实时荧光PCR技术鉴别流通环节的掺假牛肉及其制品

近年来,肉制品掺假事件不断被曝出,对全球食品安全和经济产生了一定的负面影响.笔者利用特异性引物及探针,对购买自农贸市场、大型超市、餐饮店和网络电商的牛肉及其制品进行动物源性成分和大豆成分检测,将检测结果与产品标签对比,调查样品掺假情况,以期为消费者及监管部门提供依据.检出结果显示:餐饮店样品中掺入非牛肉成分的种类最多,...     

TaqMan实时荧光定量PCR鉴定燕窝方法的建立

目的:燕窝是一种名贵药材,但目前市场上有很多假冒产品,因此需要建立一种简便可靠的鉴定方法。方法:通过荧光定量PCR对燕窝样品进行检测,对雨燕属、金丝燕属和其他物种细胞色素b基因的序列进行分析。结果:设计了一条特异靶向雨燕属和金丝燕属细胞色素b基因的TaqMan探针,发现此探针具有良好的特异性和灵敏度,可检测痕量的燕窝样品,对其他物种的检测结果为阴性。结论:所设计的TaqMan探针和实时荧光PCR方法可应用于燕窝的真伪鉴别,准确性高、实用性强。     

四重PCR检测副溶血性弧菌及其毒力基因方法的建立

【目的】建立同时检测副溶血性弧菌tox R、tdh、trh、tlh基因的四重PCR快速检测方法。【方法】分别以副溶血性弧菌的tox R、tdh、trh、tlh 4个基因为靶基因,设计4对特异性引物,对4对引物浓度和退火温度进行优化,获得最佳引物比例和扩增条件,建立快速检测致病性副溶血性弧菌的四重PCR体系。通过特异性验证、灵敏度验证以及模拟样品检测进行方法确认。【结果】四重PCR体系扩增条带与预期相符,即115 bp(tox R)、244 bp(tdh)、418 bp(trh)、759 bp(tlh)4个目的条带;用74株副溶血性弧菌和37株非目标菌的测试结果表明,所建立的方法有良好的特异性。该方法对模板DNA的检测灵敏度为50μg/L,纯培养物的检测灵敏度为6.7×103 CFU/m L;副溶血性弧菌含量为1.36 CFU/g的人工模拟样品增菌6 h后,tox R、tlh、tdh、trh 4个基因可同时被检出。【结论】该方法可实现同时检测携带tox R、tdh、trh、tlh 4种基因的副溶血性弧菌,对开展致病性副溶血性弧菌的检测研究具有一定现实意义。     

东海原甲藻细胞色素b基因实时荧光定量PCR检测体系优化

为定量检测现场样品中东海原甲藻的细胞色素b(cytochrome b,Cytb)基因,本研究设计了该基因的特异性引物,并对现场样品反转录反应体系中加入的模板数量和定量PCR反应条件进行了优化.结果表明:设计的引物具有较好的特异性,可有效区分不同的藻类;针对现场样品,在20μL的反转录体系中,适宜加入的RNA模板的量为50 ～ 200 ng;PCR模板稀释10倍或向定量PCR反应体系中加入终浓度为0.2μg·μL-1的牛血清蛋白(BSA)均能有效降低现场样品中抑制物的抑制作用,减小干扰.该方法的建立对从分子水平探讨东海原甲藻暴发和消亡的内在机制具有重要意义.     

单细胞PCR体系的建立及其在CRISPR/Cas9靶点活性检测中的应用

单细胞PCR是以单个细胞所含的DNA或RNA为模板进行扩增,因此其模板的制备是影响整个反应成功与否的关键因素。利用三种不同蛋白酶K细胞裂解液(SDS细胞裂解液、NP-40细胞裂解液、Tween-20细胞裂解液)分别对体外培养成熟的单个猪卵母细胞进行裂解,并直接作为模板进行PCR扩增,结果表明:NP-40细胞裂解液制备的模板质量最好,其扩增效率为95%;其次为Tween-20细胞裂解液,其扩增效率为65%;SDS细胞裂解液产物中未检测到阳性条带。结合显微注射技术对sgRNA靶点活性进行检测,结果表明利用单细胞PCR结合显微注射的方法,在受精卵内对CRISPR/Cas9靶点活性进行检测确实可行,检测结果真实可靠。     

羊肉掺假鉴别快速荧光定量PCR芯片制备及应用研究

为了建立一种基于芯片的快速鉴别羊肉掺假成分的方法,将不同动物源性成分的引物及反应所需试剂预先冻干固定到空白芯片反应池内,以制备羊肉掺假鉴别快速荧光定量PCR芯片。同时,通过模拟掺假样品（在羊肉中掺入猪肉、鸡肉、鸭肉、鼠肉成分）检测实验,对所得芯片的性能进行了评价。从与ABI7500荧光定量PCR结果对比可知,基于芯片的快速荧光定量PCR检测方法可以准确检测5种动物源性成分,具有较高的准确性及可用性,且其PCR扩增时间较短,操作简单,满足了羊肉掺假快速鉴别的要求。该芯片的研制及快速检测方法的建立将有效的简化羊肉制品掺假检测的步骤、缩短检测时间,且成本较低,仪器便于携带,使现场检测成为可能。研究结果为我国肉类食品安全监管提供了有力保障。     

