DDRT—PCR方法克隆小鼠精子发生早期相关基因的EST

为了避免差异显示技术中的放射性污染。并用之于筛选。克隆精子发生早期的相关基因。分离纯化了小鼠的原始精原细胞及B型精原细胞,提取其总RNA。逆转录获得cDNA,以荧光差异显示方法筛选差异表达基因。利用斑点杂交技术对差异片段进行快速鉴定以排除假阳性,选取16条差异显著的片段做克隆测序。通过Gen-Bank/Blast比较,有7个片段属于新的EST,且均表现为在B型精原细胞中表达强度高于原始精原细胞,提交GenBank获得注册号,从中选取较有意义的3条基因片段通过半定量RT-PCR方法进一步验证其表达特征,和传统的差异显示方法比较,文中所采用的mRNA差异显示技术可快速排除假阳性结果。避免同位素标记带来的放射性污染,结果表明所获得的7个新EST均表现为B型精原细胞中高表达,这些表达升高的基因可能与其后精子发生过程中的一系列特殊现象（如减数分裂,变态成形）有关,为生精细胞的分化做物质上的准备。     

用DDRT-PCR技术克隆小鼠早期胚胎发育相关基因

mRNA差异显示 (DDRT PCR)技术在哺乳动物早期胚胎发育相关基因研究中的应用 ,因获得足够量的早期胚胎材料困难而受到限制 .通过对DDRT PCR技术各种条件参数进行优化组合 ,并对某些环节进行改良 ,以小鼠的MⅡ卵、2 细胞胚胎和 4 细胞胚胎为材料进行差异显示 ,仅以相当于5 0个卵细胞的量为起始材料 ,便得到了理想的差示结果 .从差异条带中挑取感兴趣的差异条带进行回收、阳性鉴定、亚克隆、序列分析、并在反向Northern杂交基础上设计了鉴定实验 .结果发现 ,有一个片段差异显著且是阶段性特异表达 .经GenBank检索 ,发现该片段仅有同源的EST ,其全长及功能尚不清楚 ,是一个功能未知基因 ,将该片段命名为ed1.反向Northern杂交结果表明 ,ed1在 2 细胞期胚胎中有表达 ,而在MⅡ卵及 4 细胞胚胎中均不表达 .     

克隆未知基因的新方法——mRNA差异显示技术

高等生物大约有１０万个不同的基因,但只有１５％的基因在任何个体的细胞中都表达。选择哪个基因表达决定了生命历程中的许多重要环节,如：细胞的发育、分化、应激、细胞周期调节、衰老和细胞凋亡。因此,对不同类型、不同时期细胞的基因表达情况进行比较研究,可以获得...     

一个人类精子发生相关新基因TSARG7的克隆和初步功能研究

精子发生是一个多基因参与的复杂的生理过程,虽然人们克隆了一些与精子发生相关的基因,但迄今为止,人们对精子发生的分子机制了解有限,因而克隆相关的新基因,并研究其在理论上和实践上的功能仍然十分重要。该文从人类睾丸cDNA文库出发,以小鼠精子发生相关基因mTSARG7基因为电子探针,得到1个与人类的精子发生相关的新基因TSARG7（GenBank登录号为AY513610）,该基因的cDNA全长为2463bp,含有12个外显子和11个内含子,定位在人类8号染色体8p11.21上。TSARG7编码的蛋白质含有456个氨基酸,分子量为56．295kDa,等电点为9．13,为胞浆中非分泌性蛋白,具有磷酸酰基转移酶（Hsc）的结构域,属于酰基转移酶家族的新成员,该家族成员具有脂质合成的功能。TSARG7和mTSARG7,TSARG7和Au041707分别具有97％的同源性。该基因在睾丸中特异表达,亚细胞定位在胞浆中表达。TSARG7 mRNA在13岁的睾丸中开始表达,并且随着精子的发生和性成熟而稳定增加,热应急实验显示该基因的表达与温度相关。综上所述,该文克隆了人的1个新基因,该基因与精子的发生和性成熟相关。     

兔胚胎时期特异性基因相关新片段的克隆

阶段特异性基因的表达是早期胚胎发育过程中的重要事件,对植入前胚胎基因表达模式的研究是进一步研究植入前胚胎发育调控机制的前提。本实验利用mRNA差异显示技术来研究兔(Oryctolagus cuniculus domestica)植入前各期胚胎的基因表达差异。在获得的42个阳性阶段特异性表达的基因中,有5个在NCBI和EMBL数据库中没有同源序列,登录EMBL,申请了登录号。这些新基因片段都是桑葚期特异表达的基因,而且在以后的囊胚期也有表达。兔由母源型调控向合子型调控的过渡是在8～16细胞期开始的,在桑葚期开始表达的这些基因片段应该是兔胚胎时期特异性基因。这些基因的克隆将为进一步研究兔的植入前胚胎发育模式奠定基础。     

