周期性静水压对人软骨细胞活性的时间依赖性影响

目的：目前软骨细胞体外研究多为动物模型,本研究以正常成人软骨细胞研究对象,探讨在适当强度、类型的周期性静水压下不同持续时间对软骨细胞活性的影响,探究人软骨细胞体外培养、构建组织工程软骨合适的时间参数。方法：将体外培养的正常成人膝关节软骨第3代软骨细胞随机分为4组：4h组、8h组、12h组、对照组。应用高压恒温静水压加压系统,充入含有95％的空气和5％的CO2混合气体,以2MPa压力大小对3个实验组进行周期性加压,分别每天加压4h、8h、12h,三组加压时间均为10d。10d后倒置相差显微镜下观察4组细胞形态,甲苯胺蓝及II型胶原免疫细胞化学染色进行细胞鉴定,并对II型胶原免疫细胞化学染色行半定量分析。MTT法分析各组软骨细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：3个实验组细胞增殖均快于对照组（P〈0．05）,与对照组相比4h组、8h组均抑制凋亡,12h组促进凋亡。12h组第6代细胞开始细胞形态即逐渐发生改变。结论：软骨细胞的增殖和凋亡水平对静水压的作用时间具有依赖性。在2MPa静水压力下,8h组更适合细胞生长,细胞活性更强。为进一步构建组织工程软骨人类模型及组织工程软骨的临床应用提供了一定的实验基础。     

人软骨细胞压力实验模型的建立与评估

目的:人承重关节内受到的多种机械应力(剪切力、张力、静水压力等)在调节关节软骨细胞的生理功能方面起着重要作用。建立对人膝关节软骨细胞施加不同强度周期性静水压的压力模型,观察不同压力强度下软骨细胞的生长形态、增殖和凋亡情况。方法:采用酶消化法分离培养正常成人膝关节软骨细胞,将培养的第3代软骨细胞分为6组:对照组、0.5 MPa组、1.0 MPa组、3.0MPa组、5.0 MPa组、8.0 MPa组,应用高压恒温静水压加载系统分别给予各组不同强度压力作用5 d,每日1 h。甲苯胺蓝染色法和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色法鉴定软骨细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态和生长状况,流式细胞术检测细胞凋亡,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线。结果:与对照组相比,0.5 MPa、3.0 MPa组无明显差异(P0.05);1.0 MPa组能促进软骨细胞增殖,抑制凋亡(P0.05);5.0 MPa组出现细胞增殖能力下降,细胞活力降低,凋亡率增加(P0.05);8.0 MPa组则表现出明显的细胞增殖的抑制和细胞凋亡趋势(P0.05),以及细胞形态学的改变。结论:不同强度的周期性压力对人软骨细胞的新陈代谢产生了不同影响,尤其在软骨细胞的增殖和凋亡水平方面。利用本压力实验模型能体外模拟人负重关节软骨细胞的受压情况,初步确定了人软骨细胞压力实验中压力梯度的选择。为软骨细胞的压力损伤研究提供了实验数据,为进一步探寻压力作用与骨关节炎的关系提供了实验平台。     

周期性张应力对大鼠髁突软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响

目的:在成功构建髁突软骨细胞体外培养-力学刺激模型的基础上,探讨周期性张应力对髁突软骨细胞主要细胞外基质(Ⅱ型胶原)合成的影响.方法:本研究采用FX-5000T应力加载系统对体外培养的第3代大鼠髁突软骨细胞分别施加1h、6h、12h和24 h的周期性张应力,应力刺激强度为10％1 HZ.加力完成后即刻收集加力细胞,提取细胞总RNA反转录成cDNA,应用RT-PCR技术检测髁突软骨细胞主要细胞外基质Ⅱ型胶原(type-Ⅱ collagen,Col-Ⅱ)mRNA的表达变化情况.结果:与对照组(0h组)相比,加力1 h时Col-Ⅱ的表达增加,但无统计学意义;加力6h时Col-Ⅱ表达显著增加(P＜0.05);加力12h时Col-Ⅱ表达开始下降;当加力至24h时表达量显著降低(P＜0.05).结论:周期性张应力可以影响髁突软骨细胞主要细胞外基质的合成,在一定范围内随加力时间的延长基质合成逐渐增强;进一步延长加力时间,基质的合成受到明显抑制.     

