BRAF和TP53基因热点突变的构建

目的:构建BRAF和TP53基因多个位点的点突变质粒,为进一步研究其在肿瘤形成中的作用奠定基础。方法:以HEK-293T基因组DNA为模板构建含BRAF600、TP53175和TP53248位点的野生型质粒,利用MutanBESTTM定点突变方法获得含BRAFV600E、TP53R175C和TP53R248W等突变位点的突变型质粒,并进行DNA测序鉴定。结果:DNA测序结果显示构建的三个点突变与实验设计完全一致。结论:成功构建了BRAFV600E、TP53R175C和TP53R248W三个具有不同突变位点的突变型质粒,MutanBESTTM定点突变技术是一种简单、快速、高效的基因定点突变方法。     

甲状腺乳头状癌合并桥本氏甲状腺炎的BRAF基因表达及侵袭性

目的:比较甲状腺乳头状癌合并桥本氏甲状腺炎与不合并桥本氏甲状腺炎的BRAFV600E基因表达以及侵袭性的区别。方法:2011年9月到2013年9月四川大学华西医院手术治疗并有BRAFV600E基因测定的甲状腺乳头状癌患者226名,均有病理证实。其中合并桥本氏甲状腺炎者50例为研究组,同期随机抽取50例不合并桥本氏甲状腺炎者作为对照组。比较两组性别、年龄、肿瘤大小、数量、BRAFV600E基因表达以及甲状腺外侵犯和淋巴结转移与侵袭性相关的因素的区别。结果:甲状腺乳头状癌合并桥本氏甲状腺炎在男女性别,发病年龄、肿瘤大小上和对照组相比无差异(P0.05);BRAFV600E突变率、甲状腺外侵犯和淋巴结转移都较对照组更低(P0.05)。BRAF基因突变阳性组甲状腺外侵犯和淋巴结转移率较BRAFV600E基因突变阴性组更高(P0.05)。结论:BRAFV600E基因突变的甲状腺乳头状癌患者有更高的甲状腺腺外侵犯和淋巴结转移。甲状腺乳头状癌合并桥本氏甲状腺炎较不合并桥本氏甲状腺炎有着更低的BRAFV600E突变率,更低的甲状腺外侵犯和淋巴结转移。     

结膜恶性黑色素瘤3例临床病理分析及文献复习

目的探讨结膜恶性黑色素瘤的临床特点及病理学特征,并进行文献复习。方法回顾性分析3例结膜恶性黑色素瘤的临床特点、病理学特征、免疫表型特点及分子生物学特点。结果老年男性患者多见,病程2个月～1年,有近期肿物增大过快病史。肿瘤细胞呈上皮样细胞型、梭形细胞型或者二者混合型,均可见黑色素沉着。免疫表型:3例HMB45、melan A、S-100、cyclinD1和vimentin均为阳性,只有2例p53阳性,3例Ki-67增殖指数25%～60%。分子病理:3例病例中有1例发生了BRAF V600E突变,均未检测到c-Kit突变。3例患者均进行局部肿瘤切除,随访3个月至5年均未复发、转移。结论结膜的恶性黑色素瘤临床较罕见,镜下形态多样,有时缺乏黑色素,melan-A、HMB-45、S-100、cyclin D1、vimentin等免疫组织化学标记可以辅助诊断,分子检测BRAF V600E和c-Kit也有提示作用,早期发现并进行局部肿瘤切除术,效果较好。     

甲状腺乳头状癌中EGFR与BRAF V600E免疫反应性增强

目的探讨表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变、EGFR与BRAF V600E表达在甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)中的临床病理意义。方法应用蝎形探针扩增阻遏突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)和免疫组织化学方法分别检测99例PTC组织中EGFR基因突变和EGFR、BRAF V600E蛋白表达情况,回顾性分析它们与年龄、性别、淋巴结转移、TNM分期等临床病理参数间的关联性。结果淋巴结转移PTC组EGFR、BRAF V600E水平均高于无淋巴结转移者,年龄、性别、肿瘤最大径、有无甲状腺外侵及TNM分期与EGFR和BRAF V600E水平无相关性,EGFR和BRAF V600E在PTC组织中的水平不存在相关性。99例PTC癌组织中均未见有EGFR基因Exon18-21的常见突变,与基于癌症基因组图谱数据库关于PTC的EGFR基因分析结果一致。结论 EGFR高表达与PTC淋巴结癌转移相关,但并非由Exon18-21常...     

