抗猪鼻支原体单克隆抗体的研制及双抗体夹心ELISA检测法的建立

目的 制备多种抗猪鼻支原体的单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA方法用于该病原体的检测。方法用猪鼻支原体CVCC361免疫BALB／c小鼠,采用杂交瘤技术和酶联免疫吸附实验筛选出抗该病原体的单克隆抗体;运用免疫双向扩散试验、Western blotting确定I异G亚类及针对抗原的相对分子质量;筛选出配对抗体,建立双抗体夹心ELISA的检测方法,并评价其灵敏度和特异性。结果共筛选出17株单克隆抗体,抗体亚类分别为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3,免疫印迹结果表明单抗ZB1、ZB2及ZB16与相对分子质量为35×103的抗原有特异性结合,而ZB3和ZBIO与相对分子质量为70×10^3的抗原有特异性结合。确定了2个配对抗体（ZB1-ZB1-HRP和ZB1-ZB2-HRP）,可检出最小抗原量为30ns／mL,检出猪鼻支原体活菌8．34×10^2CFU／mL,与人呼吸道常见的致病菌及支原体均无非特异性反应。结论筛选的单克隆抗体具有较高的特异性和敏感性,应用双抗体夹心ELISA方法可用于猪鼻支原体的检测。     

抗GPNMB单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

目的:制备抗GPNMB单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA检测GPNMB在胶质母细胞瘤中的表达情况.方法:以新鲜胶质母细胞瘤组织为材料,提取总RNA,通过RT-PCR扩增得到GPNMB cDNA序列,经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆入PET-28a(+)进行原核表达,经蛋白纯化得GPNMB-6× His融合蛋白;以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,淋巴细胞杂交瘤法制备单克隆抗体;采用Western-blot、双抗体夹心ELISA以制备所得的抗GPNMB抗体检测胶质母细胞瘤细胞系U251、U373、SHG44和星形胶质细胞系SVG12中GPNMB的表达.结果:成功构建了GPNMB原核表达载体,获得了GPNMB-6×His重组蛋白;制备得到了G203、F105和M306共3株抗GPNMB的单克隆抗体,腹水ELISA效价分别为1∶8000、1∶8000、1∶5000,抗体亚类分别为IgG2、IgG1和IgG1,进一步实验证实单克隆抗体G203和M306可用于双抗体夹心ELISA检测不同胶质细胞瘤细胞系中GPNMB的表达.结论:成功制备出抗GPNMB单克隆抗体,效价及特异性良好,并证实GPNMB在胶质母细胞瘤细胞系中高表达,为进一步研究GPNMB在胶质母细胞瘤中的作用奠定了基础.     

双抗体夹心ELISA检测HIV-1 gp41抗原方法的建立

目的:建立检测HIV-1gp41抗原的双抗体夹心ELISA,并探讨其临床应用的可行性。方法:用饱和硫酸铵(SAS)纯化抗HIV-1gp41-5单克隆抗体(mAb),用HRP标记后建立双抗体夹心ELISA法,对其灵敏度及特异性进行检测,并用该方法对40份HIV-1阳性血清进行了检测。结果:用mAbE12(5μg/mL)为包被抗体,2H6为酶标记抗体(1∶900)建立了双抗体夹心ELISA法,检测gp41-5多肽的灵敏度是100pg/mL。对HIV-1阳性血清中gp41抗原的检出率为67.5%(27/40)。结论:建立了特异性强、灵敏度良好的检测HIV-1gp41抗原的双抗体夹心ELISA法。     

