HP1α在Zmpste24-缺陷早老小鼠胚胎成纤维细胞中表达和磷酸化水平升高

本实验旨在研究异染色质蛋白1（heterochromatin protein 1, HP1）在Zmpste24基因敲除早老小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)中的表达量和磷酸化水平,探索异染色质功能异常与早老发病机制的内在联系．首先取雄雌Zmpste24杂合子小鼠胚胎,原代培养MEFs;分别用PCR和Western 印迹检测MEFs基因型和A型核纤层蛋白（laminA）表达以区分野生型与Zmpste24-缺陷型早老细胞;用与衰老相关的β-半乳糖苷酶染色法 (senescence associated-β-galactosidase assay, SA-β-gal)确定早老细胞出现衰老表型的传代数．用Western 印迹和phos-tag Western 印迹分别检测HP1在Zmpste24+/+和Zmpste24-/- MEFs中表达量和磷酸化水平的差异．实验结果显示,Zmpste24-/- MEFs中存在异常的LaminA,且在传代培养第5代出现明显的细胞衰老现象．选用培养至第3代或第4代的MEFs细胞进行下述实验发现,Zmpste24-/-MEFs中HP1α表达量明显高于Zmpste24+/+ MEFs,而HP1β未发现明显升高;Zmpste24+/+ MEFs中HP1α以非磷酸化状态为主,但在Zmpste24-/- MEFs中磷酸化HP1α比例明显升高;2种细胞中均未检测到磷酸化HP1β. 本研究结果证明,HP1α在Zmpste24-缺陷型早老小鼠传代早期MEFs中的表达量和磷酸化水平均有升高,提示HP1α参与A型核纤层蛋白相关的早老小鼠发病机制．     

SHP-2激活突变促进小鼠MEFs细胞粘附迁移及增殖能力

目的探讨SHP-2D61G/＋和SHP-2D61G/D61G激活突变对小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）粘附迁移及增殖能力的影响,并研究其发生的机制。方法雌雄小鼠合笼交配建立SHP-2D61G/＋、SHP-2D61G/D61G激活突变的小鼠MEFs细胞,并以SV40T抗原进行永生化;细胞粘附实验检测SHP-2D61G/＋、SHP-2D61G/D61G激活突变对MEFs细胞粘附能力的影响;Transwell体外迁移实验检测SHP-2D61G/＋、SHP-2D61G/D61G激活突变对MEFs细胞的迁移能力的影响;MTT法检测SHP-2D61G/＋、SHP-2D61G/D61G激活突变对MEFs细胞增殖能力的影响;Western Blot法检测p-ERK的表达水平。结果 （1）与对照组相比,SHP-2D61G/＋、SHP-2D61G/D61G激活突变组小鼠MEFs细胞粘附的细胞数明显增多,差异具有统计学意义;（2）与对照组相比SHP-2D61G/＋、SHP-2D61G/D61G激活突变组MEFs细胞迁移的细胞数增加,差异具有统计学意义;（3）MTT结果显示,SHP-2D61G/＋、SHP-2D61G/D61G激活突变的小鼠MEFs细胞增殖能力较对照组强,差异具有统计学意义;（4）Western Blot结果显示与对照组相比,无论是刚刚贴壁还是贴壁后30 min和60 min SHP-2D61G/＋、SHP-2D61G/D61G激活突变组其p-ERK的表达水平都增加。结论 SHP-2D61G/＋、SHP-2D61G/D61G激活突变促进小鼠MEFs细胞粘附迁移及增殖能力,其发生机制主要与p-ERK的表达水平增加有关。     

