利用CRISPR/Cas9技术对人多能干细胞进行高效基因组编辑

CRISPR/Cas9技术提供了一个全新的基因组编辑体系。本文利用CRISPR/Cas9平台,在人胚胎干细胞株中对选取的一段特定基因组区域进行了多种基因组编辑：通过在基因编码框中引入移码突变进行基因敲除;通过单链DNA提供外源模板经由同源重组定点敲入FLAG序列;通过同时靶向多个位点诱导基因组大片段删除。研究结果表明CRISPR/Cas9可以对多能干细胞进行高效基因编辑,获得的突变干细胞株有助于对基因和基因组区域的功能进行分析和干细胞疾病模型的建立。     

利用CRISPR/Cas9多基因编辑系统在水稻中快速引入遗传多样性

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-核酸内切酶9(CRISPR/Cas9)系统已经成为许多物种特定基因组编辑的强大工具.利用CRISPR/Cas9多基因编辑系统成功构建共敲除水稻(Oryza sativa)中8个农艺性状基因的载体.通过遗传转化实验和DNA测序,发现8个基因在T_0代有较高的突变效率,并且T_0代突变株的突变类型包括杂合突变和纯合突变.此外,还在T_0代突变株中发现了纯合的六突突变株、七突突变株、八突突变株.由于T_0代植物中获得丰富的突变体组合类型,因而,观测到靶基因多样的突变表型.该研究表明,CRISPR/Cas9系统在作物育种过程中快速引入遗传多样性方面的潜力.     

缺口酶Cas9 D10A和Cas9 H840A在大肠杆菌基因组编辑中的应用

目前Ⅱ型CRISPR/Cas9工具被广泛应用于基因组编辑中,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对大肠杆菌(Escherichia coli)基因组进行编辑,可应用于代谢工程及细菌耐药性等研究领域中。利用单缺口核酸酶Cas9 nickase (Cas9n)工具对宿主细胞基因进行修饰,可降低由于双链断裂对宿主带来的毒性。但目前利用CRISPR/Cas9n对大肠杆菌基因组编辑的研究较少,不利于缺口酶Cas9 D10A和Cas9 H840A在大肠杆菌基因组编辑的应用。本研究在前人报道的细菌双质粒Cas9基因编辑系统(pCas/pTarget)基础上,通过分子突变的方法构建缺口酶Cas9突变体质粒pCas-D10A和pCas-H840A,以及携带修复模板或无修复模板的靶向大肠杆菌sseA基因的质粒pTargetT-△sseA(993 bp)和pTargetT-△sseA,系统研究了两种缺口酶编辑大肠杆菌内源性基因sseA的有效性和效率。在稳定表达pCas质粒的MG1655菌株中转入携带修复模板的pTargetT-△sseA(993 bp)质粒,通过菌落PCR及DNA测序方法验证基因编辑的有...     

CRISPR/Cas9技术特异杀伤癌细胞——癌症治疗新策略北大核心CSCD

CRISPR/Cas9技术,主要用于基因编辑。最近发现,CRISPR/Cas9技术亦可用于特异性杀伤癌细胞。天然状态下,CRISPR/Cas9系统存在于细菌,其功能是识别并切割入侵病毒或噬菌体的DNA,由此导致病毒或噬菌体死亡。因此,对于细菌来说,CRISPR/Cas9是一种＂基因剪刀＂或＂基因武器＂,是细菌重要的＂免疫系统＂。目前,CRISPR/Cas9系统一般用于对单基因或多基因的敲除或插入,以构建细胞或动物研究模型。     

基于CRISPR/Cas9的精准基因编辑技术研究进展

基因编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。基于CRISPR/Cas9系统的精准编辑技术是一个操作方便、应用广泛的基因编辑技术,与传统的CRISPR/Cas9不同,精准基因编辑技术可以在不需要DNA模板的情况下对基因进行定点突变。本文重点介绍了近年来基于CRISPR/Cas9介导的精准基因编辑技术的发展,并深入分析了基因精准编辑技术面临的挑战和机遇。     

CRISPR/Cas9技术特异杀伤癌细胞——癌症治疗新策略

<正>CRISPR/Cas9技术,主要用于基因编辑。最近发现,CRISPR/Cas9技术亦可用于特异性杀伤癌细胞。天然状态下,CRISPR/Cas9系统存在于细菌,其功能是识别并切割入侵病毒或噬菌体的DNA,由此导致病毒或噬菌体死亡。因此,对于细菌来说,CRISPR/Cas9是一种"基因剪刀"或"基因武器",是细菌重要的"免疫系统"。目前,CRISPR/Cas9系统一般用于对单基因或多基因的敲除或插入,以构建细胞或动物研究模型。     