抗CPV-2a单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

犬细小病毒病是危害养犬业的重要传染病之一,患病犬难以治愈.单克隆抗体治疗此病效果明显,本文介绍了制备抗CPV-2a单克隆抗体的方法.用纯化的犬细小病毒(canine parvovirus,CPV) 2a型分离株免疫新西兰大白兔和Balb/c小鼠制备抗CPV-2a多克隆抗体及单克隆抗体.经亚克隆得到1H9、2B5、2B7和2C7共4株单抗,Western blotting鉴定单抗的免疫反应性;间接ELISA方法检测单抗的特异性.为了快速对犬细小病毒病作出诊断,建立了CPV-2a双抗夹心ELISA方法.兔多抗作为捕获抗体,鼠单抗作为示踪抗体,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG作为检测系统;捕获抗体和示踪抗体最佳稀释度分别为1:800和1:2 000;检测系统最佳稀释度为1:4 000.结果表明:所得4株单抗与pET-32a-VP2蛋白发生特异性反应,且与狂犬病毒(RV)、犬温热病毒(CDV)不交叉反应;建立的双抗夹心ELISA方法对病毒的最低检出量为4.375 μg/mL,与美国RB试剂盒相比,符合率为95%.单抗制备为犬细小病毒病的治疗奠定了基础;双抗夹心ELISA方法的建立为疑似粪便样本提供了简单、快速和可靠的检测手段.     

混合单克隆抗体在固相ELISA双夹心法中的应用研究

在进行固相ELISA双夹心法时,要选择两种配对的单克隆抗体(McAb)殊非易事。本文用不同McAb的混合物与另一种McAb进行配对夹心,获得了较好的效果。实验表明,在心肌肌球蛋白轻链(CM—LC)的固相ELISA双夹心体系中,以抗CM-LCMcAb(1G6)铺底,(2B4及2F6)混合物为后续复盖抗体,最低检出量可低达10ng/mL,其检出率较单独2B4或单独2F6作为后续复盖抗体者高5—10倍。而若反之,以(2B4及2F6)混合物铺底,1G6作为后续复盖抗体,则其最低检出量竟高至200ng/mL,还不如以其中之一铺底为佳。在人绒毛膜促性腺激素(HCG)的检测体系中,用多克隆抗体与单克隆抗体配对的研究中,也获得了类似的实验结果。     

hGH单克隆抗体的筛选及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用杂交瘤法制备单克隆抗体,并用辛酸-硫酸铵法纯化单抗,通过ELISA方法和Western blotting测定抗体的效价与特异性,并进行抗体类型、相对亲和力测定;应用纯化的单抗建立hGH双抗体夹心ELISA检测方法。筛选出两株可以稳定分泌抗hGH单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3E11、2G9,抗体类型均为IgG1,抗体滴度均可达10-10,特异性好,相对亲和力高,以筛选到的两株单抗建立的双抗夹心ELISA法线性范围为0.09～1.5625ng/mL,R2>0.9,灵敏度为0.09ng/mL。筛选出高效抗hGH的单抗,并建立了hGH双抗体夹心ELISA检测方法。     

金黄色葡萄球菌A型肠毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用

【目的】建立一种快速、灵敏、特异的金黄色葡萄球菌A型肠毒素(Staphylococcal enterotoxin A,SEA)检测方法。【方法】以原核表达的可溶性重组SEA蛋白为免疫原,获得特异性强、亲和力高的单克隆抗体作为捕获抗体,同时制备抗SEA兔多抗血清作为检测抗体建立双抗体夹心ELISA(Double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)检测方法。【结果】该方法对SEA的线性检测区间为2-128μg/L(y=1.102x-0.07,R2=0.994),检测下限为1.89μg/L,与SEB、SEC2和SED之间无交叉反应;鲜奶SEA人工污染试验测定回收率为94%-114%,变异系数小于10%。应用该方法对46株金黄色葡萄球菌水产品分离株和164株奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌分离株的体外培养上清进行检测,阳性率分别为4.4%和50.6%,表明SEA污染普遍存在。【结论】建立的DAS-ELISA方法特异性、灵敏度和稳定性好,为检测SEA的食源性污染提供了有效手段。     

