Gs蛋白alpha亚基与毒性多结节性甲状腺肿自主功能性的研究

目的：检测TMG (毒性多结节性甲状腺肿：Toxic Multinodular Goiter) 患者甲状腺细胞中的Gs琢基因突变情况,讨论其与 TMG 细胞自主功能性的关系。方法：将16 例TMG 患者手术切除标本中甲状腺结节组织及其作为对照组的结节周围正常的甲状 腺组织,分别于光镜电镜下观察细胞行为,提取DNA,对目的基因片段进行扩增聚合酶链反应(PCR)反应及DNA测序分析。结果： 于光镜及电镜下可观察到TMG细胞的滤泡大小不等,滤泡上皮呈高柱状,增生明显,粗面内质网高度扩张,高尔基体发达,核糖 体丰富,呈高功能状态。16 例TMG 标本中,5 例发现第10 外显子点突变,其中：2 例为第274 位的赖氨酸密码子AAG的第一个 碱基A的缺失,使对应赖氨酸表达异常,3 例为第279 位的天冬酰胺的密码子AAC 的第一个碱基A 的缺失,对应天冬氨酸表达 异常。对照组未发现Gs琢基因突变。结论：TMG 患者Gsalpha基因突变可导致Gs琢/TSHR/cAMP 信号通路异常,使细胞产生自主高功 能状态,是导致TMG 自主功能性发生的重要因素。     

错配碱基PCR-RFLP检测K-ras癌基因点突变

错配碱基套式PCR-RFLP检测K-ras癌基因第12位密码子点突变,并与一步法PCR-RFLP作比较.结果显示套式PCR-RFLP可检测出500细胞中的一个突变细胞,比一步法PCR-RFLP分析的敏感性提高了100倍.利用该方法检测纤维支气管镜收集的标本中的突变细胞,结果发现9例肺腺癌中有5例发生了K-ras癌基因第12位密码子点突变.提示该方法可行,值得推广应用.     

BRAF~(T1799A)突变、RET/PTC重排对术前诊断甲状腺乳头状癌的作用

目的:探讨术前超声引导下细针抽吸细胞学检查(US-FNAB)联合BRAFT1799A突变、RET/PTC1及RET/PTC3重排对诊断甲状腺乳头状癌(PTC)的特异性及敏感性,为临床术前准确诊断PTC选择适用的分子标记物。方法:收集346个超声怀疑为甲状腺恶性结节的US-FNAB细胞标本及对应结节(152个)的术后新鲜组织,采用PCR分别扩增BRAFT1799A、RET/PTC1及RET/PTC3基因,产物经基因测序证实。结果:346个甲状腺术前穿刺的结节中,选择观察而未手术的结节192个,手术治疗152个,未接受手术建议的结节2个。术前US-FNAB的细胞标本中共检测到51个结节发生BRAFT1799A突变,其细胞学分类为36个恶性,11个可疑恶性,4个良性。该51个结节术后病理证实均为PTC。20个发生RET/PTC1重排,其术前细胞学结果为17个恶性,2个可疑恶性,1个滤泡性肿瘤或可疑滤泡性肿瘤,术后病理证实均为PTC。3个结节发生RET/PTC3重排,其术前细胞学结果为恶性,术后病理证实均为PTC。对45个术前US-FNAB标本检测BRAFT1799A突变阴性而术后病理证实为PTC的结节,将其对应结节的术中组织行该基因的检测,仅有1个结节的术后组织中检测到该突变。本研究中,术前US-FNAB联合多分子标志物的检测,将细胞学诊断PTC的敏感度由73.96%提高到92.71%。结论:术前US-FNAB联合多分子标志物的检测可提高其诊断PTC的敏感性及特异性,并有助于患者的个体化诊治。     

PCR－SSCP检测肺癌细胞p53基因点突变

应用溴化乙锭(EB)染色的PCR-SSCP技术对10例非小细胞性肺癌组织标本p53基因外显子5～8进行分析,其中1例在外显子5～6;1例在外显子7;2例在外显子8发现异常电泳带.对1例经SSCP检测异常的p53基因进行核酸序列分析,发现第280位密码子由AGA变成ACA,其编码的氨基酸由丝氨酸变成半胱氨酸.结果证实:非小细胞性肺癌与p53基因突变有关;EB法PCR-SSCP技术是一种简便、可靠的点突变检测法.     

