Mir-26a 调控子宫肌瘤中孕激素受体a（PRa）、雌激素受体α（ER-alpha） 的表达

目的：雌激素和孕激素在子宫肌瘤发病中起重要作用。但miRNA 在子宫肌瘤发病中的作用还知之甚少,我们前期已证实 mir-26a 在子宫肌瘤中低表达,本实验进一步探讨mir-26a 在体外对子宫肌瘤中孕激素受体a（PRa）、雌激素受体琢（ER琢）表达 的调控。方法：利用TargetScan 软件预测mir-26a 的潜在靶基因,找出靶基因3''UTR 区片段,插入PmirGLO 绿色荧光蛋白编码 区下游,构建报告基因载体,同时原代培养子宫肌瘤平滑肌细胞。将报告基因载体与mir-26a 共转染入原代培养的子宫肌瘤平 滑肌细胞,引入双荧光素酶报告基因系统对mir-26a 的靶基因进行验证。转染mir-26a mimics 于子宫肌瘤平滑肌细胞,western blotting检测子宫肌瘤平滑肌细胞中mir-26a 靶蛋白表达水平。结果：用TargetScan 软件和双荧光素酶报告基因系统证实ER琢、 PRa 为mir-26a 的靶基因。蛋白水平进一步验证,mir-26a mimics 的转染量不同,ER琢、PRa 的蛋白表达水平下调不同。结论： Mir-26a 通过结合靶基因的3''-UTR 区调控靶基因的mRNA水平。Mir-26a 抑制雌激素受体琢（ER琢）、孕激素受体a（PRa）在子宫 肌瘤中的表达。Mir-26a 可能通过调控雌激素受体琢（ER琢）、孕激素受体a（PRa）影响子宫肌瘤的发展。本实验通过确定mir-26a 对子宫肌瘤的作用机制,有望进一步提高子宫肌瘤的治疗技术,减少手术治疗的创伤。     

含VEGF启动子的报告基因的构建及雌激素受体对其活性的影响

目的：构建含血管内皮生长因子（VEGF）基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素受体作用下的转录活性。方法：以乳腺癌细胞系MCF-7基因组为模板,扩增VEGF启动子片段,克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的报告基因载体转染293T细胞,检测重组质粒中荧光素酶报告基因的表达。结果：酶切鉴定和DNA序列分析表明构建了正确的pGL3-basic—VEGF报告基因载体;转录活性实验表明构建的报告基因载体具有启动子活性,雌激素受体α（ERα）能以剂量依赖的方式升高VEGF启动子调控下的报告基因的转录。结论：克隆了VEGF启动子,为ERα共调节子的功能研究奠定了基础。     

ERα的辅调节因子与乳腺癌关系的研究进展

雌激素受体α（estrogen receptorα,ERα）是配体依赖的转录因子,属于核受体超家族成员。ERα介导转录的经典途径是与雌激素结合后作用于靶基因启动子区的雌激素反应元件（estrogen response element,ERE）,进而诱导靶基因转录。ERα招募辅调节因子（共激活子和共抑制子）参与ERα介导的基因转录调控。辅调节因子主要通过乙酰化、磷酸化、甲基化等表观遗传机制参与转录调控,影响靶蛋白表达水平。ΕRα介导的基因转录调控在乳腺癌的增殖、分化、侵袭转移等过程中发挥重要作用。综述在ERα介导的基因转录调控中几类辅调节因子对乳腺癌发生发展的影响。     

雌激素受体ERα的功能调控及相关疾病的研究进展

雌激素受体(estrogen receptorα,ERα)是依赖配体活化转录因子的核受体家族成员之一,参与靶细胞的增殖和分化。ERα活化的经典途径是与雌激素结合后直接作用于靶基因上游的雌激素受体反应元件(ERE),从而诱导靶基因转录。雌激素受体的功能受许多因子调节,包括与之结合的配体、DNA上的顺式元件、募集的辅助调节因子及细胞环境等。在雌激素受体相关疾病中,除乳腺癌和子宫内膜癌外,近年研究表明心血管疾病、骨质疏松症、阿尔茨海默氏病等疾病也与雌激素受体密切相关。雌激素的生物效应与多种疾病的发生、转归和预后密切相关。本文将综述几类辅助调节因子对雌激素受体介导的基因转录的调控,雌激素受体相关疾病,及环境有害物质对ERα功能的影响。     

