利用噬菌体随机肽库筛选可结合猪繁殖与呼吸综合症病毒的多肽序列

【目的】采用完整的猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)颗粒筛选噬菌体肽库,以获得能高亲和力结合并能抑制该病毒复制的特异性多肽。【方法】用纯化的病毒粒子包被ELISA板,再用M13噬菌体随机12肽库进行筛选。经过3轮淘筛,ELISA鉴定噬菌体单克隆与PRRSV的亲和力,选取与PRRSV具有高亲和力的噬菌体单克隆进行DNA测序,据此推导多肽的氨基酸序列。通过TCID50检测其抗病毒复制能力,同时人工合成FITC标记的展示肽用于PRRSV的检测。【结果】经筛选和鉴定得到17个阳性噬菌体克隆能与PRRSV呈高亲和力结合,DNA测序发现各克隆之间有部分共有基序,其中2个克隆体外能明显抑制PRRSV的复制,使TCID50由10-7.3/0.1mL分别降至10-3.2、10-3.6/0.1mL,而FITC标记该展示肽能够在5mg/L工作浓度检测PRRSV。【结论】通过噬菌体肽库能够筛选到具有抗病毒作用的阳性噬菌体克隆,为进一步开发高效PRRSV的诊断和治疗试剂奠定基础。     

细胞间粘附分子1特异结合肽的筛选及其生物功能

采用两种方法对噬菌体展示随机十五肽库进行亲和淘选 .ELISA法筛选特异结合高亲和力的阳性噬菌体单克隆 ,测序 ,得到 6个与人细胞间粘附分子 1(ICAM 1)高亲和力的噬菌体展示十五肽单克隆 .再经ELISA法从这 6个噬菌体单克隆中选择与ICAM 1亲和力最高的单克隆 ,同时利用蛋白空间结构位象模拟技术对小肽与ICAM 1的亲和力进行模拟研究 .最终获取目的小肽的氨基酸序列为GRGEFRGRDNSVSVV .目的单克隆噬菌体与ICAM - 1的亲和常数Ka 为 7 87× 10 7L mol .体外合成、纯化并标记目的小肽 .ELISA法验证目的小肽与人ICAM 1的结合呈浓度依赖性 ,抗ICAM 1多抗不能拮抗目的小肽与ICAM 1的结合 .采用免疫组化方法证实 ,此目的小肽具有与炎症组织中高表达的ICAM 1特异性结合的功能 .在动物体内 ,荧光标记的目的小肽具有向高表达ICAM 1的炎症部位特异性聚集的功能 .说明此目的肽可尝试作为以ICAM 1为靶的“肽导向药物”的前导肽 .     

脓毒症单核巨噬细胞特异性结合肽的筛选

利用噬菌体随机肽库展示技术,筛选出与脓毒症单核/巨噬细胞特异性结合的短肽,探索脓毒症治疗的新方法.分别以经过脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)处理的人外周血单核细胞株(THP-1)细胞作为筛选的靶细胞,以未经LPS处理的THP-1细胞作为非特异性噬菌体吸附细胞,对噬菌体随机环七肽库进行4轮“差减"筛选,经过细胞ELISA验证阳性噬菌体克隆,对获得的阳性克隆进行DNA测序及生物信息学分析,并进一步利用免疫荧光实验,鉴定噬菌体克隆与LPS处理THP-1细胞的结合特异性.4轮筛选后,随机挑取的噬菌体克隆,测序后得到可与LPS处理的THP-1细胞特异性结合肽.对去冗余后的七肽进行Clustal W多序列比对分析和BlastP蛋白同源相似性分析,细胞免疫荧光检测确定获得的噬菌体展示七肽可与LPS处理的THP-1细胞特异性结合.噬菌体随机肽库技术为脓毒症单核/巨噬细胞表面靶位的筛选提供了高效、快捷的筛选体系,实验获得的多肽基序具有高度保守性和细胞特异性,这些多肽的生物活性将是下一步的研究内容.     

