PKR 通过SUMO化修饰调控胰岛beta细胞P53 功能上调

目的：探讨PKR通过SUMO 化修饰上调P53 功能,阐明胰岛beta细胞增殖抑制的分子机制。方法：转染wt-PKR 质粒并结合 BEPP刺激,诱导PKR在胰岛beta细胞特异性激活。免疫印迹和免疫共沉淀技术检测P53 及P53-SUMO-1 蛋白结合水平变化;并给 予SUMO 化抑制剂Spectomycin B1,分析其相关分子机制。结果：免疫印迹和实时定量PCR 检测表明：PKR 特异激活能诱导P53 蛋白水平而不是mRNA水平上调;免疫共沉淀分析显示：PKR 促进了SUMO-1 与P53 蛋白结合水平的增加;而Spectomycin B1 能抑制PKR 诱导的P53 蛋白水平及其与SUMO 结合的增加。结论：PKR能通过促进P53 的SUMO 化修饰,上调其功能,诱导胰 岛beta细胞增殖抑制,可能参与2 型糖尿病的发生和病程发展。     

植物蛋白质SUMO化修饰体外高效检测系统

蛋白质SUMO化修饰是一种调控蛋白命运的关键修饰方式, 广泛参与植物生长发育及逆境胁迫响应。SUMO化修饰过程主要由激活酶(E1)-结合酶(E2)-连接酶(E3)组成的级联酶促反应催化, 其关键酶组分将SUMO分子缀合至底物蛋白的赖氨酸残基, 形成共价异肽键以完成SUMO化修饰过程。该文报道了1种植物蛋白质SUMO化修饰体外高效检测系统, 通过在大肠杆菌(Escherichia coli)中构建拟南芥(Arabidopsis thaliana) SUMO化修饰的关键通路实现对底物蛋白的SUMO化修饰, 结果可通过免疫印迹进行检测。该系统可以简化植物蛋白质SUMO化修饰的检测流程, 为植物细胞SUMO化修饰的功能研究提供了有力工具。     

SUMO在阿尔茨海默症及其运动干预调节中的作用

阿尔茨海默症(Alzheimer's diseases, AD)是一种常见的神经退行性疾病,俗称老年性痴呆。脑内Aβ过度聚集、Tau蛋白过度磷酸化和神经元凋亡是AD的主要病理特征。小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier, SUMO)通过与底物蛋白结合参与蛋白质翻译后修饰,已被发现可通过以下方式参与AD的病理过程,主要有:(1) SUMO修饰BACE1,促进Aβ产生;(2) SUMO修饰Tau蛋白,促进其磷酸化并抑制其被泛素蛋白酶系统降解;(3) AD脑内SUMO化异常导致神经元过度凋亡。运动已被证实可改善AD病理特征,调节体内SUMO化水平,这提示运动缓解AD可能存在SUMO化机制。现通过综述SUMO与AD,以及运动对SUMO的影响,阐述SUMO介导的运动抗AD的可能机制。     

SUMO化修饰的Apak对核糖体RNA合成的调控作用

核糖体是由核糖体RNA和核糖体蛋白组成的复合体,其功能是参与蛋白质合成.SUMO化修饰的底物蛋白对核糖体的形成有重要调控作用.前期研究发现,KRAB型锌指蛋白Apak能特异地抑制p53所介导的凋亡通路.进一步研究发现,在核仁应激及癌基因激活条件下,抑癌蛋白ARF促进Apak发生SUMO化修饰并促使其移位于核仁.为了进一步探讨SUMO化修饰的Apak对核糖体RNA合成的调控功能,本研究通过Northern blot检测SUMO化修饰的Apak对核糖体RNA合成的影响,实时定量PCR检测核糖体RNA转录水平,RNA-Ch IP方法检测核糖体RNA与Apak蛋白的相互作用,结果表明,SUMO化修饰的Apak抑制47S核糖体RNA前体的合成且抑制RNA聚合酶Ⅰ介导转录的18S和5.8S r RNA的合成;在放线菌素D以及癌基因诱导下,促进Apak与18S,5.8S r RNA相互作用.本研究对理解Apak的功能和作用机制提供了新的依据,为深入研究KRAB型锌指蛋白家族分子对核糖体RNA的调控奠定了基础.     

