微小核糖核酸106b对肝细胞葡萄糖异生的影响及机制*

目的: 探讨微小核糖核酸106b(miR-106b)对肝细胞葡萄糖异生作用及其机制。方法: 正常人L02肝细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM中,利用miR-106b模拟物和抑制剂(mimics和antagomiR,分别20 nmol/L)处理L02肝细胞24 h,Western blot法检测蛋白和磷酸化蛋白的表达,定量RT-PCR检测mRNA的表达,葡萄糖试剂盒检测培养液中葡萄糖含量。结果: miR-106b模拟物可明显增加磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)的蛋白表达(P均＜0.01)、增加磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PCK1)的mRNA表达(P＜0.01)、降低葡萄糖激酶(GCK)的mRNA表达(P＜0.01)。miR-106b抑制剂可显著降低PEPCK和G6Pase的蛋白表达(P均＜0.01)、降低PCK1的mRNA表达(P＜0.01)、增加GCK的mRNA表达(P＜0.01)。此外,miR-106b模拟物或抑制剂可显著降低或增加信号转导和转录激活子3(STAT3)的蛋白表达(P均＜0.01)。STAT3特异性抑制剂可显著拮抗miR-106b抑制剂对肝细胞葡萄糖异生的抑制作用。结论: miR-106b通过抑制STAT3信号通路而增加肝细胞葡萄糖异生。     

miR-195通过下调IGF-1R的表达抑制胶质母细胞瘤的增殖和迁移

目的:探讨miR-195对胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)增殖和迁移的影响,并阐明其分子调控机制。方法:采用qRT-PCR检测不同级别胶质瘤中miR-195的表达。将miR-195转染至胶质瘤U251细胞后,应用qRT-PCR验证转染效率,MTT及划痕实验检测U251细胞的增殖及迁移能力的改变,qRT-PCR及Western blot检测胰岛素样生长因子1受体(Insulin-like growth factor 1receptor, IGF-1R)的mRNA和蛋白表达;利用质粒转染过表达miR-195后,同时过表达IGF-1R,再应用MTT及划痕实验检测U251细胞的增殖及迁移能力的变化。结果:随着胶质瘤级别的增加,miR-195的表达逐渐降低,各级别胶质瘤中miR-195的表达差异有统计学意义(P0.05)。体外转染miR-195至U251细胞24、48、72 h后,转染组细胞活力和迁移能力均较对照组显著降低(P0.05),细胞中IGF-1R的mRNA和蛋白的表达也明显减少(P0.05);通过转染IGF-1R过表达质粒可显著逆转miR-195过表达对U251细胞增殖及迁移的抑制作用。结论:miR-195可能通过下调IGF-1R的表达,进而抑制胶质母细胞瘤的增殖和迁移。     

原代培养骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型的建立

目的:观察高脂负荷在胰岛素抵抗形成中的意义.方法:用不同浓度椋榈酸、胰岛素分别培养骨骼肌细胞2h、6h、12h、24h,对棕榈酸诱导组的一部分细胞给予1× 10-7M胰岛素刺激2h,用血糖检测试剂盒(GOD-POD)检测各组培养液中的葡萄糖含量,研究不同浓度棕榈酸、胰岛素对骨骼肌细胞摄取葡萄糖的影响,观察胰岛素的生理功效的变化.结果:0.6mM棕榈酸诱导12h以上或者5×101-M胰岛素诱导24h后,培养液中的葡萄糖浓度比正常组高且有显著性差异,表明细胞的糖代谢能力降低.经1×10-7M胰岛素刺激2h后的棕榈酸诱导组,培养液中葡萄糖的浓度与未经胰岛素刺激的棕榈酸诱导组相比无显著差异,胰岛素的生理功效降低,证实棕榈酸诱导组细胞已对胰岛素产生耐受.结论:高脂或高胰岛素条件均可诱导原代骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型.     