Nodal检测双单抗夹心ELISA法建立及应用

现已证实,Nodal参与了肿瘤恶性生物学过程,但对其高敏感检测法尚未建立。采用基因工程表达人源Nodal作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过经典PEG诱导的细胞融合技术筛选出针对Nodal的特异性单克隆抗体7株。夹心ELISA确证7株抗体组成了15种可配对的抗体对。经筛选后选取抗体对AF12-DG5建立标准化夹心ELISA法,结合生物素-亲和素检测系统,DG5抗体标记生物素,采用链亲和素与辣根过氧化物酶标记的生物素(HRP-Biotin)按质量比4∶1预先混合孵育的ABC混合物进行检测,以提高ELISA法的灵敏度。棋盘滴定确定抗体工作最佳浓度为:捕获抗体(AF12)2μg/ml,检测抗体(生物素化DG5)2μg/ml。此条件下的夹心ELISA法线性范围为0~3 000pg/ml,检测限为68pg/ml,平均回收率为99.6%,精密度准确度良好。以正常人血清作为阴性对照,使用该夹心ELISA法测定结直肠癌、鼻咽癌和胆囊癌患者血清,发现三种肿瘤患者血清与正常人血清中的Nodal浓度均存在明显的统计学差异,可作为临床使用参考。     

基于抗CD20单克隆抗体的2种夹心ELISA法的建立

目的:建立和比较2种灵敏、特异的夹心ELISA方法,用于准确定量检测食蟹猴血浆中重组抗CD20人源化单克隆抗体(rh-anti-CD20zumab)浓度。方法:以rh-anti-CD20zumab为基础,分别用山羊抗人IgG F(ab')2抗体和驴抗人IgG Fc抗体包被96孔酶标板,加入待测样品,均采用HRP标记的猴血清吸附的山羊抗人IgG抗体进行检测,加底物显色,读取D450nm值。结果:建立了2种定量检测rh-anti-CD20zumab的夹心ELISA方法并进行了确证,样品的前处理分别为1∶20和1∶10,方法的线性范围分别为40~5000和40~12 500 ng/mL,定量下限均为40 ng/mL,两者的板内、板间精密度分别小于16.2%和19.4%,准确度分别为-10.3%~16.6%和-14.4%~12.9%。2种方法均具有良好的特异性和稀释线性,且都未出现钩状效应。结论:方法学确证表明,本研究建立的2种ELISA法均符合新生物制品临床前药代动力学研究指导原则的要求,可用于rh-anti-CD20zumab的检测,为后续rh-anti-CD20zumab在食蟹猴体内的药代动力学研究提供了不同的检测方法。     

原发性肝细胞癌组织中Beclin 1的表达及其意义

目的：探讨原发性肝细胞癌（HCC）组织中Beclin 1的表达及其在肝细胞癌发生发展中的作用。方法：应用免疫组化EnVision法检测54例肝细胞癌组织及其癌旁组织中Beclin 1的表达,分析其与肝细胞癌的病理分级、临床分期、侵袭及转移等临床病理因素的关系。结果：HCC组织中Beclin 1阳性表达率明显低于癌旁组织（X2=7.53,P〈0.01）。病理分级Ⅲ～Ⅳ、TNM分期Ⅲ～Ⅳ、存在静脉浸润和淋巴结转移的肝癌组织中的Beclin 1表达水平明显低于病理分级Ⅰ～Ⅱ、TNM分期Ⅰ～Ⅱ、无静脉浸润和淋巴结转移的肝癌组织（P〈0.01）。结论：HCC组织中存在Beclin 1表达缺失,可能与HCC的发生有着密切的关系,且对HCC的恶性生物学行为有重要影响。     

SSBP1在乙肝相关性肝细胞癌中的表达及临床意义

目的:研究SSBP1在乙肝相关性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达及其与患者临床病理特征的关系,为肝癌的诊断和预后判断提供参考依据。方法:收集血清乙肝病毒表面抗原(HBVs Ag)阳性的HCC患者组织标本216例,采用免疫组化和Western blot检测癌及癌旁组织中SSBP1的表达水平,并进行统计分析。结果:SSBP1蛋白在癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织(P0.05)。SSBP1表达水平与肿瘤数量、肿瘤大小、门静脉癌栓和肿瘤分级具有显著的相关性(P0.05)。SSBP1低表达患者术后总生存期及无复发生存期明显优于SSBP1高表达的患者(P0.05)。结论:SSBP1在HCC的发生发展过程中发挥重要作用,特对患者的预后判断具有一定的参考价值。     