利用CRISPR/Cas9技术构建定点突变小鼠品系

CRISPR/Cas9技术是新近发展起来的对细胞和动物模型进行基因编辑的重要方法。本文利用DNA双链断裂(Double-strand breaks, DSBs)引起的同源重组(Homologous recombination, HR)依赖与非依赖的修复机制,建立基于CRISPR/Cas9核酸酶技术构建定点突变小鼠品系的技术体系。针对赖氨酸特异脱甲基化酶2b(Lysine (K)-specific demethylase 2b, Kdm2b)酶活关键位点对应的基因组DNA序列设计单一导向RNA(Single-guide RNA, sgRNA),通过与Cas9 mRNA共显微注射,分别得到Kdm2b基因发生移码突变的基因失活品系及关键位点氨基酸缺失的酶活突变型小鼠品系。此外,利用HR介导的修复机理,将黄素单加氧酶3(Flavin containing monooxygenases3, Fmo3)基因的sgRNA序列及对应的点突变单链寡脱氧核苷(Single strand oligonucleotides, ssODN)修复模板共注射到小鼠受精卵雄原核。对F₀小鼠基因测序分析显示,成功构建了Fmo3基因移码突变的基因敲除和单碱基定点突变的基因敲入小鼠,这些突变能够稳定遗传给子代。本研究利用CRISPR/Cas9技术,通过同源重组依赖与非依赖两种DNA损伤修复方式,成功构建了特定位点突变的小鼠品系。     

利用CRISPR/Cas9和piggyBac实现果蝇基因组无缝编辑

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein9)是第三代基因组编辑技术。在sgRNA引导下,Cas9核酸内切酶作用于特定基因组序列,产生DNA双链断裂(double-strandedbreaks,DSBs),利用同源定向修复(homology-directedrepair,HDR)可实现对靶基因的特异性基因敲除(knock-out)或敲入(knock-in)。传统的技术方案将CRISPR/Cas9技术与Cre/loxP或FLP/FRT系统联用,可实现高效的基因打靶,也易于移除打靶过程中引入的筛选标记。然而,筛选标记移除过程中会在基因组中残留34个碱基的标签序列。因此,对基因组进行精确编辑的同时不引入无关序列仍有一定难度。在人工诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的基因组编辑中,CRISPR/Cas9技术和piggyBac转座酶联用的两步法策略能够实现这一目标:首先运用CRISPR/Cas9技术,利用同源定向修复原理引入基因突变及筛选标记,然后利用piggyBac转座酶将筛选标记精确移除。借鉴该方法的技术原理,本研究对果蝇(Drosophila melanogaster)CG4894基因进行了无缝编辑(seamless genome editing),成功将该基因第18外显子上第21位的酪氨酸(tyrosine,Y)突变为半胱氨酸(cysteine,C),且测序结果显示基因组中除设计位点之外并无其他外源序列残留。CRISPR/Cas9技术和piggyBac转座酶联用策略为果蝇基因组的精确编辑提供了更多选择。     

利用CRISPR/Cas9技术构建大鼠L2细胞α-ENaC基因敲除稳定细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建大鼠L2细胞α-ENaC基因敲除的细胞株,研究α-ENaC基因对细胞增殖的影响。构建敲除α-ENaC基因的CRISPR/Cas9表达载体和筛选报告载体,通过转染和嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞株,Western Blot、测序确定突变的细胞株,CCK-8检测突变细胞株的增殖活力。成功构建靶向α-ENaC基因第一外显子的CRISPR/Cas9表达载体和筛选报告载体,嘌呤霉素筛选后,挑选8个单细胞克隆中有两个单细胞克隆α-ENaC蛋白表达下降,一个单细胞克隆α-ENaC蛋白不再表达,测序结果显示3个单细胞克隆分别为2个单等位基因突变和1个双等位基因突变,且未发现脱靶现象。突变细胞株的增殖活力降低,其中双等位基因突变细胞株增殖活力降低更为显著。因此,利用CRISPR/Cas9结合SSA-RPG报告载体成功获得了α-ENaC基因敲除的L2细胞株,α-ENaC与细胞增殖有关。     

CRISPR/Cas系统的研究进展及前沿应用

CRISPR/Cas系统作为一种高效的基因组编辑工具,已经被广泛地研究和应用于各个领域。CRISPR/Cas系统已从最初的CRISPR/Cas9发展到现在的CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas13a、CRISPR/dCas等十多种基因编辑系统;从原来的靶向作用于DNA到现在的除了靶向作用于DNA和RNA外,还能应用于转录调控、DNA循环等无需基因编辑的领域。CRISPR/Cas系统以往存在的诸多局限性正在被一个一个突破,该系统的应用已经进入了一个新的时代。本文对CRISPR/Cas系统近些年的发展情况以及新发现的各种CRISPR/Cas系统做了一个总结,并列举了各个系统最新的应用情况。     