噬菌体展示技术筛选bFGF模拟短肽

目的：通过噬菌体展示技术筛选得到与FGFR结合的bFGF模拟短肽,为bFGF肽类抑制剂的研发提供实验基础。方法：以Balb/c 3T3细胞为靶标,以COS-7细胞作消减,对噬菌体随机七肽库进行4轮生物淘洗,再采用ELISA检测单克隆噬菌体对Balb/c 3T3亲和性和特异性,选取阳性克隆进行DNA测序分析。结果：从富集的噬菌体中获得12个阳性克隆,获得一组疏水性七肽及共同基序PR。结论：利用肽类新药开发的重要工具--噬菌体展示技术,得到2段bFGF的受体结合模拟肽,可望作为bFGF抑制剂的先导肽。     

基于人HMGB1-B box的抑制性小肽筛选及其抗炎功能分析

目的从噬菌体构象型7肽库中筛选人HMGB1-Bbox的抑制性小肽。方法以重组人HMGB1-Bbox为靶分子对噬菌体构象型7肽库进行6轮亲和筛选,获得Bbox结合的克隆,并经ELISA验证。选取亲和力高的克隆进行DNA测序,并推导出呈现的多肽序列,通过IL-6 ELISA检测噬菌体呈现的小肽对人HMGB1-B box致炎功能的抑制作用。结果经过6轮亲和筛选,噬菌体的回收率增加,阳性克隆得到富集。挑选15个结合力强的克隆进行测序,推导出2个多肽序列。所获两个阳性噬菌体克隆能特异性地抑制人HMGB1-B box刺激THP-1细胞产生炎症因子的能力。结论获得了噬菌体呈现的能够抑制人HMGB1-B box的两个小肽。     

趋化因子受体 CCR5 亲合短肽的筛选

趋化因子受体 5 (CCR5) 是 HIV-1 与宿主细胞结合的辅助因子之一,其功能缺失或被 CCR5 拮抗剂封闭则会阻止 HIV-1 感染细胞 . 为得到与 CCR5 特异结合的肽类拮抗剂,采用噬菌体展示技术,以稳定表达 CCR5 的 CHO 细胞 (CHO/CCR5) 作为靶标,通过噬菌体随机 12 肽库筛选与 CCR5 特异结合的多肽;经过四轮筛选后,挑选 20 个阳性噬菌体克隆进行测序,从中得到 11 个含有 AFDWTFVPSLIL 序列的小分子肽 . 含该序列的噬菌体能与抗人 CCR5 单抗 (2D7) 竞争性结合 CCR5 ,且合成肽 AFDWTFVPSLIL 对趋化因子 RANTES 与 CHO/CCR5 的结合具有明显的抑制作用,初步证明该小肽与 CCR5 具有特异性结合作用 .     

脑膜炎大肠杆菌IbeA蛋白结合肽序列的亲和筛选

应用噬菌体展示肽库技术,以重组的脑膜炎大肠杆菌致病蛋白IbeA作为靶分子,经过吸附-洗脱-扩增-再吸附的亲和筛选,随机挑选亲和力强的噬菌体克隆,进行ELISA、竞争抑制实验和序列测定。结果显示,经3轮淘选后,间接ELISA鉴定得到高亲和性结合IbeA蛋白的15个阳性克隆。竞争抑制实验结果表明,游离IbeA蛋白能竞争抑制噬菌体结合肽克隆与固相包被的IbeA蛋白的结合,其抑制作用随游离IbeA蛋白浓度的降低而减弱。测序结果得到5种阳性噬菌体克隆展示肽序列。上述结果提示以脑膜炎大肠杆菌IbeA蛋白为靶筛选所获得的噬菌体12肽克隆,具有特异性,其结合肽序列呈现相对保守性。建立的从噬菌体随机肽库筛选IbeA蛋白结合肽的方法具有方便、灵活和高效可行的特点。     

利用噬菌体肽库筛选与HIV-1p24抗原结合的多肽

通过噬菌体展示技术筛选出与HIV-1p24抗原结合的多肽,为用多肽辅助p24抗原检测提供实验基础.以重组p24抗原为靶蛋白,对噬菌体随机七肽库进行三轮筛选,用EUSA鉴定第三轮筛选到的噬菌体克隆与p24重组抗原的结合能力,再对噬菌体克隆进行测序分析,同时研究了ELISA中噬菌体加入量及多种封闭剂对噬菌体特异性结合能力的...     