TGF-β1对体外培养的关节软骨细胞的作用

以原代培养的软骨细胞为材料,研究了转化生长因子IGF－β1对关节软骨细胞的增殖和软骨特异性基质代谢的作用,结果显示TGF－β1可以刺激细胞外基质中蛋白多糖含量的增加,并可以在转录水平上调节Ⅱ型胶原的表达。TGF－β1可以在体外诱导高密度培养的软骨细胞形成透明软骨样结构。没有用TGF－β1处理的高密度培养细胞不能形成透明软骨样结构,在透射电镜下观察发现其内部结构发生了异常变化。这些结果表明TGF－β1对于支持关节软骨细胞的体外培养具有重要的作用。     

低强度激光对人红细胞生物物理特性的影响

研究不同功率的低强度He-Ne激光对正常人体红细胞流变学特性影响。以正常人体红细胞为研究对象,测量了低强度He-Ne激光在不同照射时间、不同功率条件下红细胞的变形、取向、膜流动性、膜的微粘度和渗透脆性的变化情况。结果表明:照射后红细胞的变形性和膜流动性增强、渗透脆性下降。照射对红细胞流变学特性影响显著,其中激光能量为0.24 J、照射血样为2 mL时取得的照射效果最佳。     

高密度微团培养法对人骨关节炎软骨细胞分化影响的实验研究

目的探讨高密度微团(Micromass)的细胞培养方法对人骨关节炎软骨细胞终末期成熟分化的作用影响。方法临床获取人骨关节炎关节软骨组织,分离骨关节炎软骨细胞,分别进行低密度单层培养和高密度微团培养,隔日细胞换液1次。每2日倒置显微镜观察细胞形态的变化;碱性磷酸酶(ALP)染色方法检测ALP的分泌;RT-PCT方法检测细胞内Col2、Aggrecan、ALP和MMP-13等因子mRNA的表达。结果人骨关节炎软骨细胞具有自发性向终末期成熟分化的特征,在相同时间点,Micromass培养的软骨细胞与低密度单层培养的细胞相比,更具有软骨细胞的形态特征;ALP染色显示,Micromass培养的细胞内ALP染色强度明显减弱;RT-PCT显示,Micromass培养的细胞内Col2和Aggrecan因子mRNA的表达显著提高(P0.05);ALP和MMP-13因子mRNA的表达显著降低(P0.05)。结论高密度微团培养法抑制人骨关节炎软骨细胞过快的成熟分化,更好的维持了细胞的软骨细胞表型。     

自体软骨细胞移植技术治疗膝关节软骨缺损的研究进展

膝关节软骨缺损发病率高,且自身修复能力有限。治疗膝关节软骨缺损的传统方法包括钻孔术、微骨折术、自体骨软骨移植术。然而,钻孔术和微骨折术治疗后缺损区生成的是纤维软骨,而不是正常的透明软骨,两者在力学强度、硬度、耐磨损性等多方面存在很大差距。自体骨软骨移植术可生成正常的透明软骨,但存在供体有限、不适合进行大面积软骨缺损治疗等多方面缺点在临床方面应用受限。近年来,自体软骨细胞移植技术发展迅速,越来越多的病人接受此治疗方法并获得良好效果,引起人们广泛关注。本文根据近年来国内外的各项相关研究成果进行总结,阐述膝关节软骨缺损的各种治疗方法,着重介绍自体软骨细胞移植技术。第三代自体软骨细胞移植技术生成的软骨以透明软骨为主,符合关节生物力学要求,且避免了第一代、第二代自体软骨细胞移植的术后并发症,成为治疗膝关节大面积软骨缺损安全有效的治疗方法。另外,本文就软骨细胞支架材料的发展、移植物术后的转归等问题提出进一步设想。     

几丁质支架对间充质干细胞成软骨分化中Ⅱ型胶原表达的影响

目的将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞,观察分化后的细胞在单层培养和几丁质支架上培养的差别。方法抽取兔股骨骨髓,密度梯度离心分离BMSCs,用TGF-β1诱导第3代的BMSCs向软骨方向分化,2周后用免疫组化检测Ⅱ型胶原表达情况。将分化后的软骨样细胞传代,用无TGF-β1的培养基分别进行单层培养和接种在几丁质支架上培养2周,再用免疫组化检测Ⅱ型胶原表达情况。结果BMSCs经TGF-β1诱导后,具有软骨细胞特点,然而进行无TGF-β1的继续培养后,单层培养的类软骨细胞很快呈去分化表型,而接种在支架上的细胞仍能较好表达Ⅱ型胶原。结论几丁质支架具有延缓软骨样细胞去分化和老化的作用。     

