炭疽受体CMG2-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达、纯化与鉴定

目的：构建炭疽受体CMG2和人IgGl Fc片段融合基因载体,转染CHO细胞并通过毒素中和试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素（PA＋LF）的能力。方法-将含有CMG2胞外区1-217AA片度基因和人IgGl的Fc片段基因共同连接入pcDNA3．1载体转染CHO细胞并筛选高表达CMG2-Fc的CHO细胞系,通过小鼠RAW264．7巨噬细胞保护试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素的能力。结果：获得了表达CMG2-Fc的细胞株,毒素中和实验显示该蛋白可以有效抑制炭疽毒素引起的细胞损伤。结论：CMG2-Fc能够保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素攻击,提示其可以作为抗毒素治疗炭疽感染。     

炭疽受体CMG2-Fc 融合蛋白在CHO 细胞中的表达、纯化与鉴定

目的:构建炭疽受体CMG2和人IgG1 Fc片段融合基因载体,转染CHO细胞并通过毒素中和试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素(PA+LF)的能力。方法:将含有CMG2胞外区1-217AA片度基因和人IgG1的Fc片段基因共同连接入pcDNA3.1载体转染CHO细胞并筛选高表达CMG2-Fc的CHO细胞系,通过小鼠RAW264.7巨噬细胞保护试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素的能力。结果:获得了表达CMG2-Fc的细胞株,毒素中和实验显示该蛋白可以有效抑制炭疽毒素引起的细胞损伤。结论:CMG2-Fc能够保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素攻击,提示其可以作为抗毒素治疗炭疽感染。     

PA domain4-Fc融合蛋白抗血清可以保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素损害

目的:探讨炭疽杆菌保护性抗原PA(protective antigen)domain4能否作为炭疽疫苗和炭疽感染时紧急预防用药.方法:构建含有PA domain4和人IgG Fc片段的表达载体,通过免疫大耳白兔获得针对该融合蛋白的免疫血清,通过小鼠巨噬细胞保护试验验证PA domain4-Fc是否具有疫苗和紧急预防用功能.结果:获得了表达PA domain4-Fc融合蛋白的CHO细胞株和针对PA domain4-Fc的兔抗血清,细胞保护试验证实PA domain4-Fc抗血清能够保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素的攻击,但PA domain4-Fc蛋白本身并不能直接拮抗炭疽毒素对细胞的损害.结论:PA domain4-Fc抗血清可以保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素损害,表明PA domain4-Fe具有作为炭疽疫苗的可能,但PA domain4-Fc蛋白不能直接竞争性拮抗炭疽毒素损害细胞.     

炭疽毒素的细胞受体

炭疽杆菌外毒素是三组分蛋白质,构成两种毒素。水肿因子(EF)和致死因子(LF)分别是腺苷环化酶和金属蛋白酶,保护性抗原(PA)与细胞表面受体结合并将水肿因子或致死因子转移进细胞内发挥毒性作用。在哺乳动物细胞上己发现有两种受体,分别是肿瘤内皮标志8基因编码的细胞表面蛋白ATR／TEM8和毛细血管形态发生基因2编码的细胞表面蛋白CMG2。这两种受体蛋白的生理功能都不十分清楚,它们之间的氨基酸序列有很高的同源性(40％～60％)。氨基酸序列主要分信号肽、细胞外主基、跨膜区、脑浆尾四个区,细胞外主基内含von WIlle-brand因子A主基或称整合素插入主基(VWA／I主基),VWA／I主基内有金属离子依赖性粘连位点(MIDAS),是主基与PA蛋白质相互作用所必不可少的。这两种受体都有几种异构体,主要差异在于胞浆尾区的氨基酸长度不同。两种VWA／I主基都有封闭PA功能,阻止细胞中毒的作用,有望作为抗毒素治疗炭疽。     