T7噬菌体展示人肝癌cDNA文库筛选人CD8~+T淋巴细胞特异结合分子

目的:利用噬菌体表面展示技术从人肝癌T7 cDNA文库中筛选出能与人CD8~+T淋巴细胞特异结合的蛋白分子。方法:以人CD8~+T淋巴细胞为筛选靶标,对人肝癌T7 cDNA噬菌体肽库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"生物淘选与富集,ELISA鉴定特异结合的噬菌体单克隆;对获得的阳性克隆裂解液进行PCR扩增及DNA测序,然后进行生物信息学分析,确定所编码的结合蛋白。结果:经过4轮筛选,结合人CD8~+T淋巴细胞的噬菌体克隆得到富集,通过测序与同源性比对分析获得17个特异性结合的多肽序列;生物信息学分析发现阳性噬菌体克隆的同源蛋白中,可能与肝癌免疫逃逸相关的分子有Unc-51样自噬活化激酶1(ULK1)、一般受体磷酸肌醇相关支架蛋白1(GRASP)、中间α球蛋白抑制因子H1(ITIH1)、富含亮氨酸重复8家族成员D(LRRC8D)和CD164等。结论:从人肝癌T7 cDNA噬菌体肽库中筛选获得了能与人CD8~+T淋巴细胞特异结合的分子,为阐明人肝癌发生发展过程中肿瘤免疫逃逸相关机制奠定了基础。     

人胚胎干细胞膜的特异多肽受体研究

目的:通过多肽筛选和比较分析,找到针对人胚胎干细胞(hESC)特异结合的多肽的膜受体蛋白,为相关通路或特异膜表面蛋白下游的研究奠定基础。方法:首先,在前期运用噬菌体展示技术的基础上进行ELISA重筛选,通过对比结合强度的大小,挑选出特异性结合人胚胎干细胞的噬菌体多肽并且进行测序和合成有poly-his标签的多肽;然后运用His Pull-Down系统获得特异结合人胚胎干细胞的某一特殊噬菌体12肽的膜上靶分子受体蛋白;最后质谱测序后通过Mascot数据库和NCBI进行序列信息分析。结果:1通过ELISA重筛选,得到了高特异性结合人胚胎干细胞的两个噬菌体序列,其序列分别为HGAAWGTRTGHV(HGA)和VPATETAQAGHA(VPA)。2通过His Pull-Down实验得到了一个针对多肽VPA的特异性膜蛋白受体。3通过MALD质谱分析以及NCBI的数据库搜索分析,进一步确认这一VPA多肽特异性结合的潜在受体蛋白可能属于HECT超级家族。结论:寻找到一个潜在未知的人胚胎干细胞的特异表面标志物,此膜受体可与VPA多肽特异性结合,为人胚胎干细胞的筛选和鉴定提供了重要指标。     

抗人白细胞介素15中和抗体识别抗原表位的噬菌体肽库筛选与鉴定

目的:用噬菌体呈现随机七肽库筛选能与抗人白细胞介素15(h IL-15)中和抗体特异性结合的模拟抗原表位肽,并初步鉴定其免疫原性。方法:以抗h IL-15中和抗体为靶分子,用生物淘洗法从噬菌体呈现线性七肽库中筛选与之结合的噬菌体克隆,用噬菌体ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性噬菌体克隆;化学合成筛选得到的多肽,并与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联免疫BALB/c小鼠,检测其免疫原性。结果:经过3轮体外筛选后随机挑取50个阳性噬菌体克隆,ELISA检测结果显示其中15个克隆与抗h IL-15抗体有较强的结合能力,DNA测序结果得到的结构相似群为MTPFWQK、MSPFNQK、MIPYWQK和MIPFHQK;竞争性ELISA结果显示4个序列均能与IL-15竞争性地结合抗IL-15单抗;小鼠免疫实验结果显示4组多肽均能诱导IL-15特异性免疫反应。结论:筛选得到能与抗h IL-15中和抗体特异性结合,且具有免疫原性的模拟抗原7肽序列,为进一步开发h IL-15相关的多肽疫苗提供了依据。     