低强度微波辐射对人精子非热生物效应的研究

选用频率２４５０ＭＨｚ分别在３、５、７、９ｍＷ／ｃｍ２的功率密度,使用新型宽带横电磁传输室（ＢＴＥＭＣＥＬＬ）辐射人精子１小时,我们发现只有５ｍＷ／ｃｍ２的强度对人射子的活动度、存活率、畸形率又穿卵率有显著的影响,这表明在５ｍＷ／ｃｍ２附近存在明显的功率密度窗效应。同时还发现,７ｍＷ／ｃｍ２组的精子的染色体出现畸变。最后对实验结果进行了讨论。     

人正常及骨关节炎软骨细胞体外培养的对照研究

摘要目的：研究人正常软骨细胞及骨关节炎软骨细胞的体外分离、培养及鉴定方法,对其生物学特性进行对照并评价其生物学活性。方法：取人创伤性截肢与骨关节炎全膝置换的无菌膝关节软骨,采用两步酶消化法分离培养人关节软骨细胞,并进行传代培养。通过倒置相差显微镜下观察细胞形态,绘制生长曲线,测细胞增殖,甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色对细胞进行对照研究。结果：骨关节炎软骨细胞形态似成纤维细胞,生长速度明显较正常软骨细胞慢。MTT测细胞增殖显示,第2．4、6代骨关节炎软骨细胞在相同时间点大都比同代正常软骨细胞增殖速度慢（P〈0．05）。甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化染色显示,骨关节炎软骨细胞染色较正常软骨细胞浅,经多次传代后基本无着色。结论：正常软骨细胞5代以内细胞生长良好,生物学特性明显,5代以后出现去分化现象。骨关节炎软骨细胞增殖慢,生物学特征退变旱,符合软骨细胞退变的表现。这为骨关节炎在软骨细胞水平的研究提供了实验基础。     

周期性静水压对人软骨细胞IL-1beta和MMP-3 代谢的影响

目的：以正常成人软骨细胞及OA软骨细胞为研究对象,探讨在静水压作用下正常软骨细胞IL-1beta和MMP-3 代谢的变化, 以及与OA软骨细胞之间的差异。同时观察在力学信号刺激下软骨细胞的IL-1beta和MMP-3 代谢有无相关性。方法：将体外培养的 正常成人膝关节软骨第3 代软骨细胞随机分为加压组和对照组。甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。将加压 组细胞放入高压恒温静水压加压系统,冲入含有95％的空气和5％的CO2混合气体,以10MPa 进行加压2h,共加压5d。分别于 加压前、加压第3 天、加压第5 天后取加压组、对照组和OA 组细胞培养液检测IL-1beta、MMP-3 含量。同时采用MTT 法分析3 组 细胞的增殖情况。对三组细胞中IL-1beta与MMP-3 的水平做双变量相关分析,采用方差分析对三组标本间的IL-1beta、MMP-3 含量进 行比较。结果：各组细胞IL-1beta与MMP-3 两者间存在正相关关系。OA组细胞中IL-1beta与MMP-3含量高于加压组和对照组,加压 组高于对照组。加压组、OA组软骨细胞的生长曲线与对照组相比增殖高峰降低,平台时间缩短。结论：10MPa 间歇性静水压加压 可抑制软骨细胞增殖,增加IL-1beta与MMP-3 分泌。     

Collagen XI chain misassembly in cartilage of the chondrodysplasia (cho) mouse

Molecular mechanisms controlling the assembly of cartilage-specific types II, IX and XI collagens into a heteropolymeric network of uniformly thin, unbanded fibrils are not well understood, but collagen XI has been implicated. The present study on cartilage from the homozygous chondrodysplasia (cho/cho) mouse adds support to this concept. In the absence of alpha1(XI) collagen chains, thick, banded collagen fibrils are formed in the extracellular matrix of cho/cho cartilage. A functional knock-out of the type XI collagen molecule has been assumed. We have re-examined this at the protein level to see if, rather than a complete knock-out, alternative type XI chain assemblies were formed. Mass spectrometry of purified triple-helical collagen from the rib cartilage of cho/cho mice identified alpha1(V) and alpha2(XI) chains. These chains were recovered in roughly equal amounts based on Coomassie Blue staining of SDS-PAGE gels, in addition to alpha1(II)/alpha3(XI) collagen chains. Using telopeptide-specific antibodies and Western blot analysis, it was further shown that type V/XI trimers were present in the matrix cross-linked to each other and to type II collagen molecules to form heteropolymers. Cartilage from heterozygous (cho/+) mice contained a mix of alpha1(V) and alpha1(XI) chains and a mix of thin and thick fibrils on transmission electron microscopy. In summary, the results imply that native type XI collagen molecules containing an alpha1(XI) chain are required to form uniformly thin fibrils and support a role for type XI collagen as the template for the characteristic type II collagen fibril network of developing cartilage.     