雌激素受体信号转导的研究

雌激素受体(estrogen receptor,ER)是核受体超家族的成员之一,雌激素及其类似物可以通过雌激素受体调控许多基因的表达。目前已经发现的雌激素受体包括两种亚型:ERα和ERβ。二者在不同的细胞类型中,针对不同的基因发挥不同的调控作用,进而引发多种多样的生物学效应。本文旨在就目前对雌激素受体信号转导途径的研究进展作一综述。     

mir-26a对子宫肌瘤细胞周期和增殖的影响

目的:近年来许多报道表明,miRNA与一些肿瘤的发病息息相关,其其表达失调直接或间接的影响肿瘤的进展。检测mir-26a在子宫肌瘤组织和肌层组织中的表达,并进一步探究其对子宫肌瘤细胞周期和增殖的影响。方法:收集第二军医大学长海医院妇产科2009年12月至2011年10月手术治疗并经病理检查确诊为子宫肌瘤的患者肌瘤组织和成对肌层组织标本13例,Realtime PCR检测这13例成对组织中mir-26a的表达情况。建立可稳定传代的子宫肌瘤平滑肌细胞系后,将mir-26a转入肌瘤细胞中使其高表达,流式细胞仪检测高表达mir-26a后子宫肌瘤细胞周期的变化,同时用cck-8方法验证细胞增殖活性。结果:Realtime PCR结果显示,与相应肌层组织相比,肌瘤组织mir-26a的表达均显著降低(P0.05)。流式检测结果显示,24 h时,与对照组相比,mir-26a高表达的肌瘤细胞G1期比例增高。增殖实验显示种植细胞第二天开始,mir-26a高表达的子宫肌瘤细胞增殖速度显著降低。结论:与正常子宫肌层组织相比,mir-26a在子宫肌瘤组织中表达下调,这种表达失调直接影响肌瘤细胞的增殖速度和周期比例,提示mir-26a在子宫肌瘤的发生发展过程中发挥了重要的调控作用。     

癌基因MDM2对雌激素受体转录活性的调节作用

目的:检测MDM2基因对雌激素受体α和β(ERα和ERβ)是否具有转录活性调节作用。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增MDM2序列,并将其以正确相位与pcDNA3-FLAG载体中的FLAG序列融合,构建成重组质粒pcDNA3-FLAG-MDM2;以含雌激素反应元件的荧光素酶(ERE-LUC)为报告基因,通过检测荧光素酶活性来确定MDM2是否对ER有转录调节因子的作用。结果:克隆和表达了MDM2基因;MDM2只对ERα具有转录活性调节作用。结论:MDM2对ER转录活性的调节具有亚型特异性。     

雌激素受体α磷酸化位点突变体T224A和S559A的构建及其转录激活活性检测

目的:构建雌激素受体α(ERα)T224A和S559A磷酸化位点突变体载体,在HEK293T细胞中检测其表达及突变体生物活性的改变。方法:以pc DNA3-Flag-ERα为模板,通过重组PCR技术扩增目的基因片段并突变碱基,插入pc DNA3-Flag载体;将构建的质粒转染HEK293T细胞进行瞬时表达,通过Western印迹检测融合蛋白的表达,采用萤光素酶报告基因方法检测ERα突变体的活性改变。结果:T224A和S559A磷酸化位点突变体在HEK293T细胞中得到表达,相对分子质量为66×103。在无雌激素(E2)时,野生型ERα及T224A和S559A突变体的转录活性分别为空载体的1.94、1.49和1.84倍;在雌激素存在时,野生型ERα活性增强了1.57倍,T224A和S559A突变体活性分别增强了0.54和0.61倍。结论:224位Thr磷酸化修饰对ERα的活性起重要作用,且2个磷酸化位点突变体受雌激素调控减弱。     