利用CRISPR/Cas9核酸酶靶向细菌必需基因的特异性抗菌剂研究（英文）

CRISPR/Cas9核酸酶是一种高效和精确的基因组DNA编辑工具。目前,CRISPR/Cas9被开发成一种新型抗菌剂,通过靶向破坏目标基因,例如抗生素耐药基因来诱导细菌死亡。本研究利用CRISPR携带多靶点优势,同时靶向大肠杆菌必需基因gyrA、gyrB和folA,以达到杀菌作用。本设计针对3个内源基因的CRISPR系列载体,分别含有1个、2个或3个靶点。当IPTG诱导Cas9表达后,CRISPR RNA (crRNA)和反式作用CRISPR RNA (trans-activating CRISPR RNA, tracrRNA)复合物募集Cas9切割靶基因,导致细菌死亡。随着crRNA中靶点数量的增加,杀菌效率显著提高。当含有3个靶点的crRNA作用于细菌基因组时,杀菌效率达到99.35%。此外,在存活的大肠杆菌中,crRNA表达质粒的靶序列和直接重复序列发现碱基缺失,而内源靶基因和Cas9基因均未发生突变。最后,该CRISPR系统还应用于其他大肠杆菌实验室菌株和产肠毒素K88菌株,并表现出高效的杀菌作用。我们设计了一种基于CRISPR/Cas9核酸酶的新型抗菌剂,为抗菌剂的研发提供新策略。     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的人类遗传疾病基因治疗相关研究进展

CRISPR/Cas9系统(常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统)为靶向基因编辑提供了强大的技术手段.利用序列特异性sgRNA的引导,CRISPR/Cas9系统能够精准地在目标DNA的确切位置导入双链切口.与已有的基因编辑手段相比,该系统具有更优异的简便性、特异性和有效性.目前,大量涉及体内外多物种的CRISPR/Cas9基因编辑研究已充分展示了该技术的巨大潜力,为基于该技术的疾病治疗研究和临床应用带来了希望.基于CRISPR/Cas9基因编辑技术所介导的非同源性末端连接和同源性DNA修复作用,近期多个研究工作已经成功应用该技术修复了包括点突变和基因组缺失等在内的遗传疾病相关基因组缺陷.本综述将总结近期有关利用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗人类遗传性疾病的相关临床前研究进展.     

人类胚胎单碱基编辑治疗遗传疾病的研究

基因编辑技术是当今生物学研究领域最为重要的颠覆性技术之一,以CRISPR/Cas9系统为核心的基因编辑工具被广泛应用于包括人类体细胞、生殖细胞编辑相关的医学研究领域。虽然CRISPR/Cas9系统可以高效编辑靶基因,但其精准编辑能力依赖于效率极低的同源重组方式,这极大限制了其定点编辑的能力与应用范围,所以寻找一种能高效引入点突变的新型基因编辑工具具有重大的应用价值。以CRISPR/Cas9系统为基础的单碱基编辑系统可以在基因组靶位点实现精准、高效的C/G和T/A碱基间的转换,其编辑能力已经在动植物、人体细胞以及人类胚胎中得到证实。利用单碱基编辑技术,有望对人类超过70%的相关遗传性致病位点进行修复。现就人类胚胎单碱基编辑治疗遗传疾病的最新研究进展进行综述和展望。     

CRISPR /Cas9基因编辑技术在山羊和绵羊中的应用研究进展

CRISPR/Cas9系统是近年来新兴的一种基因编辑技术,可将特定DNA基因序列敲除、插入或定点突变,具有快捷、高效、精准、特异性高等特点,广泛地应用于遗传育种、生物医药和基因工程等研究领域。山羊和绵羊是重要的经济家畜动物和实验动物,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对羊进行遗传修饰,将加速品种改良,提高动物生产性能,获得更加优质的农副产品。主要对CRISPR/Cas9基因编辑技术的概述、作用机理及在羊乳"人源化"改造、提高肉品质、改善毛纤维质量等方面的应用研究进展及发展前景作简要阐述,以期为相关科研人员提供参考。     

CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命,该技术可以对基因组特定位点进行靶向编辑,包括缺失、插入、修复等。CRISPR/Cas9比锌指核酸酶 (ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术更易于操作,而且更高效。CRISPR/Cas9系统中的向导RNA(Single guide RNA, sgRNA)是一段与目标DNA片段匹配的RNA序列,指导Cas9蛋白对基因组进行识别。研究发现,设计的sgRNA会与非靶点DNA序列错配,引入非预期的基因突变,即脱靶效应(Off-target effects)。脱靶效应严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。为了避免脱靶效应,研究者对影响脱靶效应的因素进行了系统研究并提出了许多降低脱靶效应的方法。文章总结了CRISPR/Cas9系统的应用及脱靶效应研究进展,以期为相关领域的工作提供参考。     