炭疽毒素受体ATRcDNA的合成和克隆及ATR-Fc融合蛋白的真核表达载体的构建

可溶性炭疽毒素受体(sATR)可以特异性结合炭疽毒素保护抗原(PA),为获得用于中和炭疽毒素以防治炭疽感染的候选抗毒素药物,构建了表达ATRFc抗体样分子融合蛋白的真核表达载体。将全长为681bp的编码炭疽毒素受体N端1～227氨基酸的基因分成长约50～60碱基的18个寡核苷酸片段,相邻片段重叠部分为20～22个碱基,利用重叠延伸PCR和引物PCR法,将合成的片段组装与扩增,得到了含有ATR_1～227的全部编码区和HindIII、BamHI位点在内的DNA片段。回收的基因片段经BamHI/HindIII双酶切连接到pUC19质粒中,挑选阳性克隆进行酶切鉴定和双向序列测定,获得了全序列正确的克隆。将ATR基因与Fc基因连接后插入pcDNA3.1载体多克隆位点HindIII和NotI之间,得到表达ATRFc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1/ATRFc,为利用CHO哺乳动物细胞表达ATRFc并研究其生物学性质奠定了基础。     

炭疽毒素受体与人IgG1的Fc段融合蛋白ATR_Fc在CHO细胞中的表达

ATR_Fc是人炭疽毒素受体(ATR)的胞外区与人免疫球蛋白IgG1的铰链区、CH2区和CH3区组成的融合蛋白。表达该蛋白是为了获得结合PA的抗体样分子,通过阻断PA与细胞受体的结合,而阻止炭疽致死毒素和水肿因子进入细胞内,可作为预防和治疗炭疽感染的生物制品。将编码炭疽毒素受体N端1_227氨基酸的基因和编码Fc段的基因连接,插入到pcDNA3.1的HindⅢ和NotⅠ位点得到表达ATR_Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1ATR_Fc,并用脂质体方法将该载体转染至CHO_K1细胞中,用G418筛选并获得ATR_Fc表达水平为10～15μg(106cells·d)的基因工程CHO细胞系ATR_Fc_1D5。采用蛋白A纯化重组蛋白,并用ELISA法鉴定ATR_Fc与PA的亲和性,表明ATR_Fc可与PA特异性结合。     

炭疽毒素受体与人IgG1的Fc段融合蛋白ATR_Fc在CHO细胞中的表达

ATR-Fc是人炭疽毒素受体（ATR）的胞外区与人免疫球蛋白IgG1的铰链区、CH2区和CH3区组成的融合蛋白。表达该蛋白是为了获得结合PA的抗体样分子,通过阻断PA与细胞受体的结合,而阻止炭疽致死毒素和水肿因子进入细胞内,可作为预防和治疗炭疽感染的生物制品。将编码炭疽毒素受体N端1-227氨基酸的基因和编码Fc段的基因连接,插入到pcDNA3-1的HindⅢ和NotⅠ位点得到表达ATR-Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA31/ATR9Fc,并用脂质体方法将该载体转染至CHO-K1细胞中,用G418筛选并获得ATR-Fc表达水平为10～15μg/(106cells·d)的基因工程CHO细胞系ATR-Fc-1D5。采用蛋白A纯化重组蛋白,并用ELISA法鉴定ATR-Fc与PA的亲和性,表明ATR-Fc可与PA特异性结合。     

针对炭疽保护性抗原不同结构域的中和性单克隆抗体的筛选和鉴定

炭疽保护性抗原（PA）是炭疽毒素的重要组分,同时也是现有炭疽疫苗的主要有效成分,在炭疽杆菌的致病与免疫中发挥关键作用。以重组PA为免疫原,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,结合炭疽毒素敏感细胞的毒性中和试验,大量筛选抗PA单克隆抗体,获得了9株炭疽毒素中和性单抗。进一步分析表明这些单抗以IgG1亚类为主,分别识别PA 3个结构域的4个不同中和表位区。针对结构域2的4株单抗识别同一表位区,其中3株单抗的中和活性强于抗PA多抗;针对结构域4的4株单抗识别两个不同表位区;另有1株单抗识别位于结构域3的表位。实验结果提示PA具有多个中和表位,分别位于其不同结构域,其中结构域2、4包含主要中和表位。实验中获得的针对不同表位的中和性单抗为深入研究PA的免疫保护机理提供了工具,也为研制针对炭疽毒素的被动免疫制剂和治疗药物打下基础。     