双重实时荧光PCR法检测食品和饲料中的鸡源性成分

根据鸡线粒体DNA细胞色素b基因序列和内参照基因PUC18质粒基因序列设计特异性引物和以不同荧光素标记的TaqMan探针。通过对反应条件的优化筛选,建立能同时扩增鸡源性成分和内参照基因成分的双重实时荧光PCR检测方法。设置内参照反应是为了监控反应体系中是否含有PCR反应的抑制物,避免出现假阴性结果。分别以鸡、鸭、鹅、火鸡、牛、羊、猪、鱼、兔、驴、鹿、狗、马、鸽子、大豆、玉米、小麦、大米、马铃薯及番茄的线粒体DNA作为模板进行特异性试验,结果表明该方法仅能特异性扩增鸡源性成分,而对其它物种未见有效扩增。通过灵敏度测试,该方法检出限达0.01%。所制定的方法特异性高,灵敏度好,可以作为食品和饲料中鸡源性成分的高效检测方法。     

多重PCR检测技术在食品微生物检测中的应用

现代食品行业,有很多有害的微生物严重危害食品的品质和人们的健康,甚至会引起一些严重的疾病。食品安全是对食品按其原定用途进行制作和(或)食用时不会使消费者受到伤害的一种担保。食品安全急需一些快速、敏感、特异的检测方法,以及时发现致病菌,控制污染及其可能对人体健康产生的危害。多重PCR检测技术具有快速、简便微量等优点,克服了传统检测方法操作繁琐,检测时间较长等缺点,目前正在被应用于微生物致病菌,转基因产品以及肉类品种的鉴定上,具有广阔的发展前景。本文主要是介绍了多重PCR检测技术在食品微生物检测中的原理和应用,以期望在食品微生物检测方面做出贡献。     

扩增内标在沙门氏菌PCR检测方法中的应用

在PCR反应体系中添加了一条人工构建的扩增内标片段,以指示沙门氏菌PCR快速检测中出现的假阴性。对9株沙门氏菌和15株非沙门氏菌进行PCR检测,结果显示所有沙门氏菌都能扩增到一条invA基因中的374bp特异性片段,而模板来源于非沙门氏菌时则只能扩增到一条513bp扩增内标片段。灵敏度试验显示,该PCR检测体系对猪霍乱沙门氏菌纯DNA模板的检测灵敏度为12．8fg／μL,如果将增菌时间确定为8h,则该检测体系对人工染菌牛乳中沙门氏菌的检测灵敏度可以达到起始浓度为8cfu／25mL。采用上述方法检测了80份污染严重的样品,证实此方法可以有效地排除假阴性,提高检测准确率。     

柑桔黄龙病PCR快速检测技术的建立与应用

利用柑桔黄龙病病原亚洲种16S rDNA序列的特异引物,建立了依据16S rDNA基因序列扩增的有无检测柑桔黄龙病的PCR方法。该检测方法特异性强,重复性好,对大田中感病植株的检出率高,也适用于柑桔无病毒苗木的大量检测。     

猴腺病毒（SAdV）PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立SAdV特异的PCR检测方法并研究实验猴群和猴源性生物制品中SAdV感染或污染情况。方法比对分析多株SAdV序列,设计SAdV特异引物,优化PCR实验条件,建立的PCR方法经验证后检测实验猴群和猴源性生物制品,阳性产物测序并构建进化树。结果经特异性和敏感性鉴定,在设计的5对引物中确定一对最佳引物,可以区分SAdV和MAD,ICH,CELO且可以检测到的最小DNA量为47.9 pg/mL。PCR方法检测实验猴群,阳性率49.2%,测序及进化分析表明,SAdV感染型别呈广泛基因多样性。主要分布在G亚属和以SAdV-49为代表的分支。结论经测序验证,PCR检测方法具有很好准确性,初步应用表明我国实验猴群中SAdV高度流行,应加强实验猴群及相关生物制品中SAdV的监测,避免人类感染SAdV的潜在风险。     

GA21转基因玉米实时荧光PCR检测方法的建立

成功建立了实时荧光PCR鉴定检测转基因玉米GA21品系的方法。该方法通过GA21玉米品系的OTPmEPSPS边界的270bp和133bp靶序列,设计品系特异性检测引物和探针,同时针对Pactin1mEPSPS边界的430bp靶序列设计品系特异性检测引物,应用实时荧光PCR和PCR技术,特异性检测GA21玉米品系。结果表明,应用实时荧光PCR的TaqMan探针技术检测转基因作物边界序列,不仅可以达到品系鉴定的目的,而且该方法和常规PCR比特异性强,简便快速,同时实验采用完全闭管检测,又降低了污染机会,为转基因作物的品系鉴定检测提供了新方法。     

