解脂耶氏酵母TSR1基因的定点诱变

对解脂耶氏酵母与蛋白质分泌有关的TSR1基因进行寡核苷酸介导的定点诱变,限制性内切酶切割的拼接,得到了该基因的一系列缺失突变体。这为进一步研究TSR1基因不同结构域的功能奠定了基础。     

解脂耶氏酵母表达系统研究进展

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是非常规酵母中具代表性的一种,它底物广泛,尤其能利用有机酸（柠檬酸、异柠檬酸）,蛋白类（蛋白酶、脂肪酸、酯酶、磷酸酶、α-甘露糖苷酶、RNase）。烷烃类廉价物质作为底物分泌大量的代谢产物,自上世纪40年代被发现以来,越来越受到研究者的重视,并于上世纪90年代被开发成为一种新的酵母表达系统,用于42种异源蛋白的高效表达。综述了解脂耶氏酵母表达系统及其特点,有利于研究者从转录和翻译的水平研究异源蛋白在此菌中的表达分泌路径以及寻找到调控型启动子。     

解脂耶氏酵母tsr1突变体的构建

将解脂耶氏酵母与蛋白质分泌有关的TSR1基因编码区部分缺失的DNA片段转化一株解脂耶氏酵母,通过体内同源重组,部分缺失的外源tsr1片段取代了酵母染色体上的正常的TSR1基因,从而获得tsr1的转化子。Southern杂交结果表明,用该法成功地构建了tsr1突变体,这为进一步研究解脂耶氏酵母TSR1基因的功能奠定了基础。     

植酸酶phyA基因在解脂耶氏酵母po1h中的表达

本实验通过PCR方法从毕赤酵母GS115-phyA中扩增出不含有信号肽及内含子的黑曲霉NRRL3135植酸酶phyA基因,并将其克隆到表达载体pINA1297中,得到表达载体pINA1297-phyA,利用醋酸锂转化法将线性化载体转化到解脂耶氏酵母po1h中,通过YNBcasa和PPB平板筛选出阳性表达菌株,阳性菌株在YM培养基中28℃培养6d后酶活达到最大为636.23U/mL。表达上清经SDS-PAGE分析得到表达植酸酶分子量约为130kDa,但通过去糖基化处理后其分子量变为51kDa,与理论值相符。经过酶学性质分析表明重组植酸酶最适pH为5.5,最适温度为55℃,该酶在pH2.0~8.0处理1h后仍有较高酶活,并且90℃处理10min后还有86.08%的残留酶活,其抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶能力也较强。     

带His-tag的解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2在毕赤酵母中的表达及纯化

将去自身信号肽并且N-端带6×His标签的YlLip2基因克隆至表达载体pPIC9K中,电转化GS115获得高效表达脂肪酶His₆-YlLip2的基因工程菌。筛选到的阳性克隆子摇瓶发酵脂肪酶活力最高为400U/ml。对重组毕赤酵母在10 L发酵罐中表达His₆-YlLip2的分批补料发酵工艺进行了初步优化,探讨了培养基、pH、温度对生物量和重组蛋白表达量的影响。结果表明:采用FM22培养基,诱导温度为25℃,pH 5.0,甲醇诱导114 h后His₆-YlLip2的最高酶活力达到3160U/ml。SDS-PAGE分析表明,蛋白的分子量大约为38kDa。重组的His₆-YlLip2经镍柱一步纯化后的纯度达到95.43%,比酶活达到4250U/mg。     

利用a凝集素在酿酒酵母表面展示解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2

[目的]将解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2展示在酿酒酵母表面,构建全细胞催化剂.[方法]采用PCR方法扩增得到解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2成熟肽编码基因LIP2,将其连接到AGA2基因的下游构建表面展示载体pCTLIP2.分别以橄榄油、三丁酸甘油酯和对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)为底物检测展示的脂肪酶酶活.在此基础上,对野生菌及工程菌的酶学性质进行比较.[结果]展示Lip2的酿酒酵母重组菌株在半乳糖的诱导下,表现出水解橄榄油、三丁酸甘油脂以及pNPP的活性,20℃诱导72h时酶活达到最高,为182 U/g干细胞.对展示的Lip2的酶学性质研究表明,其最适温度为40℃,最适pH为8.0,温度稳定性比自由酶有所提高,50℃温浴4 h后残余酶活为其最大酶活的23.2%.以不同碳链长度的对硝基苯酚酯为底物检测其底物特异性,结果显示其水解C8,C12,C16对硝基苯酚酯活性相近,均远高于对硝基苯酚丁酸酯(C4)的水解酶活.[结论]对于Lip2,a凝集素系统是一个有效的展示系统,利用该系统成功将Lip2展示在酿酒酵母表面,从而构建了酿酒酵母全细胞催化剂,该全细胞催化剂具有良好的潜在应用前景.     