Raf激酶抑制剂及其耐药机制研究进展

Ras/Raf/MEK/ERK 通路是调节细胞生长与增殖的重要信号传导通路。在Ras/Raf/MEK/ERK 通路中某些成员的突变往往与恶性肿瘤的发生密切相关。B-Raf 激酶是该通路中Raf 家族最重要的亚型,其主要突变形式B-RafV600E 在黑色素瘤等多种肿瘤中高度表达。选择性B-RafV600E 抑制剂vemurafenib 和dabrafenib 的上市使得晚期黑色素瘤的治疗进入新纪元,但是耐药性和副作用依然限制了二者的使用。综述目前Raf 激酶抑制剂耐药性与副作用产生机制以及Raf 激酶抑制剂的最新研究进展。     

BRAF基因突变情况与结直肠癌发病的相关性及其临床意义分析

探讨结直肠癌患者BRAF基因突变情况及其临床意义。取2014年2月至2017年2月在我院保存的结直肠癌手术标本174例,采用直接测序技术检测BRAF基因突变情况。174例患者标本中,检测到BRAF基因突变8例,突变率仅为4.60%,突变类型主要以Exon15-codon600突变为主(87.50%);低分化患者BRAF基因突变率为20.00%,明显高于中高分化患者(p0.05);BRAF基因突变与患者年龄、性别、肿瘤部位、TNM分期、病理类型、肿瘤直径及淋巴结转移无明显关系(p0.05);术前CA199升高患者BRAF基因突变率为10.17%,明显高于术前CA199正常者(p0.05)。结直肠癌患者BRAF基因突变率较低,其与肿瘤分化程度有关,且与术前CA199有一定关系,值得进一步研究。     

甲状腺乳头状癌BRAF基因突变检测及临床价值

该研究旨在探讨甲状腺乳头状癌患者中BRAF基因突变的情况,并分析其临床价值。选取2018年1月至2019年3月我院收治的BRAF基因检测患者813例,对甲状腺乳头状癌BRAF基因突变进行检测。经研究证实,在T3指标及T4指标方面,组4和组3间存在统计学差异(P0.05);在TSH指标方面,组1和组2间存在统计学差异(P0.05);在TGAb、TPOAb指标方面,各组间均存在统计学意义(P0.05);中央区转移阴性与阳性率低于非中央区转移(P0.05);颈侧区转移BRAF基因阴性及阳性发生率高于非颈侧区转移阴性及阳性发生率,颈侧区转移阴性及阳性发生率高于非中央区阴性及阳性发生率(P0.05);有无中央转移患者年龄有统计学意义(P0.05)。结果表明,甲状腺乳头状癌合并BRAF V600E基因突变与TSH、TGAb、TPoAB有明显关联,BRAF V600E基因阳性患者中肿瘤更易发生侵犯。     

中药单体逆转BRAF突变型黑色素瘤分子靶向药物耐药研究进展

BRAF突变型黑色素瘤通过遗传与非遗传两种途径产生的分子靶向药物耐药性是临床治疗失败和肿瘤复发的主要原因。中医药在治疗肿瘤方面具有低毒高效、多途径、多靶点作用的优势,能为调控黑色素瘤耐药提供新的思路。研究表明,诸多中药单体可以调控BRAF突变型黑色素瘤遗传与非遗传耐药机制,如调节胞内异常信号通路、干预细胞表型转换、抑制代谢重编程和调节表观遗传变化等,进而阻止黑色素瘤耐药的发生和发展。该文对中药单体通过调控遗传与非遗传机制抑制BRAF突变型黑色素瘤耐药的研究现状进行总结,旨在为中药逆转黑色素瘤耐药提供理论支撑和潜在的治疗策略。     

结直肠癌分子病理特征与临床及预后的相关性

目的 探究结直肠癌（colorectal cancer,CRC）中错配修复（mismatch repair,MMR）蛋白表达和KRAS/NRAS/BRAF突变的临床特征和预后价值。方法 运用免疫组化及ARMS-PCR法检测694例CRC组织中MMR蛋白表达和KRAS/NRAS/BRAF突变情况，分析其临床特征及预后。结果 694例患者中, MMR蛋白表达缺失（deficient MMR, dMMR）62例（8.93%）, KRAS突变333例（47.98%）, NRAS突变31例（4.47%）, BRAF突变20例（2.88%）。dMMR状态在年龄<60岁，右半结肠，肿瘤长径≥5cm，隆起型，低分化及无淋巴结转移的患者中更常见。KRAS突变易发生于黏液腺癌中。NRAS突变在年龄≥60岁患者中更常见。BRAF突变在右半结肠，黏液腺癌及低分化组织中的检出率高，且其在dMMR肿瘤中的突变率较高。Kaplan-Meier分析显示：BRAF突变患者的总生存期（OS）明显低于KRAS/NRAS突变及完全野生型患者，且其无进展生存期（PFS）明显低于KRAS突变及完全野生型患者；MMR蛋白表达...     