用改进的DDRT-PCR技术进行人胚差异基因筛选

介绍一种从不同类型细胞或不同生长状态细胞中分离差异表达基因的快速高效mRNA差异显示技术,其特点是利用Ready-To-Go RT-PCR反应珠和Ready-To-Go RAPD分析珠进行mRNA差异显示分析,使取样步骤降至最低程度,减少了潜在的取样误差和外源DNA污染,并确保每次反应的高度重复性.通过银染测序胶分析差异显示的cDNA带,便于DNA回收和进一步克隆.用此方法分析人胚发育早期不同阶段基因的差异表达,选用6条随机引物对3、4和5周龄人胚进行mRNA差异显示分析,从2 000多条带中共分离出14个差异产物,经二次扩增及反向RNA印迹确证其中6个片段为发育不同阶段差异表达基因.     

快速捕获基因的方法——差异显示法

差异显示法是近年来出现的一些快速捕获基因的新方法,它的不断改进与完善,使基因表达的研究提高到一个新的水平。本对该方法的模板、引物、差异显示和鉴定等关键问题进行了论述。     

精子发生相关基因的研究进展

哺乳类动物的精子发生历经有丝分裂、减数分裂和精子形成三个阶段,这一特殊的细胞分化过程受多种因素的调控,而生精细胞内基因水平的调节,在精子发生过程中起着决定性的作用.许多生精细胞特异性的基因或转录具有发育阶段特异性表达特征,参与精子发生过程中特异的细胞分化活动,如减数分裂、遗传物质重组、染色质的浓缩和发育后期的一系列形态变化.近年来随着基因克隆、表达及功能研究技术的发展与应用,发现了许多精子发生的相关基因,有的已被证明在精子发生中起重要作用.然而对这一过程中许多现象的关键基因还所知甚少,需要进行更加广泛深入的研究.本文旨在较全面地综述这一领域研究的最新进展,着重讨论了与精子发生有关的转录因子基因、细胞周期相关基因、原癌基因、细胞凋亡相关基因、核蛋白转型相关基因方面的研究,为从事该领域研究的工作者提供参考信息.     

鼠精子发生时期差异表达基因的克隆(英文)

为了分离鼠精子发生时期表达的基因,本文采用mRNA差异显示法,以鼠的粗线期卵母细胞为对照,检测了出生后60天和16天鼠的睾丸。得到12个有差异的片段(Fig.1&Table 1)。克隆测序结果表明,其中5个与已知基因非常吻合,另外6个与一些未知功能的cDNA、ESTs有较高的同源性,只有1个与已知序列没有同源性。Northern杂交分析显示sp1和sp8主要在成年鼠睾丸表达(Fig.4B)。采用5RACE对sp1的cDNA进行了全长分析,该基因编码一个推测是高度磷酸化蛋白的541个氨基酸(Fig.2),其中包括一个核定位信号,无论在核苷酸水平上,还是在氨基酸水平上均没有明显的同源性,仅在2个蛋白区有少量同源氨基酸(Fig.3)。该基因在20-60天龄鼠的睾丸均有表达,并且具有很高的组织特异性只在睾丸里表达(Fig.4A)。因而,这个基因有可能参与减数分裂及其以后的整个过程。可以认为这是一个新基因。我们把它命名为peat (predominantly expressed in adult testis)。     

小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因mTSARG3的克隆

从在小鼠隐睾和正常睾丸对照中表达量有明显差异的EST片段 (BE6 4 4 5 37)出发 ,利用GeneScan软件分析该片段所在染色体基因组序列 ,获得一个包含该EST的新基因序列。设计该基因特异性引物从小鼠睾丸cDNA文库中进行PCR扩增 ,分离出小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因mTSARG3(GenBank登录号为AF4 192 92 )。该基因定位于小鼠 7号染色体 7E1 E2区带 ,全长为 11kb ,cDNA全长为 132 8bp ,包含 8个外显子 ,编码由 316个氨基酸组成的、分子量为 36kD的蛋白质。该蛋白质含有DnaJ区和DnaJ- c区 ,与热激蛋白 4 0家族多种蛋白质有较高相似性 ,其中与小鼠DJB4 - MOUSE在 336aa的范围内有 4 6 %的相似性 ,属热激蛋白 4 0家族新成员。多组织RT PCR和Northern印迹结果显示 ,该基因在小鼠睾丸组织高表达 ,转录本大小约为 1.35kb ;Southern杂交结果显示 ,该基因在小鼠正常睾丸和隐睾组织无缺失和重排。实验结果证明成功克隆到了一个小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因mT SARG3。     