UFDS系统检测蛋白质SUMO化修饰研究

为了验证UFDS系统（Ubc9 fusion-directed sumoylation, UFDS）是否能够检测蛋白质SUMO(small ubiquitin-related modifier)化修饰,构建了Ubc9和PKCθ的融合表达载体,与SUMO1表达载体共转染293T细胞,通过免疫共沉淀和Western印迹检测Ubc9-PKCθ与SUMO1的相互作用。 结果表明,Ubc9-PKCθ与SUMO1相互作用,且SENP1共表达时导致Ubc9-PKCθ去SUMO化修饰;相较于野生型Ubc9-PKCθ,SUMO化修饰位点突变型Ubc9-PKCθ与SUMO1的相互作用显著减弱;而相较于野生型PKCθ,SUMO化修饰位点突变型PKCθ与SUMO1的相互作用则完全检测不到。 研究结果说明,应用UFDS系统能检测蛋白质的SUMO化修饰,但在鉴定潜在的SUMO化修饰位点时有一定的缺陷。     

PIAS1对PRRSV N蛋白SUMO化修饰及病毒复制的影响

【目的】猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种危害全球养猪业的重要病原。SUMO(Small ubiquitin-like modifier)化修饰作为一种可逆的翻译后修饰在调节病毒复制方面发挥着重要功能。PIAS1(Protein inhibitor of activated STAT1)是SUMO E3连接酶PIAS家族的一员,可以促进靶蛋白的SUMO化修饰,进而影响靶蛋白的功能,参与基因转录调控过程。探究PIAS1与PRRSV N蛋白相互作用的机制及其对N蛋白SUMO化修饰和病毒复制的影响,为进一步阐明PRRSV复制调控和致病的分子机制提供科学依据。【方法】利用酵母回复杂交、免疫共沉淀和激光共聚焦技术验证N蛋白与PIAS1的相互作用;以递增剂量外源性转染PIAS1观察其是否介导N蛋白SUMO化修饰;采用RNA干扰和慢病毒转导技术测定PIAS1对PRRSV复制的影响。【结果】PIAS1能与N蛋白相互作用,而且两者主要共定位于胞浆中;外源转染PIAS1并未增加N蛋白SUMO化修饰水平;在MARC-145细胞中,PIAS1的表达有利于PRRSV的复制。【结论】PIAS1可促进PRRSV的复制。     

类泛素化修饰蛋白SUMO1的表达纯化及抗体制备

SUMO是近年发现的类泛素化修饰蛋白,可通过异肽键共价连接到靶蛋白上,影响靶蛋白的细胞内定位、稳定性及与其它生物大分子的相互作用. 为研究蛋白质的SUMO化修饰,本文表达并利用亲和层析的方法纯化了重组的人SUMO1,制备了兔抗hSUMO1的多克隆抗体. 经ELISA和免疫印迹检测,获得了灵敏度高、特异性好的抗体,可用于SUMO化修饰靶蛋白的鉴定及SUMO化修饰的生物学功能研究.     

去泛素化酶USP10通过稳定Smurf1抑制TGF-β/BMP信号通路

目的 探究生理条件下去泛素化酶USP10调控的关键信号通路及分子机制。方法 利用GEO2R和Metascape对Usp10^+/+和Usp10^-/-新生小鼠肾组织基因芯片(GSE198574)差异表达基因和通路富集分析，使用免疫印迹实验和免疫组化技术检验核心转录因子的表达情况；进一步利用免疫印迹检测该信号通路，并通过基因芯片和免疫组化分析候选分子的表达情况；使用免疫共沉淀(Co-IP)和GST-pull down实验验证USP10与候选分子的相互作用，通过泛素化实验明确USP10对底物分子的调控机制；利用免疫印迹检测细胞增殖、凋亡相关蛋白p21、Cleaved-caspase 3的表达情况，使用CCK-8和克隆形成实验分析USP10对细胞增殖的影响。结果 Usp10^-/-新生小鼠肾组织中TGF-β/BMP通路激活，USP10在小鼠体内缺失后导致Smad泛素相关因子1 (Smurf1)蛋白质水平降低，Smad1/5蛋白质水平上调，却不影响它们的转录水平；机制上，USP10与Smurf1存在相互作用，并依赖其去泛素化酶活性去除...     