雌激素受体α真核表达载体的构建及其转录活性

目的：构建雌激素受体α（ERα）高效真核表达载体,并检测其转录活性。方法：用常规PCR方法特异扩增带有Flag标签的人ERα全长编码序列,经双酶切后将其克隆到真核表达载体pIRESpuro2中,构建重组质粒pIRESpuro2-Flag-ERα;用Westernblot鉴定该重组质粒介导的Flag-ERα在人胚肾细胞株293T中的表达情况;用含雌激素应答元件的报告基因系统检测ERα的转录活性。结果：构建了pIRESpuro2-Flag-ERα重组质粒,该质粒介导的融合蛋白在293T细胞中得到表达,并可以激活含雌激素应答元件的报告基因的活性。结论：ERα高效真核表达载体的构建为进一步研究ERα在乳腺癌中的作用奠定了基础。     

新型雌激素受体ERα30过表达促进人乳腺癌细胞的增殖及其机制

为进一步探讨前期报道的新型人雌激素受体ERα30的功能及其作用机制,本研究应用EdU法研究新型人雌激素受体ERα30过表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖能力的影响,并通过实时荧光定量RT-PCR检测ERα相关靶基因的差异表达。结果显示,ERα30过表达促进了MDA-MB-231细胞的增殖,同时上调了c-jun及EGFR基因的表达,提示ERα30可能通过非经典机制发挥作用。本研究为后续深入研究ERα30在乳腺癌发生发展中的作用提供了良好的基础,为乳腺癌的诊断、治疗及预后提供新的视角。     

雌激素对成年和老年雌性大鼠血管平滑肌细胞雌激素受体α表达的影响及其机制

目的探讨雌激素对成年和老年雌性大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)雌激素受体α(ERα)表达的影响及其机制。方法采用RT-qPCR、Western blot及重硫酸盐修饰后测序(BSP)的方法,检测体外培养的3-4代成年(2-3月龄)和老年(≥20月龄)雌性SD大鼠VSMC在无或有生理剂量(10-10 mol/L、10-8 mol/L)17β-雌二醇(E2)存在下,ERα的表达及其启动子区CpG岛甲基化水平的变化。结果成年雌性大鼠VSMC无论在有或无雌激素存在时均表达ERα,且表达水平随雌激素浓度增加而上升。而老年雌性大鼠VSMC无论是在mRNA水平还是蛋白质水平几乎检测不到ERα表达,即使补充雌激素达最高生理剂量也无法诱导ERα的重新表达,其ERα基因启动区CpG岛呈现高水平甲基化。结论成年大鼠VSMC表达ERα,且生理剂量雌激素对其表达具有诱导作用。而老年大鼠VSMC ERα基因由于CpG岛已发生高度甲基化而抑制,生理剂量雌激素对ERα表达的诱导作用丧失。     

LRP16与 ERα相互作用增强ERα介导的转录活性

LRP16是一个雌激素（E2）通过受体α（ERα）诱导表达的靶基因,LRP16不仅促进人乳腺癌MCF-7细胞的增殖,而且促进细胞的侵袭生长,但对LRP16作用的分子机制尚不清楚.首先,检测到LRP16表达缺陷明显削弱了MCF-7细胞对E2的反应性增殖能力;采用Northern 印迹与Western印迹法,进一步检测到抑制LRP16表达,明显损害了ERα靶基因对E2诱导上调的反应性,这些基因包括了cyclin D1, c-myc, c-fos,MTA3, pS2和维甲酸受体α基因（RARα）等;以上结果提示,LRP16参与了ERα介导的信号途径.将ERα模式启动子报告基因3×ERE-TATA-luc,ERα以及LRP16表达载体共转染MCF-7与HeLa细胞.结果发现,LRP16增强了ERα对报告基因的转录激活,并呈现对LRP16的剂量依赖性;进而采用GST-pull down以及免疫共沉淀方法证实了LRP16与ERα之间的直接相互作用,该作用不依赖于E2的存在,但可被E2增强;采用哺乳动物双杂交方法进一步证实了ERα与LRP16相互作用位点存在于A/B区的激活功能域-１（AF1）.以上结果表明,LRP16是ERα的一个共激活因子,通过相互作用,LRP16增强了ERα介导转录活性.该研究为LRP16促进ERα阳性乳腺癌细胞增殖与侵袭生长提供了合理的分子解释.     