MiR-1297下调PTEN的表达参与子宫内膜癌变

已有研究证明,抑癌子PTEN（phosphatase and tensin homolog）缺失或表达下调可引起子宫内膜癌变;在喉鳞状细胞癌中miR-1297可下调PTEN的表达。然而,miR-1297下调PTEN的机制,以及是否miR-1297靶向抑制PTEN参与子宫内膜癌变尚未见报道。本研究证明,miR-1297靶向抑制PTEN基因的表达参与子宫内膜癌变。收集临床病理检查确诊为子宫内膜腺癌的癌组织及癌旁组织18例。实时定量PCR（RT-qPCR）及Western印迹结果显示,与癌旁子宫内膜比较,子宫内膜癌组织miR-1297高表达,而PTEN则呈低表达或缺失。内膜癌和癌旁内膜组织中,miR-1297与PTEN表达水平的散点图分析揭示,miR-1297的表达水平与PTEN的表达水平呈明显的负相关（内膜癌：miR-1297与PTEN的相关系数r=-0.6928,P=0.0438;癌旁组织：相关系数r=-0.4085,P < 0.0001)。报告酶活性测定显示,与对照比较,pGL3-PTEN-3′-UTR-1/2/3加miR-1297模拟物共转染后,荧光素酶活性在转染的Ishikawa和ECC-1细胞中分别降低了约21%（P=0.0196）和17%（P=0.0306）;相反,转染miR-1297抑制物后,两种细胞的荧光素酶活性分别升高约59%（Ishikawa：P=0.0014）和50%（ECC-1： P=0.0025）。结果提示,miR-1297可通过特异识别PTEN mRNA的3′-UTR,抑制PTEN的表达。基因转染结合Western印迹结果证明,在原代子宫内膜细胞中,过表达miR-1297模拟物导致PTEN蛋白表达下调,而其下游底物分子--磷酸化的AKT（p-AKT）表达上调;而过表达miR-1297抑制物后,PTEN表达上调,p-AKT表达下调。Connexin V/PI双染结合流式分析证明,与对照细胞（3%细胞凋亡）比较,在子宫内膜癌细胞系Ishikawa中,敲减miR-1297表达后细胞调亡明显增加（至10%）,这可能与抑制miR-1297后PTEN的表达上调有关。上述结果提示,miR-1297在子宫内膜癌高表达,而PTEN低表达。上述结果还提示,miR-1297作为一个促癌子可通过特异识别PTEN mRNA的3′-UTR,抑制PTEN的表达,促进AKT磷酸化/激活,从而促进内膜癌的发生,这可能是子宫内膜癌变的发生原因之一。     

miR-19靶向PTEN并介导HMGB1影响小鼠动脉粥样硬化进程的机制研究

摘要 目的：探究miR-19靶向PTEN并介导HMGB1影响小鼠动脉粥样硬化进程的机制研究。方法：SPF级C57BL/6J ApoE^-/-雄性小鼠根据研究目的将实验小鼠分为对照组、AS模型组和miR-19抑制剂组。通过RT-PCR分析小鼠主动脉组织中miR-19的mRNA表达。通过蛋白印迹分析小鼠主动脉PTEN、HMGB1和AKT的蛋白表达。通过荧光素酶活性检测miR-19a与PTEN的靶向关系。通过组织学和红油O染色分析小鼠胸腹主动脉和主动脉窦中的AS斑块面积。通过RT-PCR分析小鼠主动脉主动脉弓内膜中促炎细胞因子和趋化因子的mRNA表达。通过蛋白印迹分析主动脉弓内膜中ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达。结果：AS模型组miR-19mRNA表达较对照组升高（P<0.05）,miR-19抑制剂组miR-19mRNA表达较AS模型组降低（P<0.05）。AS模型组PTEN蛋白表达较对照组降低,HMGB1和AKT蛋白表达较对照组升高（P<0.05）,miR-19抑制剂组PTEN蛋白表达较AS模型组升高,miR-19抑制剂组HMGB1和AKT蛋白表达较AS模型组降低（P<0.05）。AS模型组主动脉和主动脉窦的斑块面积较对照组增加（P<0.05）,miR-19抑制剂组主动脉和主动脉窦的斑块面积较AS模型组减少（P<0.05）。AS模型组TNF-α、IL-β、IL-6和CXCL2的mRNA表达较对照组升高（P<0.05）,miR-19抑制剂组TNF-α、IL-6、IL-β和CXCL2的mRNA表达较AS模型降低（P<0.05）。AS模型组ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达较对照组升高（P<0.05）,miR-19抑制剂组ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达较AS模型组降低（P<0.05）。结论：miR-19通过靶向调控PTEN表达激活HMGB1/PI3K/Akt信号通路,这可能会促进VSMCs的异常增殖、迁移和炎症反应,有助于AS的进展。     