Fc 融合蛋白在药学领域的研究进展

Fc 融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物活性的功能蛋白分子与Fc 片段融合而产生的新型重组蛋白,其不仅保留了功能蛋白分子的生物学活性,还具有一些抗体的性质,如通过结合相关Fc 受体延长半衰期和引发抗体依赖细胞介导的细胞毒性效应等。对Fc融合蛋白及其在药学领域的研究进展进行了综述。     

炭疽毒素受体结构和功能研究进展

肿瘤血管内皮标志物8(TEMS)和毛细血管形态发生蛋白2(CMG2)是已知的两个炭疽毒素受体,它们的主要功能是当炭疽杆菌侵染细胞时介导炭疽毒素进入宿主细胞.这两个受体都是涉及到细胞外基质动态平衡的I型跨膜蛋白,并且都因为它们在血管生成或血管内皮细胞中表达增强而被发现.有研究发现TEM8能够调节内皮细胞迁移和血管形成,而CMG2则在内皮细胞增殖过程中起重要作用.进一步的研究显示它们与整联蛋白同源性较高,但它们确切的生理功能和作用机制尚不明确.本文中,主要讨论这两种蛋白的结构和它们作为炭疽毒素受体介导炭疽毒素进入细胞的分子机制,然后我们简单探讨一下TEM8在靶向肿瘤血管内皮细胞的抗血管生成和抗肿瘤疗法方面的研究进展,最后我们展望了下一步炭疽毒素受体研究的热点-它们的配体及生理功能研究.     

Molecular Dynamics Simulations of Complexes Between Wild-Type and Mutant Anthrax Protective Antigen Variants and a Model Anthrax Toxin Receptor

Abstract

Bacillus anthracis, a spore-forming infectious bacterium, produces a toxin consisting of three proteins: lethal factor (LF), edema factor (EF), and protective antigen (PA). LF and EF possess intracellular enzymatic functions, the net effect of which is to severely compromise host innate immunity. During an anthrax infection PA plays the critical role of facilitating entry of both EF and LF toxins into host cell cytoplasm. Crystal structures of all three of the anthrax toxins have been determined, as well as the crystal structure of the (human) von Willebrand factor A (integrin VWA/I domain)—an anthrax toxin receptor. A theoretical structure of the complex between VWA/I and PA has also been reported. Here we report on the results of 1,000 psec molecular dynamics (MD) simulations carried out on complexes between the Anthrax Protective Antigen Domain 4 (PA-D4) and the von Willebrand Factor A (VWA/I). MD simulations (using Insight II software) were carried out for complexes containing wildtype (WT) PA-D4, as well as for complexes containing three different mutants of PA-D4, one containing three substitutions in the PA-D4 “small loop” (residues 679–693) (D683A/L685E/Y688C), one containing a single substitution at a key site at the PA-D4—receptor interface (K679A) and another containing a deletion of eleven residues at the C-terminus of PA (A724–735). All three sets of PA mutations have been shown experimentally to result in serious deficiencies in PA function. Our MD results are consistent with these findings. Major disruptions in interactions were observed between the mutant PA-D4 domains and the anthrax receptor during the MD simulations. Many secondary structural features in PA-D4 are also severely compromised when VWA complexes with mutant variants of PA-D4 are subjected to MD simulations. These MD simulation results clearly indicate the importance of the mutated PA-D4 residues in both the “small loop” and at the carboxyl terminus in maintaining a PA conformation that is capable of effective interaction with the anthrax toxin receptor.     

Domain 4 of the anthrax protective antigen maintains structure and binding to the host receptor CMG2 at low pH

Domain 4 of the anthrax protective antigen (PA) plays a key role in cellular receptor recognition as well as in pH-dependent pore formation. We present here the 1.95 Å crystal structure of domain 4, which adopts a fold that is identical to that observed in the full-length protein. We have also investigated the structural properties of the isolated domain 4 as a function of pH, as well as the pH-dependence on binding to the von Willebrand factor A domain of capillary morphogenesis protein 2 (CMG2). Our results provide evidence that the isolated domain 4 maintains structure and interactions with CMG2 at pH 5, a pH that is known to cause release of the receptor on conversion of the heptameric prepore (PA₆₃)₇ to a membrane-spanning pore. Our results suggest that receptor release is not driven solely by a pH-induced unfolding of domain 4.     