解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) ATCC30162脂肪酶基因Yllip1和Yllip2的结构及表达特征

以目前报道油脂产量最高的解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica)ATCC 30162为对象,采用逆转录PCR扩增到脂肪酶编码基因Yllip1和Yllip2,编码产物分别为816和549个氨基酸。保守结构域预测表明,Yllip1包含Patatin类磷脂酶和功能未知的DUF3336结构域,而Yllip2包含lipase_3类脂肪酶结构域,且这两个蛋白都具有1～4个跨膜区域。与不同物种来源的脂肪酶同源蛋白的多序列比对表明Yllip1和Yllip2分别包含8和6个保守区域,这些生物信息学分析表明这两个来源于解脂耶氏酵母的脂肪酶作用底物可能分别为细胞内膜磷脂和酰基甘油酯。荧光定量PCR分析表明:培养基中添加油酸在短期内(6 h)诱导了这两个脂肪酶基因Yllip1和Yllip2的显著上调表达,表明它们可能参与了酵母分解利用油酸的生化过程。     

解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)ATCC30162脂肪酶基因Yllip1和Yllip2的结构及表达特征

以目前报道油脂产量最高的解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica) ATCC 30162为对象,采用逆转录PCR扩增到脂肪酶编码基因Yllip1和Yllip2,编码产物分别为816和549个氨基酸。保守结构域预测表明,Yllip1包含Patatin类磷脂酶和功能未知的DUF3336结构域,而Yllip2包含lipase＿3类脂肪酶结构域,且这两个蛋白都具有1～4个跨膜区域。与不同物种来源的脂肪酶同源蛋白的多序列比对表明Yllip1和Yllip2分别包含8和6个保守区域,这些生物信息学分析表明这两个来源于解脂耶氏酵母的脂肪酶作用底物可能分别为细胞内膜磷脂和酰基甘油酯。荧光定量PCR分析表明:培养基中添加油酸在短期内(6 h)诱导了这两个脂肪酶基因Yllip1和Yllip2的显著上调表达,表明它们可能参与了酵母分解利用油酸的生化过程。     

解脂耶氏酵母脂肪酶LIP4和LIP5在毕赤酵母中的异源表达及酶学性质

【目的】克隆解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)脂肪酶LIP4和LIP5的cDNA序列,研究其基因结构,并实现其在毕赤酵母中的功能表达,以探讨其酶学性质。【方法】利用反转录PCR首次扩增LIP4和LIP5的编码基因,用SignalP 3.0分析其基因序列,然后分别构建胞内表达载体pPIC3.5K-Lip4、pPIC3.5K-Lip5和胞外表达载体pPIC9K-Lip4、pPIC9K-Lip5,将其转入毕赤酵母GS115中表达,以NTA树脂纯化酶蛋白,研究其酶学性质。【结果】cDNA序列测序结果显示两者均不含内含子,酶蛋白的氨基酸序列中含有典型脂肪酶的活性三联体结构和五肽保守区;酶学性质研究表明,两者的最适底物均为癸酸(C8)对硝基苯酚酯,最适pH为7.0,最适温度为40℃,但LIP4对pH和温度更敏感;两者均能被Ca2+激活,且LIP5还能为Mg2+激活,但均被Hg2+、乙二胺四乙酸(EDTA)和苯甲基磺酰氟(PMSF)强烈抑制。【结论】首次克隆了解脂耶氏酵母脂肪酶LIP4和LIP5编码基因,实现了其在毕赤酵母中的活性表达,并初步研究了其酶学性质,为上述脂肪酶的应用及进一步深入研究解脂耶氏酵母脂肪酶家族奠定了基础。     

黑曲霉中内切菊粉酶基因及其全合成基因在解脂耶氏酵母中表达的比较

利用酵母密码子偏爱性将黑曲霉(Aspergillus niger)中的内切菊粉酶(Endoinu linase)基因通过基因全合成的方式合成为酵母密码子偏爱性的内切菊粉酶基因。然后将原始和全合成的内切菊粉酶基因克隆到解脂耶氏酵母表达载体PINA1296上,得重组解脂耶氏酵母表达载体pHBM2020、pHBM2021,将两种质粒分别转化解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)CLIB725,筛选得到重组解脂耶氏酵母CLIB725(pHBM2020)、CLIB725(pHBM2021),将两种重组酵母摇瓶培养,经SDS-PAGE、测酶活检测表明两种基因在解脂耶氏酵母中都有表达,全合成菊粉酶比原始菊粉酶酶活要高。     