PTEN通过抑制PI3K-AKT信号通路上调Rad51基因的表达

前期研究发现pten缺陷细胞的自发DNA双链断裂损伤水平显著增加.本研究探讨了抑癌基因pten对参与DNA同源重组修复的rad51基因表达的影响和机制．用实时定量PCR技术检测了PTEN野生型和缺陷型细胞rad51的表达水平.结果发现,PTEN缺失会导致rad51的表达降低．PI3K激酶为PTEN的下游负调节靶分子,使用PI3K激酶抑制剂LY294002处理缺陷型细胞后,其rad51表达升高．在PTEN野生型细胞中分别转染Flag-Akt WT（野生型）和Flag-Akt AC（组成型激活）,或在PTEN缺陷型细胞中分别转染野生型PTEN和Akt-DN（失去激酶活性的Akt）. 利用RT-PCR技术检测上述细胞rad51的表达水平,同时利用Western印迹检测上述细胞RAD51蛋白的表达水平.结果发现,转染Flag-Akt WT和Flag-Akt AC后,均能促使PTEN野生型细胞中rad51在mRNA和蛋白水平降低;在PTEN缺陷型细胞中转染野生型PTEN或Akt-DN后,rad51在mRNA和蛋白水平均升高．在PTEN缺陷型细胞中使用siRNA沉默akt后,同样导致RAD51表达升高．结果提示,PTEN可以正向调节RAD51基因表达,PI3K/Akt是其信号通路机制之一．     

PTEN、HPV16/18-E6蛋白和雌激素受体在宫颈腺癌中的表达及其临床意义

目的：探讨宫颈腺癌组织中抑癌蛋白PTEN、人乳头瘤病毒（HPV）16/18-E6蛋白和雌激素受体（ER）的表达及其临床意义。方法：采用免疫组织化学S-P法对65例宫颈腺癌组织进行PTEN、HPV16/18-E6蛋白和ER检测,对30例慢性宫颈炎组织中HPV16/18-E6蛋白和ER的表达进行检测。结果：宫颈腺癌组织细胞核中PTEN的表达显著低于癌旁宫颈腺上皮组织（P〈0.01）,96%的宫颈腺癌细胞核呈低表达,而仅35%的癌旁宫颈腺上皮呈低表达（P〈0.01）;HPV16/18-E6蛋白和ER在宫颈腺癌中的阳性表达率分别为32.1%与49.4%,均显著高于慢性宫颈炎组织（P〈0.01）;HPV16/18-E6蛋白和ER的表达与宫颈腺癌的病理学分级、临床分期无关,在宫颈腺癌中的表达呈正相关。结论：PTEN在宫颈腺癌的发生中起一定的作用,其抑癌作用环节可能在细胞核水平;部分宫颈腺癌的发病可能与HPV16/18-E6蛋白过度表达有关;部分宫颈腺癌可能属于激素依赖性,雌激素可能有协同人乳头瘤病毒致癌的作用。     

PTEN和MDM2在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的：研究PTEN和MDM2在非小细胞肺癌（NSCLC）发生发展中的临床意义。方法：采用免疫组化SP法检测56例非小细胞肺癌组织及20例正常肺组织中PTEN和MDM2蛋白的表达。结果：56例肺癌组织中PTEN表达率为48.21%（27/56）,20例正常肺组织中PTEN表达率为95%（19/20）,二者有统计学意义（p〈0.05）。PTEN表达率与肿瘤的分化程度、临床分期、淋巴结转移有关（p〈0.05）。56例肺癌组织中MDM2表达率为53.57%（30/56）,20例正常肺组织MDM2表达率为10%（2/20）,二者有统计学意义（p〈0.05）,MDM2表达率与肿瘤的分化程度、临床分期、淋巴结转移有关（p〈0.05）。在NSCLC中,PTEN和MDM2的表达呈负相关（p〈0.05）。结论：PTEN和MDM2的异常表达在非小细胞肺癌的发生发展过程中起着重要的作用。     