Differential Dependence on N-Glycosylation of Anthrax Toxin Receptors CMG2 and TEM8

ANTXR 1 and 2, also known as TEM8 and CMG2, are two type I membrane proteins, which have been extensively studied for their role as anthrax toxin receptors, but with a still elusive physiological function. Here we have analyzed the importance of N-glycosylation on folding, trafficking and ligand binding of these closely related proteins. We find that TEM8 has a stringent dependence on N-glycosylation. The presence of at least one glycan on each of its two extracellular domains, the vWA and Ig-like domains, is indeed necessary for efficient trafficking to the cell surface. In the absence of any N-linked glycans, TEM8 fails to fold correctly and is recognized by the ER quality control machinery. Expression of N-glycosylation mutants reveals that CMG2 is less vulnerable to sugar loss. The absence of N-linked glycans in one of the extracellular domains indeed has little impact on folding, trafficking or receptor function of the wild type protein expressed in tissue culture cells. N-glycans do, however, seem required in primary fibroblasts from human patients. Here, the presence of N-linked sugars increases the tolerance to mutations in cmg2 causing the rare genetic disease Hyaline Fibromatosis Syndrome. It thus appears that CMG2 glycosylation provides a buffer towards genetic variation by promoting folding of the protein in the ER lumen.     

应用改构的炭疽毒素作为靶向肿瘤细胞的药物递送系统及其效果评价

目的:通过改造炭疽毒素保护性抗原Protective Antigen (PA)及致死因子Lethal Factor (LF),尝试建立更加广谱的新型炭疽毒素靶向给药系统并对其递送效率进行定量评价.方法:采用基因工程手段,分别构建了3种改构的天然炭疽毒素保护性抗原PA及炭疽毒素的LF N端融合海肾荧光素酶(Luciferase)的LFn-linker-Luc的大肠杆菌重组表达体系.利用CCK-8法评价改构PA和LF共同作用肿瘤细胞后的细胞存活率;利用改构PA和LFn-linker-Luc与肿瘤细胞共孵育,通过测定细胞内荧光素酶活性,评价改构PA靶向肿瘤细胞的效果.结果:体外酶解实验证明构建的改构PA蛋白能够被正确地酶解成目的大小的片段;改构PA和LF共同作用肿瘤细胞能够显著降低细胞存活率;利用LFn-linker-Luc能够评价改构PA的靶向效率,PA蛋白的改构方式与其递送效率相关.结论:设计并改构的炭疽毒素药物递送系统,能够实现特异性靶向肿瘤细胞的效果,并具有更广谱的作用效果,为研制新型广谱抗肿瘤药物提供了新的思路和方法.     

炭疽毒素及其细胞受体的研究进展

炭疽毒素由 3种蛋白组成 :保护性抗原 (protectiveantigen ,PA)、致死因子 (lethalfactor,LF)和水肿因子 (edemafactor ,EF) .综述炭疽毒素研究的最新进展 .主要介绍炭疽毒素的关键致病因子———LF的结构与功能 ,炭疽毒素膜转运成分PA的结构及其受体 (anthraxtoxinreceptor ,ATR)和其cDNA克隆的结构 ,并讨论了在炭疽的治疗、预防和毒素在肿瘤治疗中的可能应用 .     

细胞自噬与炭疽致死毒素的相互作用

目的：研究炭疽致死毒素在巨噬细胞中引起细胞自噬现象以及细胞自噬对炭疽致死毒素毒性的影响。方法：采用电子显微镜观察、单丹磺酰尸胺（MDC）荧光染色、Western印迹检测研究炭疽致死毒素作用后的巨噬细胞;采用MTT法检测细胞自噬对炭疽致死毒素毒性的影响。结果：采用以上3种方法,在巨噬细胞J774A.1中均可检测到细胞自噬现象;通过诱导或抑制细胞自噬,分别提高或降低了炭疽致死毒素的半数致死浓度。结论：炭疽致死毒素在巨噬细胞内能引起细胞自噬现象;细胞自噬能减弱炭疽致死毒素对巨噬细胞的毒性。