人线粒体tRNA修饰碱基与遗传性脑肌病

人的多种遗传疾病与线粒体tRNA基因突变有关,这些突变导致疾病发生的分子机理是当前研究的热点.通过研究线粒体tRNA分子上的碱基修饰情况,人们发现了一类特殊的带有牛磺酸衍生物基团的修饰,这类修饰主要位于线粒体tRNALys和线粒体tRNALeu(UUR)反密码子第一位摆动(wobble)位点的碱基上.最近的研究表明,位于这两种线粒体tRNA基因上的多种突变与遗传性脑肌病相关,包括A8344G,A3243G,T3271C等等,它们可以导致tRNA上相应摆动位点的碱基修饰缺失.无论是在体外培养的带有相应突变的细胞内,还是在来源于脑肌病病人的组织中,科学家都发现了相同的线粒体tRNA碱基修饰缺陷.通过分子手术证实,此类碱基修饰对于维持这两种tRNA的反密码子与mRNA上相应密码子的相互识别至关重要,缺失了这种修饰的tRNA将无法识别一些对应的密码子.通过进一步的实验,人们还鉴定出负责催化此类碱基修饰的酶.这些研究不但揭示了线粒体遗传性脑肌病相关突变的致病机理,也将为研究基因治疗提供可能的新手段.     

利用TALEN技术建立恒河猴TRIM5α基因突变细胞株

利用TALEN技术建立恒河猴TRIM5α基因突变细胞株,为进一步研究TRIM5α基因的功能奠定基础。构建针对TRIM5α打靶基因的TALEN,通过点突变的方法获得包含TRIM5α第7个外显子中打靶位点1 211-1 224的基因序列并构建点突变donor载体。将打靶TRIM5α基因的TALEN质粒和donor质粒电转入恒河猴肾细胞(LLC-MK2)中,无限稀释法获得单克隆细胞系,通过抽提基因组DNA,再利用PCR技术扩增目标序列并测序筛选出TRIM5α碱基缺失(1 215-1 216)和点突变(1 213-1 215,1 217)的细胞系。通过共转TALEN质粒和点突变的donor质粒筛选获得了TRIM5α基因敲除和TRIM5α基因点突变的LLC-MK2细胞系。     

BRAF~(V600E)基因检测对良恶性甲状腺结节的诊断价值

目的:探讨BRAF~(V600E)基因检测在甲状腺结节中的诊断价值,评估其诊断良恶性甲状腺结节的应用价值。方法:选取2015年1~12月江苏省常州市武进中医医院收治的甲状腺结节患者,入院后测定BRAF~(V600E)基因表型,采用细针穿刺细胞学(FNAC)检测其性质,采用手术组织病理学对患者甲状腺结节进行良恶性鉴别,分析BRAF~(V600E)基因与良恶性结节的相关性,评估其对于甲状腺结节良恶性鉴别的指导价值。结果:共入组甲状腺结节患者92例,其中恶性65例;多因素分析表明BRAF~(V600E)基因突变与恶性甲状腺结节呈相关性(P0.01),OR为44.42(95%CI:5.66~348.44);BRAF~(V600E)基因突变预测其恶性甲状腺结节发生的敏感性和特异性分别为63%(95%CI:0.50~0.74)和96%(95%CI:0.79~0.99)。结论:BRAF~(V600E)突变与甲状腺癌的发生有显著的相关性,其能显著提高良恶性甲状腺结节的检出率。     

IL2-TNFα基因诱导大鼠C6胶质瘤细胞凋亡

目的为深入进行胶质瘤细胞凋亡的分子生物学研究及为提高胶质瘤辅助免疫治疗打下基础.方法通过光镜、电镜、荧光显微镜分析,DNA断裂分析及流式细胞仪分析,进行通过IL2-TNFα诱导C6胶质瘤细胞凋亡研究.结果本研究用脂质体将pLXSN-IL2-TNFα基因导入病毒包装细胞PA317,经G418抗性筛选,用NIH3T3细胞测得病毒滴度为5×10\+5CFU/ml的细胞克隆,利用病毒上清感染C6细胞,测得IL2的生物活性为2.0～8.0U/10\+6cells/24h,测得TNFα生物活性为3～110U/10\+6cells/24h,实验证实在作用72h后,C6细胞出现细胞凋亡;光镜和电镜可见细胞形态学上出现细胞皱缩,染色质浓集贴边;流式细胞仪结果显示有凋亡峰出现,凋亡细胞占细胞总数14.0%±1.3%;荧光显微镜观察出现染色质浓集、断裂;DNA电泳表现出DNA呈梯状带断裂.结论上述结果提示用IL2-TNFα成功诱导大鼠C6胶质瘤细胞发生凋亡.     