人肺癌细胞抑癌基因PTEN的表达与失巢凋亡的关系

应用Northern印迹、Western印迹和DNA梯形片段方法 ,研究 8株不同细胞类型的人肺癌细胞中抑癌基因PTEN的表达与失巢凋亡 (anoikis)的关系 ,并分析在此过程中蛋白激酶B(proteinkinaseB ,PKB)和粘着斑激酶(focaladhesionkinase ,FAK)的作用。发现 8株人肺癌细胞PTEN均有mRNA表达 ,且mRNA水平比较接近。但PTEN的蛋白质水平不一致 ,其中 95C、95D和A1株的PTEN蛋白未检测到 ;A549、A4、A7和L1株的PTEN蛋白有表达 ,但较低 ;而H460 株的PTEN表达较强。PTEN缺失的 95D和高表达的H460 细胞株中PTENcDNA序列分析均未发生片断缺失或点突变。RNA稳定性分析表明 ,95DmRNA稳定性较H460 明显下降。在无血清且去粘附培养条件下 ,高表达PTEN的细胞株H460 可被诱导发生失巢凋亡现象 ,在 10 %血清培养条件下可保护其免于失巢凋亡 ,而PTEN缺失的 95D等和其他PTEN低表达的细胞株却没有发生诱导失巢凋亡现象。进一步研究发现PTEN表达可降低PKB的磷酸化 ,下调FAK蛋白质的表达。结果提示各种人肺癌细胞株中PTEN蛋白表达存在显著差异。PTEN参与了失巢凋亡的发生。     

宫颈腺癌发生相关蛋白的蛋白质组学初步研究

目的：为了研究宫颈腺癌和正常宫颈组织的差异表达蛋白,为宫颈腺癌的发生和早期诊断提供有意义的生物标志物。方法：以正常宫颈组织和宫颈腺癌组织为研究对象,提取组织总蛋白,依次进行二维凝胶电泳,凝胶图象分析,基质辅助激光解吸附／离子化飞行时间质谱及生物信息学分析。Western Blot方法验证部分蛋白表达情况。结果：建立了宫颈腺癌和正常宫颈组织的二维电泳图谱,进行质谱和生物信息学分析比较鉴定宫颈腺癌和正常宫颈组织差异表达蛋白7个,与正常宫颈组织比较,宫颈腺癌表达降低的蛋白有3个,包括抑制素（inhibin-beta）,PTEN,乳铁蛋白（lactoferrin）;宫颈腺癌表达升高的蛋白有4个,包括谷胱甘肽S-转移酶（GSTT1＊0）,Homeodomain—interacting protein kinase2（HIPK2）,CD44v5,galectin-7。Western Blot方法检测结果显示inhibin-beta和PTEN在宫颈腺癌中表达变化情况与蛋白质组学结果一致。结论：宫颈腺癌和正常宫颈组织存在差异表达蛋白,这些差异表达蛋白可能是宫颈腺癌发生相关蛋白,可能作为宫颈腺癌早期诊断的标志物。     

PTEN 通过下调自噬活性抑制登革病毒2型感染

为探讨PTEN、细胞自噬与登革病毒2型（DENV-2）感染之间的关系及可能机制,本研究将DENV-2以不同感染复数（MOI）和不同持续时间感染人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）,蛋白免疫印迹法检测PTEN表达及指示细胞自噬的LC3型别转换情况;进一步构建pLenti-PTEN和pLenti-shPTEN表达质粒,包装成慢病毒,感染 HUVEC以建立稳定表达细胞系,并检测 PTEN过表达及敲低对自噬标记尤其是LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值、DENV-2 capsid蛋白和mRNA水平及子代病毒颗粒感染性的影响。结果显示,PTEN下调可抑制细胞自噬水平,继而降低DENV-2 capsid蛋白表达和子代病毒颗粒释放,提示 DENV-2感染 HUVEC发生的PTEN蛋白表达下调很可能是宿主细胞本身的一种针对DENV-2感染的保护性反应。     

Differential cellular and subcellular localization of heme-binding protein 23/peroxiredoxin I and heme oxygenase-1 in rat liver.