肝细胞癌中miR-92a的表达及其对HepG2细胞凋亡的影响

目的:探讨miR-92a与肝细胞癌的相关性,及其表达改变对肝细胞癌HepG2细胞凋亡的影响.方法:实时定量PCR检测肝细胞癌和癌旁正常组织中miR-92a的表达;将miR-92a的抑制物miR-92a inhibitor转染了肝细胞癌HepG2细胞,然后检测了转染后细胞的凋亡.结果:与癌旁正常组织相比,肝细胞癌组织中miR-92a的表达显著上调;转染后miR-92a inhibitor组的凋亡率显著增加.结论:miR-92a与肝细胞癌的发生相关,抑制其表达能够促进肝细胞癌细胞凋亡,在肝细胞癌中发挥癌基因的作用.     

人肾小球血管内皮细胞胰岛素抵抗模型的建立

目的:采用不同浓度的棕榈酸与葡萄糖在体外诱导建立人肾小球内皮细胞(Human glomerular endothelial cells,HRGEC)胰岛素抵抗模型。方法:以人肾小球内皮细胞为研究对象,不同浓度棕榈酸(100,200,300,400,500μmol/L)与不同浓度的葡萄糖(20,30,40,50,60 mmol/L)分别作用细胞24小时和48小时,应用MTT法和葡萄糖氧化酶法检测棕榈酸和葡萄糖对HRGEC存活率与葡萄糖消耗量的影响,蛋白免疫印迹法检测P-IRS、IRS、AKT和p-AKT (Ser473)的影响。结果:1、当棕榈酸500μmol/L干预细胞24小时,与正常组比较,细胞活性显著下降(P0.01),棕榈酸浓度大于或等于300μmol/L干预细胞48小时,细胞存活率显著降低(P0.01)。与空白组比较,300μmol/L、400μmol/L、500μmol/L棕榈酸干预细胞24小时能够明显的降低细胞的葡萄糖消耗(P0.05);200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、500μmol/L干预细胞48小时能够明显的降低细胞的葡萄糖消耗(P0.01)。2、不同浓度葡萄糖刺激人肾小球内皮细胞(HGREC)24小时和48小时,与空白组比较,各组细胞的存活率与对照组比较均无显著变化(P0.05)。与空白组比较,40mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/L葡萄糖干预细胞24小时能够降低人肾小球内皮细胞的葡萄糖消耗(P0.05)。与空白组比较,30mmol/L、40mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/L葡萄糖干预细胞48小时能够明显降低人肾小球内皮细胞的葡萄糖消耗量(P0.01)。3、不同浓度的葡萄糖刺激人肾小球内皮细胞(HGREC)24小时后,结果显示,50 mmol/L、60 mmol/L葡萄糖刺激细胞24小时能降低P-IRS/IRS和p-AKT/AKT (Ser473)的水平(P0.01),而其他组无明显显著变化(P0.05)。结论:高糖诱导方法能够建立HRGEC细胞胰岛素抵抗模型,具有建模周期短、容易重复、可控性强的优点,可用于糖尿病胰岛素抵抗机制的研究和中药成分的筛选研究。     

PTEN参与小檗碱保护脂毒性损伤的胰岛βTC3细胞

目的:探讨小檗碱保护棕榈酸诱导的胰岛βTC3细胞的可能机制,观察PTEN是否参与该过程,以及小檗碱对胰岛素分泌的影响。方法:用1.0 mmol/L棕榈酸制作胰岛βTC3细胞脂毒性损伤模型,给予小檗碱干预;放射免疫法检测胰岛素分泌,West-ern blot法进行PTEN、p-AKT、AKT、Bcl-2、Bax、活性Caspase3蛋白的检测。实验分3大组(对照组、棕榈酸组、棕榈酸+小檗碱治疗组),棕榈酸分别作用3个时间段(24、48、72 h)。结果:(1)放射免疫法胰岛素分泌测定结果显示:β细胞暴露于棕榈酸24 h后,5.6、16.7 mmol/L葡萄糖刺激的胰岛素分泌均较正常对照组显著减少(P0.01);添加小檗碱干预后胰岛素分泌较棕榈酸组回升,但较对照组减少(P均0.01)。(2)在棕榈酸处理的3个时间段内,与对照组相比,棕榈酸组的PTEN、Bax、Active-Caspase3蛋白表达水平显著升高,p-AKT、Bcl-2蛋白水平下降;小檗碱干预后PTEN、Bax蛋白表达水平下降,p-AKT、Bcl-2蛋白水平提高(P均0.01)。结论:小檗碱可改善棕榈酸引起的胰岛素分泌减少,抑制脂毒性诱导的PTEN表达增加,减少促凋亡基因Bax、Active-Caspase3表达,并增加抑凋亡基因Bcl-2基因表达及AKT的活化,从而拮抗棕榈酸诱导的β细胞凋亡,保护β细胞功能。     