全反式维甲酸对骺软骨细胞生物学行为及其功能影响的研究

该研究主要探讨了体外高浓度全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)对SD大鼠骺软骨细胞生物学性状和功能的影响以及体内ATRA对SD大鼠胫骨生长板的影响。以SD大鼠骺软骨细胞为研究对象、ATRA为干预因素,采用CCK-8、细胞流式术、HE染色、Annexin V-FITC细胞凋亡流式检测术、Hoechst染色、细胞划痕、Transwell实验分别评估ATRA处理后细胞的增殖、周期、形态、凋亡及迁移情况,Western blot检测蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、X型胶原等相关功能蛋白的变化;以3周雄性SD大鼠为实验对象,分为对照组、60 mg/kg·d ATRA组、80 mg/kg·d ATRA组,进行10天连续ATRA灌胃处理,测量每只SD大鼠灌胃第1天、第10天的头尾长,处理10天后对胫骨生长板进行HE染色。结果表明,ATRA作用SD大鼠骺软骨细胞后,增殖能力减弱且细胞周期被阻滞在S期(P<0.01),细胞形态由三角形、多边形变为长条状,凋亡的发生增多(P<0.01),迁移能力受到抑制(P<0.05)以及Western blot结果显示蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、X型胶原等功能相关蛋白较对照组表达均明显降低(P<0.01);对SD大鼠进行ATRA灌胃处理后,与对照组比较,60 mg/kg·d ATRA组和80 mg/kg·d ATRA组的头尾长均变短(P<0.01);胫骨生长板HE染色显示,ATRA灌胃组的生长板变窄甚至闭合。该研究证实了体外高浓度ATRA能够对SD大鼠骺软骨细胞的增殖、迁移起抑制作用,同时能够诱导凋亡,降低相关功能蛋白的表达,在SD大鼠体内证实,过量ATRA可影响生长板软骨内成骨过程,最终使生长板部分或全部提前闭合,进而影响SD大鼠身长的增长。     

Type II Collagen Expression Is Regulated by Tissue-specific miR-675 in Human Articular Chondrocytes

miRNAs have been shown to be essential for normal cartilage development in the mouse. However, the role of specific miRNAs in cartilage function is unknown. Using rarely available healthy human chondrocytes (obtained from 8 to 50 year old patients), we detected a most highly abundant primary miRNA H19, whose expression was heavily dependent on cartilage master regulator SOX9. Across a range of murine tissues, expression of both H19- and H19-derived miR-675 mirrored that of cartilage-specific SOX9. miR-675 was shown to up-regulate the essential cartilage matrix component COL2A1, and overexpression of miR-675 rescued COL2A1 levels in H19- or SOX9-depleted cells. We thus provide evidence that SOX9 positively regulates COL2A1 in human articular chondrocytes via a previously unreported miR-675-dependent mechanism. This represents a novel pathway regulating cartilage matrix production and identifies miR-675 as a promising new target for cartilage repair.     

Sox9治疗兔椎间盘退变的效果及机制研究

目的:探究Sox9用于治疗椎间盘退变的效果及调控机制。方法:将Ad-sox9和Ad-GFP各20μL分别转染至椎间盘退变兔的髓核组织中,转染后3、7、30、60天取材,采用免疫组化、免疫荧光和MRI等研究方法检测椎间盘髓核组织中II型胶原、蛋白多糖的表达情况,并分析对椎间盘退变的改善情况。结果:免疫组化染色显示sox9组中椎间盘髓核组织中II型胶原、蛋白多糖的表达明显升高,MRI显示sox9组椎间盘T2像信号有明显改善(P<0.05)。结论:体内转染腺病毒介导的sox9基因能够增加椎间盘内II型胶原和蛋白多糖的表达,并抑制椎间盘的退变进程。