MKL1靶向CAAP1促进胃癌细胞的自噬并抑制凋亡

[目的]探讨MKL1和CAAP1对胃癌细胞凋亡的影响及其分子机制。[方法]蛋白质印迹和实时荧光定量PCR检测MKL1、CAAP1过表达效果;蛋白质印迹、流式细胞术、自噬检测试剂盒检测细胞的自噬和凋亡情况;荧光素酶报告基因活性测定、染色质免疫共沉淀验证MKL1和CAAP1基因启动子的结合。[结果]在MGC80-3细胞中过量表达MKL1后,凋亡抑制蛋白CAAP1的mRNA和蛋白水平与对照组相比均上调(P 0. 05),自噬标记基因LC3BII表达升高(P 0. 05),促凋亡蛋白Caspase3表达降低(P 0. 05)。敲降MKL1,Caspase3蛋白表达升高(P 0. 05)。敲降CAAP1,Caspase3蛋白表达升高(P 0. 05)。过表达CAAP1拮抗敲降MKL1,LC3BII蛋白表达下降,Caspase3蛋白表达升高(P 0. 05)。荧光素酶活性分析以及染色质免疫共沉淀分析结果表明MKL1促进CAAP1基因的转录活性。[结论]MKL1可通过上调CAAP1的表达进而促进胃癌细胞的自噬并抑制细胞凋亡。     

FOXO1在胰岛β细胞中的表达及对增殖凋亡功能的影响

胰岛功能受损的分子机制研究是揭示2型糖尿病(T2DM)发病机制的核心问题．FOXO1是胰岛素信号下游的重要靶转录因子,参与胰岛的发育,但在分化成熟的胰岛β细胞中的功能尚未阐明．本研究采用免疫组化方法结合激光共聚焦技术观察FOXO1在胰岛的表达及细胞定位;通过基因介导的转移技术和siRNA干预技术,在培养的大鼠胰腺癌β细胞系（INS-1E）中特异高表达组成性活性的FOXO1(FOXO1-AAA)或抑制其表达水平,观察FOXO1表达水平的改变对β细胞增殖、凋亡的影响．免疫组化结果显示,FOXO1在正常胰腺组织中仅特异地表达在胰岛内．采用胰岛素与FOXO1的免疫荧光双标结合共聚焦观察进一步揭示,FOXO1主要表达在胰岛的β细胞中．Western印迹显示,腺病毒介导的基因转移技术在体外培养的INS-1E细胞中过表达FOXO1-AAA或其特异的siRNA均能有效地上调或抑制其表达水平3H-TdR掺入实验结果显示,降低FOXO1的表达显著促进细胞增殖;反之,高表达FOXO1显著抑制细胞增殖．与之相应,MTT检测结果显示,降低FOXO1的表达对细胞存活有显著促进作用,高表达FOXO1对细胞存活有显著抑制作用．进一步采用流式细胞仪检测细胞凋亡,结果显示降低FOXO1的表达使β细胞凋亡率降低,反之高表达FOXO1使β细胞凋亡率增加．研究结果证实,胰岛β细胞中的FOXO1参与β细胞的存活、增殖、凋亡的调节．病理性高表达FOXO1可能通过阻止β细胞增殖、促进β细胞凋亡从而减少β细胞的数量,在T2DM发生中可能起重要作用．     

β-TC3细胞膜与胰岛素受体结合G蛋白的鉴定

目的:用免疫共沉淀的方法检测β-TC3(小鼠胰岛β细胞瘤细胞)细胞膜中与胰岛素受体结合的G蛋白.方法:提取β-TC3细胞膜蛋白,通过免疫共沉淀及蛋白质印迹的方法,检测G蛋白α及β亚基的表达.结果:抗胰岛素受体抗体沉淀胰岛素受体结合的G蛋白复合物后,分别用抗胰岛素受体抗体、抗G蛋白α亚基抗体及抗G蛋白β亚基抗体,检测到胰岛素受体、G蛋白α亚基及G蛋白β亚基的表达.结论:在β-TC3细胞膜中,胰岛素受体与G蛋白共存,G蛋白α亚基及β亚基与胰岛素受体可能存在直接的相互作用.     