TBK1通过增强雌激素受体α的转录活性参与乳腺癌发生的分子机制

目的:研究乳腺癌细胞中TANK结合激酶1(TBK1)的功能及分子机制。方法:利用含有雌激素应答元件(ERE)的萤光素酶报告基因检测TBK1对雌激素受体α(ERα)转录活性的影响;将TBK1参与激活先天免疫途径的关键位点突变,使其丧失激活先天免疫的功能,再用同样方法检测TBK1突变体对ERα转录活性的影响;采用RT-PCR检测TBK1通过磷酸化修饰对ERα下游基因表达水平的影响。结果:TBK1增强ERα的转录活性,从而增强其下游基因的表达。结论:TBK1能以不依赖于其激活先天免疫途径功能的方式增强ERα的转录活性。     

肝癌细胞雌激素受体显性阴性突变体ERδ5基因的分离及生物学功能分析

临床流行病学研究显示,ERα基因第5外显子缺失突变体ERδ5在原发性肝细胞癌特异性高表达,它被认为是判断肝癌预后的最重要的新型分子标志.本研究从肝癌细胞分离雌激素受体突变体ERδ5基因,并对其进行克隆、表达,探讨其分子生物学特性及生物学功能. 通过反转录PCR,从肝细胞分离出ERδ5基因并将其克隆到真核表达载体,通过体外翻译及Western 印迹验证该基因成功表达;通过细胞荧光技术检测了ERδ5在肝细胞中的定位;利用荧光素酶报告基因检测技术确证ERδ5对ERα转录活性的影响.结果发现,从肝癌细胞分离出长1 113bp的ERδ5基因,该基因编码蛋白在体外不稳定,易于降解.在肝癌细胞中,ERδ5蛋白主要定位在细胞核,与ERα定位极为相似,但在生物学功能上,ERδ5能够明显干扰ERα的转录活性.研究结果表明,ERδ5作为显性阴性突变体,在肝癌细胞中直接抑制ERα的转录活性.     

牙鲆甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的靶基因鉴定

为了鉴定牙鲆甲状腺激素受体TRs介导甲状腺激素调控的靶基因, 研究采用RT-PCR克隆了TRαA基因的CDS区, 并构建了p3×Flag-TRαA重组真核表达载体;该重组质粒转染HEK293T细胞后, RT-PCR、实时定量PCR与Western blot检测均表明牙鲆TRαA在哺乳动物蛋白表达系统中成功转录并翻译;且重组质粒转染的细胞裂解液通过G1亲和层析柱纯化、过滤除菌可得到纯的融合蛋白3×Flag-TRαA, 然后双荧光素酶报告实验通过在HEK293T细胞中共转染p3×Flag-TRαA和含候选靶启动子的报告基因表达载体pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708, 表明TRαA受体结合在atoh8基因启动子区–1497— –688特异的2个TRE识别序列来调控该基因的转录, 即atoh8是TRαA介导甲状腺激素直接调控的靶基因。研究为深入探究甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的信号通路提供了基础依据。     