小型猪微卫星标记多重PCR体系的建立与应用

目的建立实验用小型猪微卫星标记的多重PCR体系和进行实验猪群的遗传监测。方法利用3种不同荧光标记的微卫星引物结合ABI3700遗传分析仪测序的方法,通过筛选和优化反应条件,建立可用于实验用小型猪遗传质量控制的稳定的多重PCR反应体系。在此基础上进一步检测实验用小型猪近交群体的遗传变异以验证建立体系的效率。结果筛选出了2组理想的组合：组合1包括SW742、S0228和S0218座位,复性温度58℃和56℃;组合2包括S0155、SW902和S0227三个座位,复性温度为60℃和58℃。组合内不同座位标记不同的荧光染料。还以此检测了实验用小型猪群体中的遗传变异。结论初步建立了中国三种实验用小型猪微卫星标记检测的多重PCR体系,为快速、大通量、准确的小型猪遗传监测提供了初步的技术基础。     

分子信标-实时 PCR法快速检测双歧杆菌的研究

为建立双歧制品中双歧杆菌快速、敏感、特异的检测方法,根据双歧杆菌16SrRNA/16SrDNA基因设计合成了双歧杆菌属特异性引物和分子信标探针,建立了快速检测双歧杆菌的分子信标-实时PCR检测方法,并对反应条件进行优化。检测方法重复性好,批内和批间变异系数均小于5%;特异性强,扩增曲线呈现明显的S型,无非特异性扩增;灵敏度高,是普通PCR的100倍,对纯双歧杆菌DNA的检出限为5.7fg/PCR反应体系,纯双歧杆菌菌液的检出限为2×103CFU/mL;线形范围宽,起始模板数在2×108CFU/mL～2×104CFU/mL之间具有良好的线性关系,相关系数大于97%。该方法具有灵敏、特异、简便和快速的特点,可用于对双歧杆菌原位菌数的定量检测。     

荧光定量PCR技术在临床微生物检测中的应用

荧光定量PCR技术是近些年来发展起来的一种核酸检测技术,它以灵敏度高、特异性强、重复性好、快速准确定量等特点被广泛应用于各个领域。现主要介绍荧光定量PCR技术在病毒、细菌、真菌和寄生虫4个临床微生物检测方面的应用进展。     

猕猴巨细胞病毒(RhCMV)nested PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立猴巨细胞(RhCMV)病毒的nested PCR检测方法,并初步应用。方法根据GenBank中报道的RhCMV全基因序列,针对其中的保守区域Rh85设计两对引物进行nested PCR反应,利用此方法对20份猕猴全血标本进行检测,将检测到的猕猴阳性标本扩增片段进行克隆测序。结果利用保守区域Rh85设计的引物可对人HCMV阳性对照进行扩增。用此方法检测的20份猕猴全血标本,出现2例阳性。其中一例扩增片段经纯化、回收克隆测序后用BLAST软件进行同源性对比,与GenBank中报道的RhCMV序列基本相同。结论建立了从猴全血中直接检测猴RhCMV病毒DNA的敏感、特异的nested PCR方法。     

猴副流感病毒SV5 PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立检测SV5的PCR方法并加以初步应用。方法根据GenBank中报道的SV5序列,针对其中的SH基因设计引物进行PCR反应,扩增产物进行测序并用BLAST软件进行同源性比对,同时利用限制性内切酶的酶切反应以证实此PCR反应的特异性。在此基础上设计巢式PCR提高此方法的灵敏度。利用此方法对20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本进行检测。结果利用设计的引物扩增出的序列测序结果证实与报道的SV5SH基因相对位置的序列一致。AccⅢ限制性内切酶可对PCR产物进行特异性酶切。巢式PCR比一次PCR的敏感度有所提高。用此方法检测的20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本结果为阴性。结论初步建立了检测SV5病毒的PCR方法,排除实验室用20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本SV5的污染。     

弓形虫（Toxoplasma gondii）的PCR检测方法在笼养猕猴群中的应用

目的建立快速、灵敏、特异及检测结果易判断的PCR方法,并应用于大规模猕猴种群的弓形虫常规检测中。同时比较巢式PCR和单一PCR的一致性。方法根据弓形虫保守基因p30（SAG1）设计了内、外两对进行巢式PCR扩增以及B1基因设计一对引物进行单一PCR扩增,将DNA样本进行10倍倍比稀释,以检测巢式PCR反应的灵敏度;并对医学生物学研究所自繁猕猴共150只进行了弓形虫检测。结果巢式PCR检测法检测限度可达10^-3ng/uL,而且方法特异。两种PCR法检测结果基本一致,其中巢式PCR检测阳性率（10％）稍高于单一PCR检测阳性率（8．67％）。结论巢式PCR和一次PCR方法都可应用于猕猴弓形虫的常规检测中,并提示巢式PCR比单一PCR更敏感、检出率更高。