Heme-binding protein 23 (HBP23), also termed peroxiredoxin (Prx) I, and heme oxygenase-1 (HO-1) are distinct antioxidant stress proteins that are co-ordinately induced by oxidative stress. HBP23/Prx I has thioredoxin-dependent peroxidase activity with high binding affinity for the pro-oxidant heme, while HO-1 is the inducible isoform of the rate-limiting enzyme of heme degradation. We investigated the cellular and subcellular localization of both proteins in rat liver. Whereas by immunohistochemistry (IHC) a uniformly high level of HBP23/Prx I expression was observed in liver parenchymal and different sinusoidal cells, HO-1 expression was restricted to Kupffer cells. By immunoelectron microscopy using the protein A-gold technique, HBP23/Prx I immunoreactivity was detected in cytoplasm, nuclear matrix, mitochondria, and peroxisomes of parenchymal and non-parenchymal liver cell populations. In contrast, the secretory pathway, i.e., the endoplasmic reticulum and Golgi complex, was free of label. As determined by immunocytochemical (ICC) studies in liver cell cultures and by Western and Northern blotting analysis, HBP23/Prx I was highly expressed in cultures of isolated hepatocytes and Kupffer cells. In contrast, HO-1 was constitutively expressed only in Kupffer cell cultures but was also inducible in hepatocytes. These data suggest that HBP23/Prx I and HO-1 may have complementary antioxidant functions in different cell populations in rat liver.     

人乳头瘤病毒58型E6E7融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒,诱导表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合蛋白。方法:采用PCR方法扩增出HPV58 E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入原核表达载体pET-42a(+)中,构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测对重组质粒进行鉴定;将其转入宿主菌大肠杆菌BL21进行诱导以表达HPV58E6E7融合蛋白,并用谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化回收HPV58E6E7融合蛋白,用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达蛋白的相对分子质量及抗原性。结果:PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的目的基因大小、方向正确;HPV58E6E7融合蛋白得到高效原核表达及纯化,表达蛋白的分子大小正确,抗原性良好。结论:pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒构建成功,HPV58E6E7融合蛋白得到高效表达及有效纯化,为检测HPV58型治疗性疫苗的免疫效果提供了抗原。     

人Hepassocin的原核可溶性表达与纯化

目的：构建人Hepassocin的原核表达载体,可溶性表达并纯化得到高纯度的重组人Hepassocino方法：将人Hepassocin基因克隆到原核表达载体pET40b（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,于28℃经0．1mmol／LIPTG诱导6h,表达Ds-bC-Hepassocin融合蛋白,经镍柱纯化可溶性融合蛋白,用肠激酶切除融合蛋白的DsbC-His标签,再用镍柱纯化分离酶切后的Hepassocin,通过超滤进一步纯化并浓缩,用Western blot验证纯化后的Hepassocin。结果：构建了pET40b-Hepassocin原核表达载体,经诱导表达、亲和层析和肠激酶切除融合标签,获得了相对分子质量约32000的可溶性高纯度蛋白,Western blot鉴定证实该蛋白为不含融合标签的重组人Hepassocin。结论：实现了人Hepassocin的原核可溶性表达,通过纯化获得了较高纯度的重组人Hepassocin,为制备其单克隆抗体,进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

Investigating copper-regulated protein expression in Menkes fibroblasts using antibody microarrays

Neurodegenerative illnesses are characterized by aberrant metabolism of biometals such as copper (Cu), zinc (Zn) and iron (Fe). However, little is known about the metabolic effects associated with altered metal homeostasis. In this study, we used an in vitro model of altered Cu homeostasis to investigate how Cu regulates cellular protein expression. Human fibroblasts containing a natural deletion mutation of the Menkes (MNK) ATP7A Cu transporter (MNK deleted) were compared to fibroblasts overexpressing ATP7A (MNK transfected). Cultures of MNK-transfected (Low-Cu) cells exhibited 95% less intracellular Cu than MNK-deleted (High-Cu) cells. Comparative proteomic analysis of the two cell-lines was performed using antibody microarrays, and significant differential protein expression was observed between Low-Cu and High-Cu cell-lines. Western blot analysis confirmed the altered protein expression of Ku80, nexilin, L-caldesmon, MAP4, Inhibitor 2 and DNA topoisomerase I. The top 50 altered proteins were analysed using the software program Pathway Studio (Ariadne Genomics) and revealed a significant over-representation of proteins involved in DNA repair and maintenance. Further analysis confirmed that expression of the DNA repair protein Ku80 was dependent on cellular Cu homeostasis and that Low-Cu levels in fibroblasts resulted in elevated susceptibility to DNA oxidation.     