BRAF~(V600E)突变与儿童甲状腺乳头状癌临床病理特征间的关系

在成人甲状腺乳头状癌(PTC)中, BRAF~(V600E)突变已被证明与高侵袭性和患者的不良预后差密切相关.相比之下,在儿童PTC中该突变的研究非常有限且其出现比例在0%~63%.此外,在儿童PTC的BRAF~(V600E)突变的作用也存在明显的争议.本研究旨在探讨48例儿童(3~13岁) PTC中, BRAF~(V600E)突变的存在比例和作用.这些儿童PTC患者中,包括41例经典型PTC, 5例滤泡型PTC, 2例弥漫性硬化型PTC.所有患儿中, 35.4%出现BRAF~(V600E)突变,在经典型PTC中41.5%出现BRAF~(V600E)突变.进一步分析显示, BRAF~(V600E)突变的存在与患儿10岁(P=0.011)、手术方式(P=0.03)、肿瘤多灶性(P=0.02)和/或甲状腺外浸润(P=0.003)、低MACIS评分(转移、年龄、甲状腺全切、侵袭、肿瘤大小)(P=0.036)和AMES评分(年龄、转移、肿瘤范围、大小)(P=0.001)相关.总之,该研究表明, BRAF~(V600E)突变的存在可能与儿童PTC的部分高侵袭性临床病理特征呈负相关.     

脊柱朗格汉斯细胞组织细胞增生症的临床病理分析

目的探讨脊柱朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans cell histiocytosis, LCH)的临床病理特征,分析BRAF V600E、CyclinD1及Ki-67在LCH中的表达情况及其意义。方法对27例脊柱LCH进行了临床和组织病理学的回顾性研究,以及免疫组化检测。结果本组27例均获得随访,临床资料齐全,其中男性20例,女性7例,患者的年龄5～62岁。21例为骨单发病灶,3例为骨多发病灶,3例为多系统病灶。颈椎13例,胸椎8例,腰椎6例,形成背部软组织肿块5例,临床表现为局部疼痛症状(27例),脊髓压迫症状(12例)及脊柱畸形(11例)。所有病例均表达CD1a、langerin、S-100;100%病例表达Cyclin D1,22.2%病例表达BRAF V600E,形成软组织包块5例Ki-67阳性率15%～20%,多系统病灶Ki-67阳性率15%～30%。采用ARMS法荧光定量PCR检测BRAF V600E,检出率为44.4%。结论脊柱LCH最常见的症状为疼痛,其次为脊髓压迫及脊柱畸形;cyclin D1可作为LCH的一个有效鉴别诊断指标;采用免疫组织化学染色检测B...     

阴沟肠杆菌nifL对nifA蛋白激活固氮基因表达的影响

通过基因定位突变的方法 ,构建了阴沟肠杆菌E2 6染色体上基因nifL突变菌E11和E12 ,并对其固氮特性进行分析。结果显示 ,当细菌在有NH 4 的条件下 ,nifL作为固氮基因的负调节因子 ,可能是通过nifL蛋白与nifA蛋白之间的相互作用 ,形成某种复合物 ,导致NifA的失活 ,从而关闭nif基因的表达。高温条件下 (37℃ ) ,nifL并不参与对nif基因表达的阻遏作用 ,但是nifL的突变影响NifA激活nif基因表达对热的稳定性     