高糖诱导内皮细胞损伤microRNA表达紊乱的体外研究

目的:研究高糖诱导的内皮细胞损伤微小RNA(microRNA,miRNA)的表达变化。方法:常规培养的人冠状动脉内皮细胞,利用不同浓度D-葡萄糖溶液(0 mmol/L、5 mmol/L、15 mmol/L和25 mmol/L),诱导刺激24 h后分别用CCK-8法和流式细胞术检测其生长活力和凋亡水平。收集细胞总RNA,利用实时定量PCR(Quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测miRNA的表达变化,同时利用TargetScan、PicTar等生物信息学预测软件预测可能的靶基因。结果:高糖溶液(25 mmol/L)刺激内皮细胞后,细胞生长活力明显降低,为对照组的67.5%(P0.01),凋亡水平为对照组的4.5倍(P0.01)。QRT-PCR结果显示miRNA的表达出现了明显的紊乱,其中miR-451、miR-504、miR-302d、miR-18b*、miR-198、miR-328和miR-517c明显下调,miR-29c、miR-100*、miR-137、miR-660和miR-217明显上调(P0.05)。靶基因预测发现miR-217和miR-451可能调控内皮细胞功能相关的多个基因的表达。结论:在高糖诱导的内皮细胞损伤中,miRNA表达紊乱提示其可能参与内皮细胞功能。     

miR-195通过靶向调控趋化因子5促进胃癌细胞增殖、转移及侵袭的实验研究

目的:研究miR-195通过靶向调控趋化因子5促进胃癌细胞增殖、转移及侵袭的分子机制。方法:选取MGC803及NCI-N87细胞,根据转染不同分为:miR-NC组(空质粒),miR-195-mimics组(模拟序列)。实时荧光定量PCR法检测miR-195表达;MTT检测细胞增殖能力;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭力;细胞划痕实验检测细胞转移能力;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot检测chemokine 5表达水平;Spearman相关分析miR-195及chemokine 5相关性。荧光素酶实验验证miR-195与chemokine 5的靶向关系。结果:miR-195-mimics组细胞miR-195水平高于miR-NC组(P0.05);miR-195 mimics组第1、2、3、4 d细胞活力低于miR-NC组(P0.05);miR-195 mimics组G1细胞高于miR-NC组,G2期、S期细胞低于miR-NC组,G2/S期细胞比值低于miR-NC组(P0.05);miR-195 mimics组划痕距离大于miR-NC组(P0.05);miR-195 mimics组细胞侵袭数低于miR-NC组(P0.05);miR-195-mimics组细chemokine 5蛋白含量低于miR-NC组(P0.05);miR-195 m RNA水平与chemokine 5蛋白含量负相关(r=-0.398,P=0.00);miR-195可直接靶向chemokine 5。结论:miR-195可通过靶向chemokine 5促进胃癌MGC803及NCI-N87细胞的增殖、转移及侵袭。     