NF-κB和存活蛋白抑制药物诱导的倍体化与衰老巨核细胞的死亡

目的:筛选诱导巨核细胞倍体化药物,研究倍体化细胞的抗死亡机制,探索促进倍体化细胞死亡的用药方法。方法:采用不同药物处理巨核细胞白血病细胞系Dami细胞,检测细胞倍性、衰老、死亡及相关分子的变化。结果:Nocodazole、SP600125与SU6668可阻断Dami细胞增殖,诱导倍体化,促进细胞衰老,短期诱导不影响细胞活力。分子水平表明,抗凋亡分子存活蛋白表达上调,衰老相关分泌表型调控因子NF-κB(p65)活性降低。持续的药物诱导可致细胞死亡。结论:诱导巨核细胞倍体化抑制恶性增殖,促进细胞衰老发生,存活蛋白与NF-κB(p65)共同抑制倍体化和衰老细胞的死亡,而持续的药物诱导可促进细胞死亡,可作为急性巨核细胞白血病的治疗策略。     

APP/PS1转基因鼠脑内小泛素化修饰物-1上调可能参与阿尔茨海默病老年斑形成和神经突起变性的调节北大核心CSCD

小泛素化修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)是一类重要的类泛素蛋白,研究显示一些神经退行性疾病相关蛋白可以被SUMO化修饰。本文旨在观察APP/PS1转基因阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)鼠中SUMO-1表达及修饰的变化,并探讨SUMO-1与AD病理的关系。采用免疫印迹的方法检测12月龄的APP/PS1转基因AD鼠脑内SUMO-1表达及修饰的变化,同时用免疫共沉淀及免疫荧光的方法研究AD鼠脑内SUMO-1与tau、APP和Aβ的关系。结果显示:(1)与正常野生型小鼠相比,AD鼠脑内SUMO-1表达及其修饰的蛋白增加,同时伴有泛素化蛋白的增加;(2)AD鼠大脑皮层的RIPA可溶蛋白组份中,SUMO-1修饰的tau增加,而AT8抗体识别的磷酸化tau的SUMO-1修饰减少,但422位点磷酸化tau的SUMO-1修饰没有明显改变;(3)SUMO-1与磷酸化tau、APP及Aβ免疫荧光双标显示,在AD鼠脑内SUMO-1可在老年斑的中部和周围分布,并且SUMO-1与AT8识别的磷酸化tau在老年斑周围的变性神经突起中有相对较多的共存,但与APP、PS422识别的磷酸化tau和Aβ的共定位很少。以上结果提示,SUMO-1在APP/PS1转基因AD小鼠脑内表达增加,并可能参与变性神经突起及老年斑形成的调节。     

食管鳞癌中牙龈卟啉单胞菌通过14-3-3σ调控程序性死亡-配体1蛋白降解

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)是口腔疾病的重要致病菌之一，与人食管鳞癌(ESCC)进展密切相关。然而P.gingivalis促进ESCC发生发展的分子机制尚不十分清楚。该研究探讨了ESCC中P.gingivalis通过诱导程序性死亡-配体1(PD-L1)蛋白表达上调的分子机制。Western印迹和RT-PCR结果显示，KYSE140和KYSE150细胞中14-3-3σ与PD-L1的蛋白质表达呈负相关，但二者的mRNA表达无相关性。免疫共沉淀结果表明，14-3-3σ蛋白通过与PD-L1蛋白结合，促进PD-L1的泛素化降解，P.gingivalis感染干预了14-3-3σ与PD-L1蛋白质复合体形成；KYSE140和KYSE150细胞中14-3-3σ沉默，降低了PD-L1泛素化介导的蛋白质酶体降解，14-3-3σ过表达明显抑制P.gingivalis诱导的PD-L1蛋白表达上调。免疫组化结果进一步证实，在ESCC组织中P.gingivalis丰度与14-3-3σ蛋白表达呈负相关，与PD-L1蛋白表达呈正相关，14-3-3σ与PD-L1的蛋白质表达呈负相关...     