人造血转录因子GATA-1的克隆、表达及其对间质细胞的生物学作用

目的:构建人GATA-1全长过表达载体,对其进行过表达,并初步探讨其在人非造血细胞(人脐静脉内皮细胞、人成纤维细胞)中的生物学作用。方法:以人脐带血cDNA为模板,采用高保真PCR获得GATA-1的CDS序列,连接至pGEM-T Easy载体,构建pBPLV-GATA1慢病毒表达质粒,并对上述载体进行NheⅠ、XbaⅠ双酶切和测序鉴定,鉴定正确后,在293T细胞中进行慢病毒包装,浓缩病毒后,对我们原代分离培养的人脐静脉内皮细胞和成纤维细胞进行慢病毒感染,采用流式分选对阳性目的细胞进行纯化,阳性细胞扩增后进行Western印迹鉴定;以人包皮成纤维细胞(HFF)为研究对象,在光学及荧光显微镜下观察细胞形态变化情况,CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞表面标志表达情况。结果:双酶切和测序结果表明克隆了1242 bp的人GATA-1全长CDS序列,经Western印迹检测,GATA-1在293T细胞中获得瞬时表达;获得了人GATA-1稳转细胞株,对稳转细胞株的检测表明,GATA-1对HFF细胞增殖具有一定的抑制作用,但对HFF细胞形态及细胞表面标志CD90、CD29的表达无明显影响。结论:构建了人GATA-1慢病毒表达载体及其稳转细胞株,GATA-1蛋白对间质细胞的增殖有一定的抑制作用。     

多效生长因子（Pleiotrophin）基因沉默后的基因表达谱初步分析

多效生长因子（pleiotrophin,PTN指蛋白,Ptn指基因）是一种可同肝素结合的分泌性的生长/分化因子,具有刺激细胞粘附、迁移、存活、生长和分化等功能.我们前期研究发现,Ptn稳定沉默可以显著降低细胞的生长及成瘤能力.为进一步了解Ptn表达沉默后小鼠基因转录谱的变化,用小鼠表达谱芯片比较了对照及Ptn沉默细胞的基因表达差异.在检测的24 000个基因中,Ptn沉默后上调2倍以上的基因有240个,下调2倍以上的基因有129个.值得引起注意的是,在Ptn沉默的MEFs细胞中,同DDK综合症相关的基因家族,schlafen（Slfn）家族的Slfn 2、Slfn 3、Slfn 4以及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）家族的Mmp 3、Mmp 10、Mmp 13表达均显著上调;而可促进内皮细胞运动,参与血管发生的基因angiomotin(Amot)表达显著下调.通过研究,获得了一系列Ptn沉默后表达变化的基因信息.     

Preferential elevation of Prx I and Trx expression in lung cancer cells following hypoxia and in human lung cancer tissues

Transient/chronic microenvironmental hypoxia that exists within a majority of solid tumors has been suggested to have a profound influence on tumor growth and therapeutic outcome. Since the functions of novel antioxidant proteins, peroxiredoxin I (Prx I) and II, have been implicated in regulating cell proliferation, differentiation, and apoptosis, it was of our special interest to probe a possible role of Prx I and II in the context of hypoxic tumor microenvironment. Since both Prx I and II use thioredoxin (Trx) as an electron donor and Trx is a substrate for thioredoxin reductase (TrxR), we investigated the regulation of Trx and TrxR as well as Prx expression following hypoxia. Here we show a dynamic change of glutathione homeostasis in lung cancer A549 cells and an up-regulation of Prx I and Trx following hypoxia. Western blot analysis of 10 human lung cancer and paired normal lung tissues also revealed an elevated expression of Prx I and Trx proteins in lung cancer tissues. Immunohistochemical analysis of the lung cancer tissues confirmed an augmented Prx I and Trx expression in cancer cells with respect to the parenchymal cells in adjacent normal lung tissue. Based on these results, we suggest that the redox changes in lung tumor microenvironment could have acted as a trigger for the up-regulation of Prx I and Trx in lung cancer cells. Although the clinical significance of our finding awaits more rigorous future study, preferential augmentation of the Prx I and Trx in lung cancer cells may well represent an attempt of cancer cells to manipulate a dynamic redox change in tumor microenvironment in a manner that is beneficial for their proliferation and malignant progression.     