MicroRNA-221/222对乳腺癌MDA-MB-231/DOX细胞阿霉素耐药性的影响

目的:探讨微小RNA-221/222(miR-221/222)对乳腺癌MDA-MB-231/阿霉素(DOX)细胞DOX耐药性的影响。方法:采用脂质体法转染miR-221/222抑制物(miR-221/222 inhibitor)至MDA-MB-231/DOX细胞内(Inhibitor组),同时设立空白对照组和转染无关序列的阴性对照组,采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测MDA-MB-231细胞株及MDA-MB-231/DOX细胞株的miR-221/222表达水平及转染效率;CCK-8法检测转染48 h后MDA-MB-231/DOX细胞对DOX药物敏感性的变化;流式细胞术(FCM)检测转染MDA-MB-231/DOX细胞的细胞凋亡率;蛋白免疫印迹实验(WB)检测转染后MDA-MB-231/DOX细胞内促凋亡蛋白p53上调凋亡调控因子(PUMA),Bcl2蛋白修饰因子(BMF)以及细胞周期蛋白激酶抑制因子p27(p27Kip1)的表达情况。结果:MDA-MB-231/DOX细胞中的miR-221/222表达水平高于亲本MDA-MB-231细胞(P0.05);MDA-MB-231/DOX细胞转染miR-221/222 inhibitor 96 h后,miR-221/222的表达水平低于空白对照组和阴性对照组(P0.05);与空白对照组相比,MDA-MB-231/DOX细胞转染miR-221/222 inhibitor 48h后,DOX继续处理48 h后,细胞的凋亡率明显升高,且细胞内的促凋亡蛋白PUMA,BMF以及p27Kip1的表达均增加(P0.05);DOX对inhibitor组耐药细胞的半数抑制浓度(IC50)显著低于空白对照组细胞及阴性对照组(P0.05)。结论:miR-221/222能够增加MDA-MB-231/DOX细胞对DOX的耐药性,这可能与下调促凋亡蛋白的表达有关;降低miR-221/222水平可诱导MDA-MB-231/DOX凋亡,并且上调促凋亡蛋白的表达,从而部分逆转MDA-MB-231/DOX对DOX的耐药性。     

miR-195/VEGFA信号通路对脑梗死后血管生成的影响

为了揭示miR-195/VEGFA信号通路对脑梗死后血管生成的影响,本研究测定了大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型大鼠脑中的miR-195表达,以及miR-195对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein vascular endothelial cell, HUVEC)的细胞侵袭和血管形成的影响。此外,检测了miR-195对血管内皮生长因子A (vascular endothelial growth factor A, VEGFA)表达的影响。研究显示,MCAO组大鼠中miR-195表达显著下调。缺氧处理可导致HUVEC中miR-195表达显著降低。miR-195的下调促进了HUVEC在缺氧条件下的血管生成和细胞侵袭。miR-195模拟物处理可显著下调VEGFA m RNA和蛋白质表达水平。VEGFA的过表达逆转了miR-195过表达对细胞侵袭和小管形成的抑制作用。研究表明miR-195通过靶向VEGFA在缺氧条件下调节脑梗死后的血管生成。     

INS-1E细胞葡萄糖毒性模型的建立

目的:建立胰岛细胞系INS-1E细胞的葡萄糖毒性模型。方法:将INS-1E细胞分别在不同葡萄糖浓度(5.5 mmol/L、16.7mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L)的1640完全培养基中培养不同时间(48 h、72 h、96 h、120 h),分别在不同时间点取细胞进行细胞功能检测,实时荧光定量PCR法检测胰岛素m RNA的表达,ELISA检测葡萄糖刺激的胰岛素的分泌。结果:与对照组相比,高糖浓度(5.5 mmol/L、16.7 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L)培养基中培养48 h后,INS-1E细胞的胰岛素合成和分泌的功能均增加(P均0.05),随着培养基中葡萄糖浓度的升高以及培养时间的延长,INS-1E细胞胰岛素合成及分泌的功能逐渐下降,当在葡萄糖浓度为30 mmol/L的培养基中培养120 h后,胰岛素m RNA合成及葡萄糖刺激的胰岛素分泌均显著降低(P均0.01)。结论:INS-1E细胞在30 m M的葡萄糖中培养120 h形成稳定的葡萄糖毒性模型。     