扩展青霉脂肪酶基因克隆、密码子优化及表达

【目的】克隆扩展青霉脂肪酶基因,实现具强催化活性的脂肪酶的异源高效表达。【方法】利用RT-PCR扩增扩展青霉CICC 40356脂肪酶(PEL)cDNA序列,利用重叠延伸PCR(Over-lap extension PCR)技术对PEL的10个稀有氨基酸密码子和表达载体pPIC9Kα信号肽的9个氨基酸密码子进行了优化,获得了改造过的脂肪酶基因PELM和表达载体pPIC9KM。并构建了带有脂肪酶自身信号肽的pPIC9K-PEL1、pPIC9KM-PELM1、pPIC3.5K-PEL1、pPIC3.5K-PELM1和不带有脂肪酶自身信号肽的pPIC9K-PEL2、pPIC9KM-PELM2六个重组质粒。利用对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)为底物检测工程菌脂肪酶的酶活。在此基础上,对工程菌的酶学性质进行了研究。【结果】扩展青霉脂肪酶基因cDNA序列分析结果表明该序列与已报道PEL cDNA序列仅相差3个碱基,同源性高达99%。6个重组工程菌在甲醇诱导下,均表现出pNPP水解活性,28℃诱导100h时酶活达到最高,发酵上清的酶活分别为3.65 U/mL、30.49 U/mL、90.85 U/mL、212.05 U/mL、15.29 U/mL、76.32 U/mL。SDS-PAGE结果表明重组脂肪酶分子量均约28 kDa。酶学性质研究表明,重组脂肪酶PELM最适温度为35℃,最适pH为9.5,在pH7.0-10.0范围内该脂肪酶均较稳定,Ca2+和Mg2+对其有激活作用,Fe2+、Zn2+、Cu2+则有抑制作用,EDTA能使之快速失活。以不同碳链长度的对硝基苯酚酯为底物检测其底物特异性,结果显示其对中链酯(C8-C12)有较强的水解能力,最适底物为为C8的pNP酯。【结论】密码子优化后的扩展青霉脂肪酶基因在毕赤酵母中获得理想的表达,其酶活力比未优化的野生脂肪酶的提高了2.3-2.5倍,表明定点突变对其基因本身更改特有稀有密码子是实现PEL功能蛋白的异源高效表达的有效策略之一。     

洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的基因改造及其在毕赤酵母中组成型和诱导型的表达

【目的】克隆洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶基因,实现其在毕赤酵母中快速、安全和稳定性的大量表达。【方法】首先设计引物扩增B.cepacia脂肪酶基因,然后应用生物信息学方法分析B.cepacia和毕赤酵母整体密码子使用情况、脂肪酶基因信号肽及密码子偏好性。在此基础上,运用overlap PCR对脂肪酶基因中低使用频率密码子进行改造并同时降低基因的G+C含量,获得优化的脂肪酶基因。再分别把原始和优化的脂肪酶基因导入载体pGAPZα和pPIC9K中,获得组成型表达载体pGAPlipW、pGAPlipO和诱导型表达载体pPIClipW、pPIClipO。分别将所得4种载体转入GS115中,得到一系列工程菌。经发酵和NTA树脂纯化后,对脂肪酶的酶学性质进行了初步研究。【结果】4种工程菌的脂肪酶活力分别为pPIClipW37.8U/mL,pPIClipO129.5U/mL,pGAPlipW40.2U/mL和pGAPlipO184.3U/mL。改造后脂肪酶活力比原始脂肪酶提高了4.6倍。酶学性质研究表明,脂肪酶在60℃时活力最高,在40℃-65℃范围内非常稳定;脂肪酶最适pH值为9.0,在pH6.0-pH10.0范围均表现很好的稳定性。【结论】通过overlap PCR改造后的脂肪酶显著提高了其在毕赤酵母中的表达效率,且GAP启动子比AOX1启动子更适合于B.cepacia脂肪酶的表达。大量表达的重组脂肪酶的性质与野生脂肪酶的性质相同,符合生产要求。     

密码子优化策略在异源蛋白表达中的应用

酶在医疗和生物药物方面有着广泛的应用,不仅可以用来治疗各种疾病,还在临床诊断和人体健康等方面有着重要的影响。利用微生物来表达异源蛋白已经成为获取酶最简单快速的方法。为获得高浓度和高质量的异源蛋白,常用的方法是对基因序列进行密码子优化。传统的密码子优化策略主要基于密码子偏好性和GC含量,忽略了翻译动力学和代谢水平等复杂多样的变化因素。文中从基因水平、转录水平、翻译水平、翻译后水平以及代谢水平等多方面考虑出发,提供了一个较为全面的密码子优化策略,主要包括密码子偏好性、密码子协调性、密码子敏感性、调整基因序列结构以及一些其他影响因素。同时对每种策略的内容、理论支持以及应用范围等方面作了全面的总结,并将各策略的优缺点进行了系统的比较,为异源蛋白表达提供了全方位、多层次、多选择的优化策略,也为酶工业和生物药物等方面提供参考。     