阿帕替尼对人肝癌细胞增殖及凋亡的作用机制研究

目的:探讨阿帕替尼抑制肝癌细胞增殖促进凋亡的作用机制。方法:选取肝癌细胞系SNU739、HepG2,以CCK-8细胞增殖实验、平板克隆实验测定阿帕替尼对肝癌细胞增殖及克隆形成能力的影响;流式细胞术检测阿帕替尼对肝癌细胞凋亡的影响;蛋白免疫印迹法检测阿帕替尼影响肝癌细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及Caspase3的表达情况。结果:与对照组相比,阿帕替尼可显著抑制肝癌细胞增殖(P0.05)。平板克隆实验提示与对照组相比,10μM和20μM阿帕替尼组肝癌细胞克隆数明显减少(P0.05)。流式细胞术结果提示10μM和20μM阿帕替尼处理组细胞凋亡率明显增加(P0.05)。蛋白免疫印迹法结果显示经阿帕替尼处理的肝癌细胞,促凋亡蛋白Bax及Caspase3的活性片段Cleaved-caspase3表达水平显著上调,抗凋亡蛋白Bcl-2显著下调(P0.01)。结论:阿帕替尼通过调节肝癌细胞凋亡相关蛋白从而抑制肝癌细胞增殖、促进其凋亡。     

乙型肝炎病毒上调的lnc-HUR1抑制肝癌细胞凋亡北大核心CSCD

Lnc-HUR1是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)上调的长链非编码RNA,具有促进肝癌细胞增殖和促进肝癌发生发展的功能。为探究lnc-HUR1对肝癌细胞凋亡的影响,通过免疫印迹、实时荧光定量PCR、双荧光素酶报告基因、免疫共沉淀、流式细胞术等实验方法,检测lnc-HUR1对肝癌细胞凋亡的影响。转化生长因子-β(tansforming growth factor-β,TGF-β)、五氟尿嘧啶和星孢菌素诱导肝癌细胞凋亡的实验结果显示,过表达lnc-HUR1能够显著降低caspase3/7的活性以及PARP-1的剪切,而敲低lnc-HUR1则能够显著增加caspase3/7的活性,促进PARP-1的剪切;Annexin-Ⅴ和PI联合染色实验也表明过表达lnc-HUR1能够抑制细胞凋亡,敲低lnc-HUR1能够促进细胞的凋亡。同时过表达lnc-HUR1能够在RNA水平和蛋白水平上调凋亡抑制因子Bcl-2(B cell lymphoma-2)、下调促凋亡因子BAX(B cell lymphoma-2-associated x),从而抑制细胞的凋亡。在CCL4诱导的小鼠急性肝损伤模型中,lnc-HUR1转基因小鼠肝组织中Bcl-2的表达高于对照小鼠。染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验也证实lnc-HUR1能够降低p53在Bcl-2和BAX启动子区的富集。以上结果说明,lnc-HUR1通过促进凋亡抑制因子Bcl-2及抑制凋亡促进因子BAX的表达抑制肝癌细胞的凋亡。进一步的实验表明,在HCT116细胞中lnc-HUR1能够调控Bcl-2和BAX的转录,而在HCT116 p53−/−细胞中,lnc-HUR1对Bcl-2和BAX的表达没有影响,说明lnc-HUR1对肝癌细胞凋亡的抑制作用依赖于p53的活性。综上所述,HBV上调的lnc-HUR1具有抑制肝癌细胞凋亡的作用,lnc-HUR1通过抑制p53转录活性,上调凋亡抑制因子Bcl-2、抑制凋亡促进因子BAX的转录,从而抑制细胞凋亡。上述结果提示Lnc-HUR1在HBV相关肝癌发生发展中发挥重要作用。     