CRISPR/Cas9切割痘病毒DNA抑制病毒复制

当前,CRISPR/Cas9系统靶向痘苗病毒的相关研究鲜有报道。该文采用了CRISPR/Cas9基因组定点编辑技术,以痘病毒为研究对象。在重组痘病毒WR-EGFP中针对EGFP基因序列设计不同靶点g RNAs,转染Cas9/g RNA质粒,同时感染WR-EGFP痘病毒,随后观察EGFP荧光表达、提取病毒基因组,通过PCR进行切口鉴定并运用错配酶切法验证CRISPR/Cas9对痘病毒靶点DNA切割的切口修复情况。与单独感染WR-EGFP组相比,转染了Cas9/g RNA174和Cas9/g RNA175质粒的EGFP荧光强度明显降低,表明CRISPR/Cas9抑制WR-EGFP病毒中EGFP基因的表达。相对定量PCR及错配酶切实验结果显示,CRISPR/Cas9切割靶点导致WR-EGFP病毒基因组产生了切口,并且存在DNA错配修复现象。最后,通过结晶紫染色法测定痘病毒的滴度,结果显示,经CRISPR/Cas9处理组的痘病毒滴度显著下降,即CRISPR/Cas9能够使痘病毒的复制能力显著地降低。综上所述,CRISPR/Cas9切割痘病毒基因组DNA并且抑制痘病毒复制。     

植物CRISPR基因组编辑技术的新进展

在过去的4年中,CRISPR/Cas9基因组编辑技术成为生命科学领域的革命性工具,为植物学基础研究和农作物遗传改良提供了高效、快速而又廉价的遗传操作工具。利用CRISPR/Cas9系统可以实现精准的knock-out和knock-in等遗传操作,也可用于靶向激活或抑制基因的表达。在CRISPR/Cas9被广泛地用于基因组编辑的同时,它的编辑能力、效率和精确度也在不断地改进和完善,特别是CRISPR/Cpf1系统的发掘和单碱基编辑技术的创建,使CRISPR系统正逐步成为一个理想的遗传工程技术平台。此外,利用CRISPR/Cas9技术改良的农作物品种也已经涌现,这必将推动精准基因组编辑技术在农作物遗传改良中的应用和发展。     

CRISPR/Cas9基因组编辑技术在番茄中的应用现状及展望北大核心CSCD

CRISPR/Cas9技术是一种能够快速对基因组靶位点进行特定DNA修饰的编辑工具。该文对近年来国内外有关CRISPR/Cas9技术在改善番茄农艺性状及提高生物、非生物胁迫抗性方面的研究进展进行综述,并集中讨论了CRISPR/Cas9面临的一些问题,为该基因编辑技术在番茄的种质创新及基因功能研究方面的应用提供参考。     

基因组编辑对酿酒酵母DNA的损伤作用及修复响应

【目的】为了研究基因组编辑工具CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1所产生的DNA双链断裂(DNA doublestrandbreak,DSB)对酿酒酵母DNA的损伤作用及修复响应情况,对比化学物质甲基磺酸甲酯(methyl methanesulfonate,MMS)对酿酒酵母基因组DNA的损伤和修复,阐明编辑细胞在细胞水平和转录水平上的变化。【方法】起始细胞分为两种情况,包括未进行细胞周期同步化和被α-因子同步化细胞周期至G0/G1期。检测CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1处理后编辑细胞的生长情况。利用流式细胞术检测编辑细胞的细胞周期延滞的情况。利用荧光定量PCR检测编辑细胞和MMS处理细胞后DNA损伤响应关键基因转录表达水平的变化情况。【结果】起始细胞无论是未同步化还是同步化,其生长均受到基因组编辑抑制,细胞存活率降低,细胞周期被滞留在G2/M期,而MMS处理导致细胞周期S期的滞留。此外,随编辑时间的延长,突变率增加,细胞存活率降低。CRISPR/Cpf1编辑细胞的突变率和存活率均低于CRISPR/Cas9,由此可见,CRISPR/Cpf1对细胞的损伤强度高于CRISPR/Cas9。两种编辑均诱导酵母DNA损伤响应关键基因RNR3及HUG1转录水平显著上调,并且CRISPR/Cpf1介导的上调幅度大于CRISPR/Cas9,但两者均低于MMS的处理。【结论】本研究解析了CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1介导的基因组编辑在细胞水平和转录水平上对DNA损伤作用及修复响应,初步揭示了酿酒酵母应对不同类型的DSB损伤时响应程度的差异,为提高基因组编辑工具的编辑能力和评估基因编辑安全性提供了重要依据。