普通变形杆菌位置非特异性脂肪酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

【目的】本文拟克隆普通变形杆菌(Proteus vulgaris)脂肪酶基因,并实现其在大肠杆菌中的高效表达,并检验外源表达脂肪酶的催化性质。【方法】通过PCR方法,从P.vulgaris基因组中扩增其脂肪酶基因(PVL),并将其开放读码框区域连接到表达载体pET-DsbA及pMBP-P上,在大肠杆菌中用IPTG诱导表达。我们对培养基组分及培养条件进行优化,以获得最高的酶产量。用Ni柱亲和层析法对所得重组脂肪酶进行纯化,并考察其酶学性质。【结果】PVL基因编码区含864个碱基,编码含287个氨基酸的酶蛋白。该序列在GenBank的登录号为FJ643627。PVL基因在大肠杆菌BL21内诱导表达的最佳条件为:在pH8.5的LB培养基中添加15g/L葡萄糖及200mg/L氨苄青霉素,在培养至OD600为1.2时加入100mg/LIPTG,15℃诱导15h,最高酶活达到192.2U/mL。通过亲和层析纯化了重组脂肪酶,得到一个约31kDa的蛋白条带。外源表达的脂肪酶的催化特性与野生菌脂肪酶相似,具有催化的位置非特异性,对长链脂肪酸酯亲和性最高。【结论】PVL基因在大肠杆菌中的高效表达为P.vulgaris脂肪酶的进一步研究与应用奠定基础。     

Expression,purification, crystallization,and diffraction analysis of a selenomethionyl lipase Lip8 from Yarrowia lipolytica

Yarrowia lipolytica is a nonconventional model micro-organism with multiple biotechnological applications. It is also considered to be an excellent producer for lipase. Genome survey shows that Y. lipolytica possesses various paralogs of genes coding for extracellular, cell-bound, and intracellular lipolytic enzymes. However, little structural information on these isoenzymes is available. With the aim to facilitate crystal structure solution of Lip8, one of the most valuable lipases from Y. lipolytica, a less conventional protein expression technique—selenomethionyl protein expression was used to produce recombinant selenomethionine (SeMet)-Lip8 in Escherichia coli. Finally, three Met residues of Lip8 were all substituted with SeMet. A total of 72?mg of SeMet-Lip8 was obtained from a liter of the SeMet medium. Using sodium acetate as a precipitant and ammonium sulfate as an additive, crystals of the SeMet-Lip8 with 1.9?Å were successfully cultured through hanging-drop vapor diffusion method. The estimated crystal dimensions were 0.11?×?0.11?×?0.14?mm². The crystal belonged to the space group I4 with unit cell parameters a?=?b?=?128.87?Å, c?=?171.77?Å, α?=?β?=?γ?=?90°. It is the second member of lipase crystal family from Y. lipolytica. This work will provide a platform for further studying lipases from a structural insight.     

Homology-independent genome integration enables rapid library construction for enzyme expression and pathway optimization in Yarrowia lipolytica

Yarrowia lipolytica is an important oleaginous industrial microorganism used to produce biofuels and other value-added compounds. Although several genetic engineering tools have been developed for Y. lipolytica, there is no efficient method for genomic integration of large DNA fragments. In addition, methods for constructing multigene expression libraries for biosynthetic pathway optimization are still lacking in Y. lipolytica. In this study, we demonstrate that multiple and large DNA fragments can be randomly and efficiently integrated into the genome of Y. lipolytica in a homology-independent manner. This homology-independent integration generates variation in the chromosomal locations of the inserted fragments and in gene copy numbers, resulting in the expression differences in the integrated genes or pathways. Because of these variations, gene expression libraries can be easily created through one-step integration. As a proof of concept, a LIP2 (producing lipase) expression library and a library of multiple genes in the β-carotene biosynthetic pathway were constructed, and high-production strains were obtained through library screening. Our work demonstrates the potential of homology-independent genome integration for library construction, especially for multivariate modular libraries for metabolic pathways in Y. lipolytica, and will facilitate pathway optimization in metabolic engineering applications.     

短小芽孢杆菌HZbp脂肪酶基因的克隆表达

以短小芽孢杆菌HZbp总DNA为模板以PCR的方式获得512 bp的脂肪酶基因,并在该基因的两端引入了EcoR1和Sal1的酶切位点,将该基因与大肠杆菌表达质粒pSE380连接,获得重组质粒pSE380-BPL。重组质粒转入大肠杆菌表达细胞株BL21,获得工程菌株BL21-BPL。序列分析显示所克隆的基因具有脂肪酶的保守G-X-S-X-G序列,SDS-PAGE电泳显示该脂脂肪酶的分子质量约为20 kDa。在LB培养基中,IPTG诱导浓度为1.0 mmol/L,33℃诱导培养10 h后,发酵液酶活达到8 U/mL。