乳腺癌乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)与雌激素受体表达的关系

目的探讨乳腺癌乏氧诱导因子-1α(hypoxia induci blefactor-1α,HIF-1α)与雌激素受体(ER)表达的关系。方法利用免疫组织化学方法在42例乳腺癌组织中进行HIF-1α染色,并与ER表达情况及其他临床病理资料进行相关性分析。结果乳腺癌组织中HIF-1α阳性表达率为54.76%,ER表达阳性率为66.67%(28/42)。ER表达率在HIF-1α阳性者中为56.52%,HIF-1α阴性者中为78.95%,P=0.125。而在细胞水平上,ER在HIF-1α阳性者和阴性者中的表达量积分,分别为2.96±1.97、5.11±2.58,t=3.06(P=0.004),Spearman等级分析,r=-0.49(P=0.003)。另外,HIF-1α表达除常见于绝经后患者外,与肿瘤大小、病理类型、孕激素受体、腋窝淋巴结转移、Ki67、C-erbB-2表达均无显著相关。结论乳腺癌组织中HIF-1α表达可能参与了ER表达下调的机制。     

雌激素受体

雌激素受体包括两大类:一是经典的核受体,包括ERα和ERβ,它们位于细胞核内,介导雌激素的基因型效应,即通过调节特异性靶基因的转录而发挥"基因型"调节效应;二是膜性受体,包括经典核受体的膜性成分以及属于G蛋白偶联受体家族的GPER1(GPR30)、Gαq-ER和ER-X,它们介导快速的非基因型效应,通过第二信使系统发挥间接的转录调控功能,其中一些似乎只在脑局部起作用。这两类受体在机体内的分布具有组织/细胞特异性,参与了对诸如生殖、学习、记忆、认知等多种功能的调节。     

LRP16基因通过雌激素受体α介导抑制Ishikawa细胞中E-钙黏着素的转录活性

目的:既往研究表明LRP16基因过表达通过下调E-钙黏着素促进子宫内膜癌Ishikawa细胞的侵袭生长,本研究目的在于探讨LRP16基因下调E-钙黏着素的分子途径。方法:用免疫组化方法检测LRP16基因过表达的Ishikawa细胞中E-钙黏着素的表达;用共转染与荧光素酶实验检测LRP16基因对E-钙黏着素启动子转录活性的影响;用染色质免疫共沉淀实验检测雌激素受体α(ERα)与LRP16蛋白在E-钙黏着素启动子区的招募状况。结果:E-钙黏着素在LRP16过表达的Ishikawa细胞中的表达水平明显下调;LRP16抑制了E-钙黏着素启动子的转录活性,该效应呈现对雌激素(E2)存在的依赖性特征;LRP16本身没有与E-钙黏着素启动子区结合,但明显抑制了ERα与E-钙黏着素启动子区的结合。结论:LRP16通过抑制ERα对E-钙黏着素基因的转录激活活性,下调E-钙黏着素在Ishikawa细胞中的表达水平。     

人KAT7基因促进雌激素受体α表达

目的:构建带有Myc标签的赖氨酸乙酰基转移酶(KAT7)的真核表达载体,获得Myc-KAT7融合蛋白,并检测其对雌激素受体α(ERα)表达的影响。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术从中扩增出人KAT7基因的编码序列,插入p XJ-40-Myc载体;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测转染细胞的表达情况,并提取总RNA采用q RT-PCR检测ERα的表达。结果:双酶切和测序结果表明Myc-KAT7真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后Western印迹鉴定表明融合蛋白得到表达,q RT-PCR表明KAT7在转录水平能够促进ERα表达。结论:构建了带Myc标签的人KAT7真核表达载体,并发现KAT7对ERα的表达具有促进作用。     

新型人雌激素受体(hERα)变异体的克隆及在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的核定位

本研究通过提取人雌激素受体(hERα)阴性的人乳腺癌组织RNA,半巢式RT-PCR扩增获得一种新的hERα变异体ERα30的完整编码序列,并构建pEGFP-N1-ERα30融合表达载体转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231,荧光显微镜观察ERα30的表达及亚细胞定位。结果表明,ERα30的开放阅读框编码271个氨基酸的蛋白质,预测分子量为30 kD,该变体缺乏LBD/AF2结构域,在其C端具有一段特殊的10个氨基酸的结构域;ERα30-EGFP融合蛋白在MDA-MB-231细胞的表达主要分布于细胞核;对ERα30的深入研究有望为乳腺癌的基础与临床研究中有关雌激素效应和ERα功能的问题提供更多的解释。