小鼠生精相关基因SRG4的cDNA克隆及在小鼠各发育阶段的表达

从大鼠精子尾部基因Spag4出发,在dbEST数据库中同源搜寻与大鼠Spag4基因编码氨基酸同源性较高的表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST),找到两个在小鼠精母细胞中表达的ESTs,BG101130和BG100990。通过电子杂交得到1155bp的片段,包含了小鼠假想基因AK006225的全部序列,定位于2H1-H2,其开放阅读框为87～1133bp,并被RT-PCR所证实,将该基因命名为小鼠生精相关基因4(Sperrnatogenesis Related Gene4,SRG4,GenBank登录号为AY307077)。SRG4基因推定编码348个氨基酸,有一个coiled-coil区,可能是一个跨膜蛋白。该基因与人类同源基因TSARG4同源性为74％(277／374),与大鼠Spag4同源性为45％(103／224)。多组织RT-PCR和Northern blot结果显示,SRG4在睾丸中特异性表达。RT-PCR结果发现,小鼠出生后2周内,SRG4表达量极低;3周开始时SRG4大量表达,到4∽5周时表达量最高。该结果提示。SRG4基因可能在小鼠精子形成过程中发挥着重要的作用。     

mRNA差异显示技术克隆中国葡萄属野生种核糖体RNA基因

克隆功能基因是研究植物基因结构及功能的重要途径,利用mRNA差异显示技术,筛选获得了中国葡萄属野生种华东葡萄白河-35-1在人工接种白粉菌前后差异表达基因的cDNA片段Vprdrf4。经Northern杂交验证,该片段为正调控片段,Blaset检索表明与真核生物核糖体RNA基因的同源性高达90%以上,GenBank登录号为CD347664。     

小鼠生精细胞凋亡相关基因的分子克隆

利用手术隐睾的方法建立小鼠生精细胞凋亡模型,通过光镜、电镜以及原位末端标记法（TUNEL）证实手术隐睾可成功诱导小鼠生精细胞凋亡;在此基础上应用抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization,SSH)对隐睾和对侧睾丸组织的基因表达进行研究,在隐睾组织中分离得到24个高表达cDNA片段,经克隆、PCR和酶切鉴定、测序及匹配分析,证实24个cDNA片段均为新的ESTs,已被GenBank接受并给予新序列编号。任选其中3个cDNA片段作为探针进行Northern印迹杂交,证实它们在隐睾和对侧睾丸组织有差异表达。上述结果提示手术隐睾是研究生精功能降低和睾丸组织凋亡过程中基因表达的适合实验模型,所分离的差异表达cDNA序列可能与生精细胞凋亡密切相关。     

用基因芯片结合荧光差异显示—PCR筛选和识别胃腺癌转移相关的基因

使用来源于同一个胃腺癌病人的原发灶RF－1（ATCC编号：CRL－1864）和转移灶RF－48细胞系（ATCC编号,CRL－1863）作为研究肿瘤转移分子机制的模型,RF－1（实验组）和RF－48（对照组）的mRNA通过逆转录方法,将Cy3和Cy5两种荧光染料分别标记到两种细胞的cDNA上,制备成cDNA探针,并与表达谱芯片（双点4096条基因）进行杂交与扫描,重复2次实验,利用计算机数据处理判断基因是否在上述两种细胞中有表达差异,共筛选出差异表达的基因共138条,其中81条在RF－48细胞中表达明显上调,57条在RF－48细胞中表达显著下调,同时也通过荧光差异显示－PCR（FDD－PCR）技术,克服了45个涉及胃腺癌转移相关基因,包括未被发现的基因3个,在两种筛选方法中都存在差异表达的基因共有7条,对部分可能与肿瘤志移机制有关的差异表达基因的作用进行了分析和讨论,基因芯片技术可高通量,大规模地研究基因表达水平,FDD－PCR技术可克隆出未发现的新基因,二者结合,初步筛选出与转移相关的基因,有助于揭示胃腺癌转移的分子机制。     

人、鼠原肠形成蛋白基因的克隆和初步分析

目的：分析原肠形成蛋白（TSG）在几个发育阶段的人和小鼠睾丸中的差异表达。方法：应用cDNA微阵列技术对成人和胚胎睾丸进行基因表达图谱分析,获得在成人高表达、胚胎低表达的人TSG的全长基因;利用RT-PCR,从4周龄小鼠睾丸中克隆出小鼠TSG基因,用地高辛标记的探针进行原位杂交,检测小鼠TSG在睾丸中的表达。结果：人TSG在成人睾丸中高表达,在胚胎中低表达;小鼠TSG仅在小鼠睾丸生殖细胞中表达,在间质细胞中不表达。结论：小鼠睾丸TSG与骨形态发生蛋白（BMP）可能同步表达,提示在小鼠精子发生中也可能存在一条由TSG信号激活BMP的传导途径。