乳腺癌组织中EGFR/KRAS/BRAF基因突变检测与分析

[目的]检测乳腺癌组织中表皮生长因子受体(EGFR)以及其下游KRAS、BRAF基因的突变类型和突变率,分析其各突变类型之间有无相关性,以期为乳腺癌药物靶点筛选和乳腺癌患者的分子靶向治疗提供更多依据。[方法]取自2016～2017年间宜昌市中心人民医院病理科收集的乳腺癌患者术后冰冻肿瘤组织样本60例以及健康人群DNA样本30例,分别提取基因组DNA,采用PCR扩增和基因测序的方法对基因组中的EGFR外显子18～21,KRAS外显子2、3以及BRAF外显子15进行基因突变分析。[结果]在检测的60例乳腺癌组织样本中,总计有8例样本存在错义突变。其中EGFR突变率为11.7%(7/60例),均为外显子18和20突变。包括第18号外显子P699A突变3例,突变率为5.0%;第20号外显子L778M、V819A突变各4例,突变率6.7%。并包含3例L778M合并V819A突变,另有2例中分别出现了I780M合并S783C和L788V合并L815F突变。BRAF外显子15仅出现了1例T599P突变,突变率为1.7%(1/60例)。30例正常人群对照组未检测到错义突变。[结论]EGFR在乳腺癌中的突变主要以外显子18和20为主,存在P699A、L778M、V819A突变且突变率高达11.7%。BRAF在乳腺癌中的突变率极低,仅为1.7%。未检测到乳腺癌组织中KRAS突变。与正常组织相比较,EGFR外显子18和20的高突变率提示其与乳腺癌的发病存在密切关系,EGFR突变是潜在的抗乳腺癌治疗靶点。     

水果也能做“体检”

有研究指出,咖啡因能杀死遭紫外线破坏的人类皮肤细胞,或许可以帮助清除紫外线对人体的伤害,预防某些类型的皮肤癌。非黑色素瘤皮肤癌是人类常见癌症之一,紫外线会使皮肤细胞中的DNA遭到破坏,继而发生突变或癌变,所以过多接触紫外线是导致非黑色素瘤皮肤癌的重要诱因之一。     

BRAF~(V600E)基因检测对良恶性甲状腺结节的诊断价值

目的:探讨BRAF~(V600E)基因检测在甲状腺结节中的诊断价值,评估其诊断良恶性甲状腺结节的应用价值。方法:选取2015年1~12月江苏省常州市武进中医医院收治的甲状腺结节患者,入院后测定BRAF~(V600E)基因表型,采用细针穿刺细胞学(FNAC)检测其性质,采用手术组织病理学对患者甲状腺结节进行良恶性鉴别,分析BRAF~(V600E)基因与良恶性结节的相关性,评估其对于甲状腺结节良恶性鉴别的指导价值。结果:共入组甲状腺结节患者92例,其中恶性65例;多因素分析表明BRAF~(V600E)基因突变与恶性甲状腺结节呈相关性(P0.01),OR为44.42(95%CI:5.66~348.44);BRAF~(V600E)基因突变预测其恶性甲状腺结节发生的敏感性和特异性分别为63%(95%CI:0.50~0.74)和96%(95%CI:0.79~0.99)。结论:BRAF~(V600E)突变与甲状腺癌的发生有显著的相关性,其能显著提高良恶性甲状腺结节的检出率。     

维罗非尼联合爱必妥对结直肠癌细胞株的作用研究

探讨BRAF抑制剂维罗非尼联合EGFR单克隆抗体西妥昔单抗对BRAF突变型和野生型结直肠癌细胞株的作用。应用MTT法检测,将不同浓度西妥昔单抗、维罗非尼单药以及两药联合分别作用于BRAF突变型结直肠癌细胞株RKO、HT-29和BRAF野生型结直肠癌细胞株DIFI、CACO-2后,观察各细胞株增殖变化;通过集落形成实验,经过长时间培养细胞验证不同处理因素对细胞增殖的抑制作用;Western blot实验检测EGFR下游通路靶蛋白的活性在两药联合后是否出现明显下调。结果显示,单药治疗,西妥昔单抗能一定程度抑制BRAF野生型结直肠癌细胞株增殖,抑制率达26%~40%,而BRAF突变组两种细胞株对西妥昔单抗均耐药。维罗非尼对不同基因状态细胞的增殖均有一定的抑制作用,IC50均小于7μmol/mL,其中BRAF突变细胞更为敏感。对比单药西妥昔单抗,联合维罗非尼后更加明显地抑制了细胞增殖,4种细胞存活率均明显降低(P0.05)。长时间集落形成实验证实两药联合形成集落的面积和数量均明显减少。Western Blot实验显示对比单药,两药联合明显下调了p-EGFR、BRAF、p-ERK的表达。结果显示,BRAF抑制剂维罗非尼无论在BRAF突变型还是野生型结直肠癌细胞株中,均能增强西妥昔单抗作用的敏感性。     