Mass spectroscopy identifies the splicing-associated proteins, PSF, hnRNP H3, hnRNP A2/B1, and TLS/FUS as interacting partners of the ZNF198 protein associated with rearrangement in myeloproliferative disease

ZNF198 is fused with FGFR1 in an atypical myeloproliferative disease that results in constitutive activation of the kinase domain and mislocalization to the cytoplasm. We have used immunoprecipitation of a GFP-tagged ZNF198 combined with MALDI-TOF mass spectroscopy to identify interacting proteins. P splicing factor (PSF) was identified as one of the proteins and this interaction was confirmed by Western blotting. Other proteins identified were the spliceosomal components hnRNP A2/B1, hnRNP H3, and TLS/FUS. PSF is also known to interact with PTB, another member of the hnRNP family of proteins, and we further demonstrated that PTB interacts with ZNF198. The interaction between TLS/FUS and ZNF198 was confirmed using Western blot analysis. In 293 cells expressing the ZNF198/FGFR1 fusion protein, neither PSF nor PTB binds to the fusion protein, possibly because of their differential localization in the cell.     

应用蛋白质组学技术筛选胃癌耐药相关蛋白质

胃癌多药耐药性是临床胃癌化疗失败最主要的原因之一,但其分子机制仍然不太清楚.为了寻找新的胃癌耐药相关的蛋白质,揭示胃癌多药耐药的分子机制,以胃癌细胞SGC7901和长春新碱诱导的耐药胃癌细胞SGC7901/VCR为研究对象,应用二维凝胶电泳(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)技术分离两种细胞的总蛋白质,图像分析识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)及电喷雾电离串联质谱(electrosprayionizationtandemmassspectrometry,ESI-Q-TOF)对差异表达的蛋白质点进行鉴定,蛋白质印迹和实时RT-PCR验证部分差异蛋白质在两株细胞中的表达水平,反义核酸转染技术分析HSP27(heatshockprotein27,HSP27)高表达与SGC7901/VCR耐药的相关性.得到了分辨率较高、重复性较好的两株细胞系的二维凝胶电泳图谱,质谱分析共鉴定了24个差异蛋白质点,蛋白质印迹和实时RT-PCR验证了部分差异蛋白的表达水平,反义寡核苷酸抑制HSP27表达能增加SGC7901/VCR对长春新碱的敏感性.研究结果不仅提示这些差异蛋白质如HSP27,Sorcin等可能与胃癌的多药耐药相关,而且为揭示胃癌细胞的多药耐药性产生机制提供了线索.     

核转录因子Foxp3在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的:检测小鼠黑色素瘤细胞中核转录因子Foxp3的表达。方法:用TRIzol试剂提取小鼠黑色素瘤细胞RNA,通过实时荧光定量PCR检测小鼠黑色素瘤细胞中Foxp3 mRNA的表达,通过Western印迹和流式细胞术检测小鼠黑色素瘤细胞中Foxp3蛋白的表达,通过免疫荧光检测小鼠黑色素瘤细胞中Foxp3分子的表达。结果:在小鼠黑色素瘤细胞中存在Foxp3的mRNA转录和分子表达,免疫荧光显示Foxp3定位于黑色素瘤细胞的胞核及核周部位。结论:证实了小鼠黑色素瘤细胞表达Foxp3,将为临床黑色素瘤的免疫治疗提供新的靶标和治疗策略。