板角山羊mtDNA Cyt b基因变异特点及系统进化研究

测定了板角山羊品种13个个体的细胞色素b基因全序列(1140 bp),比较分析了群体中细胞色素b基因的碱基组成和序列间碱基的变异情况,结果显示:在该品种(群体)中细胞色素b基因序列中6个变异位点上观察到11次T-C间和2次A-G间的碱基转换,除了有2次T-C间碱基转换发生在密码子第2位点为非同义突变以外,其余的11次碱基转换发生在密码子第3位点,均为同义突变;有1次T-G间碱基颠换发生在密码子第2位点,为非同义突变;观察到5种单倍型,单倍型多样度为0.8077.并以绵羊为外群,与山羊属其他种的同源区序列构建系统发生树.结果显示, 在系统地位上板角山羊与胃石山羊有较近的亲缘关系.     

PCR—SSCP检测肺癌细胞p53基因点突变

应用溴化乙锭（ＥＢ）染色的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术对１０例非小细胞性肺癌组织标本ｐ５３基因外显子５￣８进行分析,其中１例在外显子５￣６;１例在外显子７;２例在外显子８发现异常电泳带。对１例经ＳＳＣＰ检测异常的ｐ５３基因进行核酸序列分析,发现第２８０位密码子ＡＣＡ,其编码的氨基酸由丝氨酸变成半胱氨酸。结果证实：非小细胞性肺癌与ｐ５３基因突变有关;ＥＢ法ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术是一种简便、可靠的点突变检测法。     

甲状腺肿瘤细胞中p16基因的表达和突变

目的:研究抑癌基因p16在甲状腺肿瘤中的表达及突变.方法:采用免疫组织化学法检测60例甲状腺肿瘤细胞中p16蛋白的表达;采用聚合酶链式反应检测甲状腺肿瘤细胞中p16基因的缺失及外显子15'CpG岛异常甲基化.结果:60例甲状腺肿瘤中p16蛋白阳性表达为46.7%(28/60);30例腺瘤中p16蛋白阳性表达分别为60.0%(18/30);30例腺癌中则为33.3%(10/30).60例甲状腺肿瘤中p16基因缺失为13.3%(8/60),30例腺癌中p16基因缺失为26.7%(8/30);30例腺瘤中无缺失(0/30),组间比较差异有显著性(P＜0.05).60例甲状腺肿瘤中p16基因外显子15'CpG岛异常甲基化为15.0%(9/60);30例腺癌中为30.0%(9/30);30例腺瘤中无外显子15'CpG岛异常甲基化(0/30),组间比较差异有显著性(P＜0.001).结论:抑癌基因p16参与了甲状腺肿瘤的发生发展,p16基因的缺失和外显子15'CpG岛异常甲基化在甲状腺恶性肿瘤中起一定的作用,并可能是甲状腺肿瘤中p16基因失活的主要机制.     

HLA-B*2736等位基因的序列分析

使用FLOW-SSO、PCR-SSP以及测序等分型技术, 发现一个与HLA-B*270401基因相关的未知基因。设计基因特异性引物单独扩增B*27基因的外显子2-5, 包括内含子2-4, 并进行双向测序, 分析与B*270401基因序列的差异。该基因的扩增产物为1 815 bp。与B*270401相比在外显子3和4共有10个碱基的改变, 从而使相应氨基酸发生错义或同义突变。碱基634 A→C (密码子130丝氨酸→精氨酸); 670 A→T (密码子142苏氨酸→丝氨酸); 683 G→T (密码子146色氨酸→亮氨酸); 698 A→T (密码子151谷氨酸→缬氨酸); 774 G→C (密码子176谷氨酸→天冬氨酸); 776 C→A (密码子177苏氨酸→赖氨酸); 781 C→G (密码子179谷氨酰胺→谷氨酸); 789 G→T (密码子181丙氨酸同义突变); 1 438 C→T (密码子206甘氨酸同义突变); 1 449 G→C (密码子210甘氨酸→丙氨酸)。在IMGT/HLA数据库中B*27组只有3个基因（B*270502 / 2706 / 2732）提交了内含子序列。该未知基因的内含子2序列与B*2706相同, 显示了与B*27组基因的同源性, 但其同源性在内含子3、4均未得到支持, 与B*27组基因相比, 内含子3的第106个碱基C→G, 碱基168缺失, 碱基179 G→A, 碱基536 G→A; 内含子4中碱基82 T→C。但其内含子3、4序列却与B*070201完全相同。该基因序列已提交GenBank, 编号为被DQ915176, 被WHO确认为HLA-B*2736等位基因。     