大肠杆菌K1致病株外膜蛋白T体外功能

纤溶酶原激活及水解抗菌肽利于致病菌侵袭及体内存活。【目的】构建大肠杆菌K1致病株E44的ompT基因缺失突变株,证实E44外膜蛋白T(OmpT)体外激活纤溶酶原及水解抗菌肽鱼精蛋白的活性。【方法】采用基因同源重组技术敲除大肠杆菌K1株E44中的ompT基因,构建ompT缺失突变株;二步柱层析纯化E44外膜组分,S-2251发色底物法测定其纤溶酶原激活活性;考察野生株E44、ompT基因敲除株E44ompT及转化带有ompT完整阅读框的质粒pUCT的E44ompT/pUCT三者对0.1mg/mL阳离子抗菌肽鱼精蛋白的敏感程度。【结果】利用自杀性载体pCVD442和同源重组的原理构建E44的ompT基因敲除株E44ompT;纯化得到约37kDa的E44外膜组分,S-2251发色底物法证实其具有纤溶酶原激活活性,纤溶酶原激活与膜组分的加入量呈一定量效关系;与野生株E44相比,ompT敲除株E44ompT对0.1mg/mL鱼精蛋白敏感,转化入带有ompT完整序列的质粒pUCT有一定的回补作用,E44ompT部分恢复抗鱼精蛋白能力。【结论】外膜蛋白T在致病株E44中有表达,并具有激活纤溶酶原及水解鱼精蛋白的活性。     

E92A是HIV-1整合酶耐药突变N155S的活性回复突变

HIV-1整合酶是目前抗艾滋病药物研发的重要靶点之一,整合酶的耐药突变是导致整合酶抑制剂类药物治疗失败的主要原因,但突变产生耐药性的机理仍不清楚.本工作通过人工构建突变型整合酶,测试其活性和耐药性,对整合酶的耐药机理进行初步探索.构建整合酶的突变型包括E92A、N155S两种单突变及E92A/N155S双突变.通过基因工程操作引入突变、构建质粒、表达纯化得到整合酶蛋白.用基于磁珠的整合酶链转移ELISA测试整合酶的链转移活性,用S-1360和Raltegravir两种抑制剂测试整合酶的耐药性.另外,用Autodock软件做了S-1360和整合酶核心区(包括野生型和突变型)的分子对接.结果表明,N155S突变使整合酶链转移活性下降约80%,而E92A/N155S双突变仅使活性下降约42%,这表明N155S突变基础上的E92A突变可使整合酶的活性大幅回复.E92A和E92A/N155S对不同的抑制剂可产生不同的耐药性,它们对Raltegravir的耐药性强于对S-1360.突变对整合酶活性和耐药性的影响主要是通过改变整合酶活性中心结构实现的,E92A突变可能导致其与周围残基静电相互作用减弱,间接影响到D64和D116残基,产生活性回复作用.     

超抗原SEA与抗黑色素瘤ScFv融合基因的构建及表达

采用酶切连接和重叠PCR连接两种方法将抗黑色素瘤单链抗体基因和去除N端信号肽的金黄色葡萄球菌肠毒素A基因进行融合,并将融合基因克隆于pET28a表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)。用NiNTA系统对表达产物进行分离、纯化。MTT法检测融合蛋白对黑色素瘤细胞的体外抑制率。结果表明6HisScFvSEA融合蛋白可在E.coli BL21(DE3)中稳定表达,表达量占菌体蛋白的30%,主要以包涵体的形式存在。融合蛋白可通过激活效应细胞对表达相关抗原的黑色素瘤细胞发挥抑制作用。     

HPV-2E2蛋白(A338V)突变体对E2蛋白DNA结合能力增强的研究

HPV-2是引起皮肤寻常疣的常见HPV型别,病毒E2蛋白可抑制病毒早期启动子的活性。我们曾经报道来自一例巨大寻常疣患者的HPV-2突变E2蛋白对病毒早期启动子活性的抑制作用明显减弱,该E2蛋白在其C末端的DNA结合区域带有A338V的点突变。本研究利用原核表达系统表达纯化了突变E2(A338V)和HPV-2原毒株的羧基端和全长蛋白。电泳迁移率实验结果显示,E2蛋白可与带有E2蛋白特异性结合位点的寡核苷酸探针形成复合物,突变E2蛋白比原毒株E2蛋白的DNA结合能力强。这提示DNA结合能力的增强可能为E2蛋白对病毒启动子活性影响的分子基础,与患者出现罕见巨大寻常疣这一临床表型关联。