lncRNA PVT1沉默对高糖诱导的血管内皮细胞增殖、凋亡及氧化应激的影响*

目的: 探讨抑制lncRNA PVT1对高糖诱导的血管内皮细胞的增殖,凋亡和氧化应激的影响。方法: 体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分为四组:对照组(5.5 mmol/L葡萄糖),高糖组(30 mmol/L葡萄糖),高糖+siNC组(30 mmol/L葡萄糖+siNC,细胞转染阴性对照组),高糖+siPVT1组(30 mmol/L葡萄糖+siPVT1,抑制lncRNA PVT1组)。采用荧光定量PCR的方法检测转染后PVT1的表达水平。MTT检测siPVT1(短片段干扰RNA PVT1)对高糖诱导的HUVECs细胞增殖能力的影响。流式细胞术检测siPVT1对高糖诱导的HUVECs细胞ROS和凋亡水平。Western blot检测HUVECs细胞中凋亡相关蛋白如Bax,Bcl-2和cleaved-caspase-3的表达水平。结果: 与对照组比较,转染siPVT1后,PVT1的表达水平显著降低(P＜0.05)。MTT结果显示,与对照组比较,培养24 h和48 h后高糖组中HUVECs细胞增殖活力均显著降低,与高糖+siNC组(阴性对照组)比较,培养24 h和48 h后,高糖+siPVT1组中的HUVECs细胞增殖活力显著增加(P＜0.05)。流式细胞术检测结果表明,与对照组比较,高糖组HUVECs细胞中ROS和凋亡率均显著增加;和高糖+siNC组比较,高糖+siPVT1组中HUVECs细胞中ROS和凋亡率均有减少(P＜0.05)。Western blot结果表明,与对照组比较,高糖组中cleaved-caspase-3和Bax表达水平均显著上调,Bcl-2的表达水平显著下调(P＜0.05,P＜0.01)。与高糖+siNC组比较,高糖+siPVT1组cleaved-caspase-3和Bax表达水平显著下调,Bcl-2的表达显著上调(P＜0.05,P＜0.01)。结论: 抑制lncRNA PVT1可以显著增加高糖诱导的HUVECs细胞增殖活力,减轻氧化应激,抑制细胞凋亡。     

谷氨酰胺对微囊化重组CHO细胞生长代谢及内皮抑素表达的影响

微囊化技术是一种有发展潜力的生物技术,在细胞移植和药物控释等方面具有广泛的应用。然而由于目前微囊化细胞规模化培养技术还不成熟,阻碍了其在临床治疗中的推广与应用。为了了解微囊化重组CHO细胞的生长代谢特性为今后规模化培养优化提供技术参考,考察了主要氮源物质谷氨酰胺对微囊化重组CHO细胞生长代谢及内皮抑素表达的影响。结果显示:当谷氨酰胺起始浓度从2.69mmolL增加到9.05mmolL时最大活细胞密度并没有增高,细胞增殖没有显著差异。当谷氨酰胺起始浓度较低(2.69mmolL)时,葡萄糖的比消耗速率较大;当谷氨酰胺起始浓度增高时(7.91mmolL～9.05mmolL)葡萄糖和谷氨酰胺的比消耗速率增大,但细胞对葡萄糖和谷氨酰胺的利用率降低。谷氨酰胺对产物表达有显著影响,起始浓度为4.97mmolL时的内皮抑素累积浓度最高,达546.36ngmL,过低和过高谷氨酰胺起始浓度下内皮抑素的累积浓度均较低。     

Enhanced beta-galactosidase production by high cell-density culture of recombinant Bacillus subtilis with glucose concentration control

Cell concentration, recombinant protein (beta-galactosidase) level, and the specific enzyme expression level were increased from 19 to 184 g/L, 18.3 to 129 U/mL, and 3.2 to 5.7 U/mg protein, respectively, in fed-batch culture of recombinant Bacillus subtilis when glucose concentration was controlled at 1 g/L as compared with those of conventional fed-batch culture. Glucose concentration of the culture broth was monitored by an automatic on-line glucose analyzer and controlled with a moving identification combined with optimal control (MICOC) strategy. When glucose concentrations were controlled at 10, 1, and 0.2 g/L, accumulated propionic acid concentrations and specific enzyme activities were 18.5, 4.4, and 0.6 g/L and 2.9, 5.7, and 7.1 U/mg protein, respectively. The addition of various concentrations of sodium propionate to the growth medium in batch cultures resulted in a drastic decrease in the growth rate with respect to propionate concentration. The propionic acid was shown to be responsible for cell growth inhibition and enzyme activity reduction in fed-batch culture. (c) 1992 John Wiley & Sons, Inc.