蛋白质SUMO化修饰及其调控

SUMO化修饰是一种由SUMO特异性的活化酶(E1)、结合酶(E2)和连接酶(E3)共同催化完成的类泛素化修饰。同时,它又是一个动态且可逆的过程,介导去SUMO化的则是SUMO特异性蛋白酶(SENP)家族。SUMO化修饰的靶蛋白存在于细胞的各个部位,通过loss of function和gain of function机制,SUMO化修饰可调控蛋白质的活性与功能。SENPs介导的去SUMO化是决定靶蛋白SUMO化修饰水平的主要因素之一,同时SENPs也是调节蛋白SUMO化修饰的一个主要环节,因此SENPs在调控靶蛋白所参与的信号通路中发挥着重要作用。     

IL-6通过Sirt1/p53/caspase-3通路介导胰岛β细胞凋亡

目的 探讨炎性因子IL-6是否通过Sirt1/p53/caspase-3通路介导胰岛β细胞凋亡.方法 Western 印迹检测Sirt1在小鼠各组织器官和胰岛β细胞系NIT-1细胞中的表达,免疫荧光法检测Sirt1在细胞中的定位.IL-6（10 ng/ml）处理NIT-1细胞48 h,Hoechst3334染色及流式细胞仪检测细胞凋亡,Western印迹检测细胞内Sirt1、P53、乙酰化P53（acety-P53）、caspase-3和cleaved caspase-3的水平变化.结果 Sirt1在小鼠各组织器官和胰岛β细胞中均有表达,主要定位于细胞核.IL-6处理NIT-1细胞后,伴随Sirt1表达的显著减少,acety-P53明显上调,p53/caspase-3通路活化,NIT-1细胞凋亡增加.结论 IL-6通过下调Sirt1进而激活p53/caspase-3信号通路引起胰岛β细胞凋亡.     

敲低去泛素化酶USP13抑制K562细胞的增殖*

目的:研究去泛素化酶USP13对人慢性髓系白血病细胞系K562增殖和凋亡的影响,并进行初步的机制探究。方法:构建pLKO.1-shUSP13-GFP慢病毒干涉载体,慢病毒包装后感染并建立稳定敲低USP13的K562细胞株。免疫印迹检测K562细胞中USP13蛋白的敲低效率。流式细胞术分析敲低USP13对K562细胞增殖和凋亡的影响。免疫共沉淀和蛋白质泛素化实验探究USP13调控K562细胞的分子机制。结果:成功构建pLKO.1-shUSP13-GFP慢病毒干涉载体,同时利用慢病毒体系获得稳定敲低USP13的K562细胞株。流式细胞术结果显示,敲低USP13促进K562细胞凋亡、抑制细胞增殖。分子机制研究发现,敲低USP13通过增强c-Myc泛素化进而导致其蛋白质水平降低。结论:初步揭示了USP13调控K562细胞增殖和凋亡的分子机制,为治疗慢性髓系白血病提供了潜在的靶点。     

c-met 在大鼠胰岛β细胞INS-1 胰岛素分泌中的作用

目的:从c-met对胰岛β细胞增殖,细胞周期、糖耐受和对GLUT2的表达影响三个方面探讨c-met在胰岛β细胞功能的影响及相关机制。方法:在大鼠胰岛β细胞系INS-1中运用RNA干扰技术(RNAi)抑制HGF的特异性受体c-met蛋白的表达,检测其在正常的生理状况下对成熟的胰岛β细胞增殖以及功能维持的作用。结果:c-met蛋白对成熟的胰岛β细胞的增殖与周期并没有显著影响,但对于β细胞的功能维持具有重要意义。结论:通过调节GLUT2蛋白来维持β细胞的胰岛素分泌功能,有助于进一步阐明HGF/c-met通路在胰岛β细胞功能损伤的分子机制,从而为糖尿病的预防和治疗提供新的理论依据。