PTEN基因突变及蛋白表达与胃印戒细胞癌的相关性研究

目的:探讨胃印戒细胞癌组织中PTEN基因突变及其蛋白表达异常与胃印戒细胞癌发生、发展和临床病理特征的相关性.方法:采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析法检测36例胃印戒细胞癌组织和36例正常胃组织中PTEN基因突变情况,同时应用链霉菌抗生物蛋白一过氧化酶(S-P)免疫组化方法检测PTEN蛋白的表达并结合临床病理资料进行分析.结果胃印戒细胞癌组织PTEN的表达36.1%,明显低于正常组织94.4%,二者具有显著性差异(P<0.01);PTEN表达与性别和年龄无相关性(P>0.05).与浸润深度、淋巴结转移有相关性(P<0.05);36例胃印戒细胞癌组织中PTEN外显子5突变3例(8.33%),突变位点相对较集中,显示其突变热点主要位于161、162号密码子.结论:PTEN在胃印戒细胞癌组织中表达降低,与其浸润深度、淋巴结转移密切相关.胃印戒细胞癌中PTEN基因突变是其蛋白表达缺失原因之一.     

氟氏链霉菌离子束注入突变谱的分析

用低能N⁺离子束注入转谷氨酰胺酶产生菌氟氏链霉菌后,通过试验,初步确定了注入的效应曲线,获得了一系列突变菌株。提取原始菌株和突变菌株的DNA,采用PCR反应分段扩增出转谷氨酰胺酶基因进行单链构象多态性分析(SSCP),并将特异性条带克隆测序进行基因突变型的鉴定,分析离子束注入引起链霉菌基因的基因突变类型及特点。结果显示:碱基变异的类型包括转换、颠换和缺失。在检测到的24个碱基突变中,主要是碱基的置换(87.5%),碱基缺失的比例比较小(12.5%)。在碱基置换中,转换的频率(58.3%)高于颠换的频率(29.2%)。转换主要以C→T,A→G为主,颠换以G→T,C→G为主。此外构成DNA的4种碱基均可以被离子束辐照诱发变异,其中胞嘧啶发生突变的频率较高。     

夏枯草胶囊对自身免疫性甲状腺炎大鼠甲状腺组织及Fas、FasL表达的影响

目的:探讨夏枯草胶囊对自身免疫性甲状腺炎(AITD)大鼠甲状腺组织病理学及Fas、FasL表达的影响。方法:将40只雌性SD大鼠按照随机数表法随机分为空白对照组、模型组、夏枯草胶囊组、硒酵母组,每组10只,空白对照组予以正常饲养,模型组和药物组予以PTg皮下注射建立AITD模型,夏枯草胶囊组、硒酵母组分别给予夏枯草胶囊与硒酵母片的生理水溶液灌胃,药物干预6周后处死大鼠,取甲状腺组织,HE染色电镜下观察各组大鼠甲状腺组织形态,免疫组化法检测各组大鼠甲状腺组织Fas、FasL蛋白的表达。结果:1)模型组大鼠甲状腺组织滤泡大量破坏,形态不规则,胶质分布不均匀,滤泡间隙增大,可见大量淋巴细胞及浆细胞浸润。夏枯草胶囊组滤泡形态尚规则,胶质含量较空白组少,滤泡间有少量淋巴细胞浸润。与模型组对比,夏枯草胶囊组与硒酵母组滤泡破坏及淋巴细胞浸润有显著改善。2)对照组大鼠甲状腺组织中Fas、FasL蛋白仅呈少量表达,模型组大鼠甲状腺组织中Fas、FasL蛋白表达较对照组显著增加(P0.01),夏枯草胶囊组大鼠甲状腺组织中Fas、FasL蛋白表达较模型组及硒酵母组均显著减少(P0.01)。结论:夏枯草胶囊可能通过减少Fas、FasL的表达,抑制甲状腺滤泡细胞凋亡,从而减轻甲状腺滤泡上皮的破坏。     

c-myc表达对顺铂诱导人胶质瘤细胞系BT_(325)凋亡的影响

研究 c- m yc在化疗药物顺铂诱导肿瘤细胞凋亡中的作用。在原有已构建好 c- myc反义表达载体 pc DNA3- MYC并成功转染 BT32 5 细胞的基础上 ,用顺铂诱导细胞凋亡。采用 TUNEL技术并从光镜、电镜、荧光显微镜及激光共聚焦显微镜水平观察 BT32 5 细胞凋亡的形态学特征 ;流式细胞仪检测实验组 (即 pc DNA3- MYC转染的细胞 )及对照组 (包括未转染或仅转染空载体 pc DNA 3的细胞 )凋亡率的异同。结果显示 :与转染空载体 pc DNA3及未转染组的细胞相比 ,在转染 pc DNA 3-MYC的 BT32 5 细胞中 ,顺铂诱导的细胞凋亡作用明显受阻 ,结果表明 :肿瘤细胞内异常表达的 c- myc在顺铂诱导肿瘤细胞凋亡的过程中有重要作用。     