P-糖蛋白的表达及其结合肽的筛选

为获得P 糖蛋白胞外段 ,构建了高效表达载体pGEX Pgp ,转化大肠杆菌DH5α ,进行表达、鉴定及纯化 ,以获得的融合蛋白为靶蛋白 ,筛选噬菌体随机 12肽库 ,免疫细胞化学方法进行鉴定 .SDS PAGE分析 ,表达出约 30kD大小的蛋白 ;从噬菌体随机肽库中筛选获得了与P 糖蛋白特异性结合的噬菌体阳性克隆 ,测序获得了其特异性结合肽序列 :NDGLLFTWQPSP .免疫细胞化学结果显示 :筛选得到的噬菌体阳性克隆可与耐药细胞BIU 87 ADM结合 ,而与敏感细胞BIU 87不结合 .结果表明 ,筛选获得的结合肽可与耐药的肿瘤细胞结合 ,表现出一定的肿瘤特异性 .P 糖蛋白结合肽的筛选 ,为进行人膀胱癌多药耐药的靶向治疗等工作奠定了基础 .     

利用噬菌体展示肽库筛选鸡传染性支气管炎病毒模拟抗原表位

目的：利用噬菌体展示肽库技术筛选鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的模拟抗原表位。方法：用IBV阳性血清纯化IgG作为靶标。对噬菌体展示随机12肽库进行筛选，通过ELISA和竞争抑制ELISA鉴定筛选克隆的结合特性，并对阳性克隆提取ssDNA进行测序分析。结果：3轮生物淘洗后，目标噬菌体得到125倍富集。随机挑选50个克隆进行ELISA和竞争抑制ELISA。其中有12个噬菌体克隆可以与IBV阳性血清高特异性结合。测序分析发现，这12个克隆带有2种氨基酸序列。即KSPKHSSSALHF和SFFQLNLHRPTS。且未发现这2种序列与GenBank中已发表的IBV氨基酸序列有同源性。结论：结果提示。这2个肽可能是IBV抗原的模拟表位。     

体外抑制鸡传染性支气管炎病毒的多肽鉴定

使用纯化的鸡传染性支气管炎病毒(IBV), 从12肽噬菌体随机展示肽库中筛选特异性结合多肽. 经过四轮淘筛, 得到10个阳性噬菌体, 进一步进行测序、血凝抑制活性及病毒抑制特性鉴定. 所有阳性噬菌体均能特异性阻断IBV对HeLa细胞的感染, 并能抑制IBV对鸡红细胞的血凝活性. 人工合成其中一条病毒抑制效价最高的线性多肽“GSH HRH VHS PFV”, 其细胞抑制试验证实该多肽同样具有病毒抑制特性. 以上结果为研制抗病毒分子及鉴定病毒与细胞相互作用功能域等奠定了基础.     

脑膜炎大肠杆菌IbeA蛋白结合肽序列的亲和筛选*

应用噬菌体展示肽库技术,以重组的脑膜炎大肠杆菌致病蛋白IbeA作为靶分子,经过吸附-洗脱-扩增-再吸附的亲和筛选,随机挑选亲和力强的噬菌体克隆,进行ELISA、竞争抑制实验和序列测定。结果显示,经3轮淘选后,间接ELISA鉴定得到高亲和性结合IbeA蛋白的15个阳性克隆。竞争抑制实验结果表明,游离IbeA蛋白能竞争抑制噬菌体结合肽克隆与固相包被的IbeA蛋白的结合,其抑制作用随游离IbeA蛋白浓度的降低而减弱。测序结果得到5种阳性噬菌体克隆展示肽序列。上述结果提示以脑膜炎大肠杆菌IbeA蛋白为靶筛选所获得     

噬菌体肽库筛选抗人B7-H4中和抗体的模拟抗原表位及其免疫原性鉴定

目的:用噬菌体呈现随机12肽库筛选能与抗人B7-H4(h B7-H4)中和抗体特异性结合的模拟抗原表位肽,并用其免疫小鼠检测其免疫原性。方法:以抗h B7-H4中和抗体为靶分子,用体外生物淘洗法从噬菌体呈现随机12肽库中筛选与之结合的噬菌体克隆,用竞争性细胞ELISA鉴定阳性噬菌体克隆;化学合成候选多肽,并与钥孔血蓝蛋白或破伤风毒素偶联鉴定多肽的特异性;进一步用融合蛋白免疫小鼠检测其免疫原性和抗血清的补体依赖的细胞杀伤活性(CDC)。结果:经过3轮体外筛选后随机挑取50个阳性噬菌体克隆,其中20个克隆与抗h B7-H4抗体有较强的结合能力,DNA测序得到6组结构相似的肽序列;竞争性ELISA结果显示1号肽噬菌体能与细胞表面的h B7-H4竞争性地结合抗h B7-H4单抗;点杂交结果显示1号肽能特异性结合抗h B7-H4单抗;小鼠免疫实验结果显示1号肽融合蛋白能诱导高滴度的抗h B7-H4抗血清,并且抗血清具有补体依赖的细胞杀伤活性。结论:筛选得到能与抗h B7-H4中和抗体特异性结合的12肽模拟抗原表位序列并且具有免疫原性,为进一步开发h B7-H4相关的多肽疫苗提供了实验依据。     

