细胞增殖的影响

探讨MS4A12基因在结肠癌发生过程中的表达及其与结肠癌细胞增殖的关系,利用GEO数据库下载含正常结肠、不典型增生结肠腺瘤和结肠癌组织的基因芯片数据GSE37364,对MS4A12基因表达进行标准化后,再对其进行表达差异分析。通过对结肠癌细胞系Lo Vo进行MS4A12基因沉默,以此研究MS4A12基因对结肠癌细胞增殖的影响。MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,荧光定量PCR检测相关基因的表达。MS4A12基因在正常、腺瘤和结肠癌组织中表达依次降低(p0.001)。MS4A12基因沉默后,细胞增殖较对照明显升高(p0.05),且S期细胞比例较对照组升高,G1期细胞比例降低(p0.05)。本研究发现抑制MS4A12基因可以明显促进结肠癌细胞增殖,且在结肠癌发生过程中其表达逐渐降低,这提示MS4A12可能与结肠癌的发生有关并可为结肠癌早期诊断提供依据。     

细胞纤毛在信号转导与器官发育中的作用与机制

纤毛(cilia)是细胞表面的突起状细胞器,几乎存在于所有细胞表面,且广泛分布于组织和器官的上皮.纤毛由外部的纤毛膜和内部的轴丝组成,结构在进化上十分保守.根据微管组成和排列方式的不同,纤毛可分为9+2型运动纤毛与9+0型基本纤毛或非运动纤毛.作为一种特殊的感受器,纤毛通过影响细胞信号通路参与胚胎形成、心脏等内脏器官发育及人体重要生理活动.本课题组在国际上首次把前列腺素信号通路与纤毛生长及心脏发育相联系.研究发现,ABCC4/LKT前列腺素转运蛋白从细胞内运输前列腺素E2(PGE2)至细胞外,并通过结合位于纤毛膜上的G蛋白偶联受体EP4影响细胞内c AMP浓度,调节纤毛内运输蛋白的正向速率,进而调控纤毛生长与心脏等器官的左右不对称性发育.纤毛生长或功能缺陷会引发先天性心脏病、多囊肾、视网膜变性等多种疾病.本文主要介绍纤毛参与调控细胞内信号转导与器官发育及相关纤毛疾病.