NET-1蛋白表达水平在肝细胞癌患者预后中的意义

目的:探讨神经上皮转换蛋白1(NET-1)表达水平在肝细胞癌(HCC)患者预后中的意义。方法:采用免疫组织化学染色检测368对HCC和正常肝组织(NLT)样本中NET-1的表达水平。进行Kaplan-Meier生存曲线和Cox回归分析,评估HCC的预后。结果:在368例HCC组织中NET-1表达的阳性率为86.7%(319/368),与Edmondson-Steiner分期(P=0.02)以及TNM阶段(P=0.01)呈正相关。NET-1表达水平与肝内转移(P=0.008)和门静脉侵润(P=0.007)呈正相关。高表达NET-1的HCC病人比具有低表达NET-1或表达缺失NET-1(分别为P=0.001和P=0.002)的病人具有更短的无病存活期或者总存活期。多元Cox回归分析表明NET-1蛋白表达(相对危险性[RR],5.8;P=0.01)对HCC病人是一个独立的预后预测因素。结论:NET-1的表达情况可能成为HCC病人存活期的一个新预测因素。为研究针对NET-1靶点的新的治疗方法提供了理论基础。     

DEC1-mRNA在肝癌患者血清中的表达和手术预后的关系

目的:研究DEC1在肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者血清中的表达水平及其临床意义。方法:收集60例HCC患者,30例正常人,30例慢性肝炎患者,30例慢性肝硬化患者血清标本。采用实时荧光定量RT-PCR(RT-PCR)检测血清DEC1的表达情况。分析血清DEC1的表达水平与AFP相关性。探讨血清DEC1的表达水平与HCC手术预后的关系。结果:肝癌患者血清DEC1明显高于正常人、慢性肝炎和慢性肝硬化患者(P0.05)。皮尔森相关分析结果显示HCC患者血清DEC1的表达与血清AFP水平是呈正相关的。Kaplan-Meier结果显示血清DEC1低表达组术后的复发转移率显著低于高表达组,其术后生存率也显著高于高表达组(P0.01)。结论:DEC1在肝癌者血清中高表达,不仅可能成为HCC诊断的标记物,且其血清表达水平也有助于HCC临床预后的评估。     

Bmi1在肝癌组织中的表达及其与细胞增殖和凋亡的关系

目的：探讨Bmi1在肝细胞肝癌（HCC）中的表达及与增殖和凋亡的关系。方法：收集HCC标本54例及相应的癌旁组织,10例正常肝组织标本,采用免疫组织化学EnVision二步法显示Bmi1的表达并结合增殖与凋亡特征进行分析。结果：在肝癌组织、癌旁组织细胞中Bmi1表达定位于胞核中,阳性表达率分别为79.6%（43/54）,31.2%（17/54）,10例正常肝组织未见表达,3组差异有统计学意义（P〈0.005）。HCC中Bmi1的高表达与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤数目、临床TNM分期、是否有肝硬化及是否有HBsAg感染无显著相关（P〉0.05）,但与组织学分级有关,高、中分化组Bmi1表达率显著高于低分化组（P〈0.05）。肝癌Bmi1阳性组增殖指数（PI）（50.3±21.4）%显著高于阴性表达组（17.3±7.1）%（P〈0.05）,凋亡指数（AI）无明显差异（P〉0.05）。结论：Bmi1在HCC中高表达,其表达增高可能与HCC的进展相关。     

COTE1在肝细胞癌中的表达及其与临床病理参数及预后的相关性

目的:探究重组人序列相似性家族189成员B(FAM189B,别名COTE1)在肝细胞癌组织中的表达及与肝细胞癌患者预后的相关性.方法:收集59例行肝细胞癌根治术的患者,取其肝细胞癌组织及癌旁组织,采用免疫组织化学法检测COTE1表达,分析COTE1表达与临床病理参数的关系,采用Kaplan-Meier生存曲线分析COT...     