应用噬菌体随机肽库技术筛选鼠疫耶尔森菌F1抗原中和性表位

目的:筛选鼠疫耶尔森菌F1抗原的中和性表位,构建基于鞭毛蛋白佐剂的重组表位疫苗。方法:利用鼠疫菌F1抗原的中和抗体F2H5筛选噬菌体随机12肽库,对得到的阳性克隆采用ELISA进行特异性鉴定,采用竞争抑制ELISA确定具有竞争性的噬菌体单克隆并对其DNA测序,重组表达并纯化获得肽序列与截短型鞭毛蛋白Fli Cdel的融合蛋白,并通过Western印迹和ELISA鉴定重组蛋白与F2H5的结合。结果:获得了2株能够与F1抗原竞争结合F2H5的噬菌体单克隆12-1和12-14,其中12-14的竞争能力较强;通过序列比对,并没有发现这2株噬菌体克隆的插入肽序列与F1抗原序列存在一致性,但这2个插入肽序列与Fli Cdel的重组蛋白在Western印迹和ELISA结果中均显示出能够被抗F1的单克隆抗体识别。结论:F1中和性抗体筛选出的肽序列与截短的鞭毛蛋白融合表达后能够被F2H5特异性识别,为进一步对重组表位抗原进行免疫保护评价奠定了基础。     

新型人血清白蛋白特异结合肽ML的筛选及鉴定

利用噬菌体展示技术筛选和鉴定新型人血清白蛋白(HSA)特异结合7肽,分析与垂体腺苷酸环化酶激活肽27(PACAP27)构成的融合多肽ML-PACAP27与HSA的亲和结合力,以确定筛选的7肽(ML1和ML2)在与其他药物多肽或蛋白融合状态下仍具有较高的HSA结合活力。利用噬菌体展示7肽库,经四轮筛选、筛选克隆的DNA测序、酶联免疫吸附技术分析(ELISA)初步鉴定筛选克隆与HSA的亲和作用,并利用等离子共振技术(SPR)定量测定合成的ML-PACAP27融合多肽与人血清白蛋白的亲和力常数。实验结果表明:经筛选获得2个与人血清白蛋白特异性结合的7肽序列,其氨基酸序列分别为:ML1:LKSCKPL和ML2:SLKSHAL;ELISA分析结果显示,含有ML1和ML2的噬菌体均可亲和结合HSA,而且ML2的亲和结合作用高于ML1;SPR分析结果显示,ML1-PACAP27和ML2-PACAP27与HSA的解离常数(KD)分别为:8.1×10-6mol/L和3.7×10-6mol/L,ML1-PACAP27与HSA的结合力高于ML1-PACAP27。筛选和鉴定了两个可与HSA特异性结合的7肽序列,该7肽序列可用于特异偶联HSA的长效分子药物的重组融合表达或设计,可为延长分子药物的半衰期及新型药物研发提供新工具。     

噬菌体展示技术体内筛选的研究进展

噬菌体展示技术体内筛选是直接将噬菌体肽库注射到动物体内,筛选与活体内某些器官或组织有特异结合活性的小肽。噬菌体展示技术的体内筛选在血管靶向肽的筛选、肿瘤组织靶向肽的筛选、免疫反应的研究和相关疾病治疗、监测方面都有广泛的应用前景。     

从噬菌体展示肽库中筛选脂质A的结合肽

以脂质A为靶标,筛选噬菌体展示十二肽库,三轮后随机挑取14个噬菌体克隆进行结合活性鉴定,并对5个克隆进行序列分析。结果表明,14个克隆全部是阳性克隆,测序结果显示4个阳性克隆的序列完全一样。说明筛选到了一个脂质A的结合多肽。