畸精子症病人的睾丸特异性表达基因SPEM1筛查分析

目的:探讨睾丸特异性表达基因SPEM1突变与畸精子症患者之间的关系.方法:收集从2005年4月至2007年3月临床上不明原因的畸精症患者113份外周血标本以及100份正常生育能力男子的外周血标本,抽提其DNA.然后采用PCR技术、变性高效液相色谱技术(DHPLC)以及测序等手段对全部DNA样本进行该基因的突变筛查.结果:在畸精症患者中发现1个新的未见报道的多态性位点;尚未发现有基因突变或微缺失.结论:SPEM1基因突变或缺失不是引起本组畸精子症病人的主要致病基因.该基因在对畸精子症所致不育的诊断价值尚需进一步研究.     

应用4种方法检测结核分枝杆菌临床分离株对链霉素的耐受性

通过DNA测序、SSCP、RFLP和反向斑点杂交技术分析167株结核分枝杆菌临床分离株的耐药基因型,评价结核分枝杆菌rpsL或rrs基因突变与链霉素（SM）耐受性之间的关系,比较4种分子方法检测SM耐受性的临床价值。98株耐SM分离株中,78株（79．6％）rpsL 43位或88位密码子错义突变导致赖氨酸置换为精氨酸,6株（6．1％）rrs 513位碱基A突变为C或T或516位C突变为T,14株（14．3％）未发现突变;69株SM敏感的分离株未发现这两个基因突变。应用SSCP、RFLP和RDBH方法分析上述突变和野生序列的结果与DNA测序完全一致,RDBH方法可从98株耐SM分离株中正确鉴定出84株（85．7％）分离株的5种突变基因型。结果表明,应用分子技术分析rpsL和rrs基因突变可快速检测大多数结核分枝杆菌对SM的耐受性,反向斑点杂交方法是一个快速、简便和可靠地检测药物耐受性的分子方法。     

肺腺癌组织中表皮生长因子受体基因突变的检测及其临床意义

目的:通过检测肺腺癌组织中表皮生长因子受体(EGFR)基因的突变情况,研究EGFR突变与患者临床特征(性别、年龄和吸烟史)的相关性。方法:收集160例肺腺癌患者术前的石蜡组织标本,提取DNA后用实时定量PCR方法对EGFR基因18~21外显子进行突变检测;对基因突变结果与患者的性别、年龄和吸烟史分别做χ2检验。结果:160例肺腺癌组织标本中,有57例检测到EGFR基因突变,突变率为35.6%,且突变与患者性别、年龄和吸烟史均无显著相关性(P0.05);57例EGFR基因突变标本中,27例为19外显子缺失,22例为21外显子L858R点突变,这2种突变占总突变类型的85.96%,并且与患者性别、年龄及吸烟史无显著相关性(P0.05)。结论:EGFR基因在女性不吸烟肺腺癌中有较高的突变率,突变主要集中在19外显子缺失和21外显子L858R点突变,但突变率及突变类型与患者性别、年龄和吸烟史均不相关。     

不同电镜分型女性生殖道尖锐湿疣的CD4+、CD8+的表达

目的:探讨不同电镜分型的女性生殖道尖锐湿疣(CA)的免疫应答状态的异同.方法:将随机抽取的50例女性生殖道尖锐湿疣的活栓组织按照扫描电镜和透射电镜下形态学特征分为尖锐型湿疣、结节型湿疣和内生型湿疣三组.以免疫组织化学方法(IHC)研究CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+比值于不同电镜分型CA中的表达.结果:结节型湿疣的CD4+T细胞数及CD4+/CD8+比值均显著低于尖锐型湿疣,内生型湿疣介于二者之间.结论:CD4+/CD8+比值在不同类型CA中的表达结果有统计学差异,结节型湿疣免疫应答状态异常,预示三种电镜分型的尖锐湿疣转归不同.CD4+/CD8+比值可作为判断预后的指标.