MFN1在肝癌转移中的调控作用研究

目的:探讨线粒体融合蛋白MFN1(mito-fusion 1)在肝癌转移中的作用及其机制。方法:1).采用免疫组化实验检测15对肝癌转移灶组织与原发灶组织中MFN1的表达,以明确肝癌转移时是否伴有MFN1表达的改变。2).采用si RNA (small interference RNA)下调肝癌细胞中MFN1的表达后,提高Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验分别检测其迁移和侵袭能力,通过实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和Western blot实验分别检测基质金属蛋白酶1 (matrix metalloproteinase 1,MMP1)、MMP2、MMP7及MMP9的m RNA和蛋白表达。结果:1)肝癌转移灶组织中MFN1表达显著低于原发灶组织(P0.05)。2).下调MFN1表达后,肝癌细胞的迁移和侵袭能力显著升高,MMP7的表达显著增加,而MMP1、MMP2与MMP9的表达无明显变化。结论:线粒体融合蛋白MFN1在肝癌转移组织中表达显著降低,可能通过激活MMP7表达,促进肝癌细胞侵袭和转移。     

肝细胞癌患者外周血HSF1 基因表达的检测及应用价值

目的:建立检测HSF1 mRNA的real-time PCR的方法,了解肝细胞癌患者外周血中HSF1的表达水平及其与各临床病理特征之间的关系。方法:利用real-time PCR的方法检测20例肝细胞癌患者及20例正常人群外周血中HSF1 mRNA的表达量。结果:肝细胞癌患者外周血中的HSF1 mRNA表达量显著高于正常人群(P<0.05);肝细胞癌患者外周血中HSF1 mRNA的表达水平在不同性别、肿瘤大小、门静脉侵犯情况、HbsAg水平及AFP水平的患者中的差异无统计学意义(P>0.05);在不同病理分化程度、TNM分期的患者中的差异有统计学意义(P<0.05)。结论:real-time PCR技术可以成功检测外周血中HSF1 mRNA的表达量,HSF1可能与肝细胞癌的发生发展密切相关。     

RNA干扰肝细胞肝癌中PECAM-1的表达对肿瘤细胞侵袭及增殖的影响

目的:探讨PECAM-1在肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达及意义。方法:选择2013年5月-2015年6月在我院接受治疗的HCC患者100例,收集肝癌患者HCC组织及癌旁组织,另选取100例正常肝脏组织作为对照组。应用免疫组织化学法检测PECAM-1在肝癌组织、癌旁组织以及正常肝脏组织中的阳性表达。利用小分子干扰RNA技术(si RNA)构建低表达的PECAM-1,并转染至肝癌细胞中抑制PECAM-1的表达。应用Transwell小室法检测肝癌细胞的侵袭能力,CCK-8法检测肝癌细胞的增殖能力。结果:PECAM-1在肝癌组织、癌旁组织及正常肝脏组织中呈不同程度阳性表达(P0.05);PECAM-1在肝癌组织及癌旁组织中的表达显著高于正常肝脏组织,差异具有统计学意义(P0.05);PECAM-1在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P0.05);转染si RNA PECAM-1后,肝癌细胞中PECAM-1 m RNA的表达水平明显下降,PECAM-1蛋白表达也明显降低,差异具有统计学意义(P0.05);转染si RNA PECAM-1后,肝癌细胞侵袭及增殖能力明显降低,差异具有统计学意义(P0.001)。结论:PECAM-1在肝癌患者血清中高表达,PECAM-1 si RNA能够抑制肝癌细胞的侵袭及增殖能力,提示PECAM-1可作为预测肝癌发生及发展的临床指标。