应用Surrogate 报告载体提高RISPR/Cas9 对TMEM215基因的打靶效率*

目的:构建Surrogate报告载体,并利用Surrogate报告载体提高CRISPR/Cas9对HEK293T细胞TMEM215基因打靶效率。方法:构建针对人TMEM215的CRISPR/Cas9表达载体及相应Surrogate报告载体,两者共转HEK293T细胞,通过流式分析、T7EI检测、TA克隆测序等明确Surrogate报告载体对不同sgRNA打靶效率的检测及对基因修饰细胞的筛选富集作用。结果:流式分析结果表明,Surrogate报告载体成功检测出不同sgRNA的打靶效率,并筛选出高效率sgRNA;T7EI检测及TA克隆测序显示,外加嘌呤霉素抗性筛选时,Surrogate报告载体可有效富集基因修饰细胞。结论:成功构建Surrogate报告载体,并利用Surrogate报告载体提高CRISPR/Cas9对HEK293T细胞TMEM215基因的打靶效率。     

运用CRISPR/Cas9技术敲除人源黏着斑蛋白基因

目的:建立CRISPR/Cas9n系统,用于敲除人源黏着斑蛋白(VCL)基因。方法:设计一个靶向人源VCL基因第3个外显子的单向导RNA(sgRNA),分别克隆表达载体后,通过慢病毒转入人MDA-MB-231细胞,通过PCR及Western印迹检测细胞株中VCL基因的敲除效果。结果:测序结果显示靶向VCL基因CRISPR/Cas9重组质粒构建成功;PCR产物测序结果表明本次设计的Cas9/sgRNA能够对VCL基因进行编辑敲除;Western印迹显示Cas9-VCL组的MDA-MB-231细胞内VCL表达水平较对照组显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9系统获得了靶向VCL基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除VCL。     

CRISPR/Cas9技术在生物医学领域的非病毒及病毒载体

规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)及CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统是一种新型基因组编辑技术,能够靶向干扰或修复基因组的特定基因.来自细菌或人工改造的CRISPR/Cas9系统已经由生物学家发现或构建,Cas9核酸酶及单链导向RNA(sgRNA)是CRISPR/Cas9系统的主要组成成分.该系统被广泛应用于疾病治疗新靶点的发掘,基因功能的鉴定,动物模型的建立以及基因治疗药物的开发.CRISPR/Cas9系统已经通过突变或修正疾病相关基因来部分缓解或彻底治愈某些病症.然而,如何有效递送CRISPR/Cas9至目标细胞及靶器官仍然是运用该技术所面临的挑战之一,这影响着该系统稳定和精准的基因编辑能力.本文主要综述Cas9mRNA,Cas9蛋白或编码Cas9基因及相应sgRNA载体的递送系统.递送Cas9蛋白的非病毒载体能够维持Cas9的靶向作用,减少脱靶效应;递送sgRNA和供体模板的病毒载体能够改进基因编辑及同源修复效率.安全,有效及可规模化生产的递送载体将会推进CRISPR/Cas9技术在人类基因治疗领域中的应用.     

Cas9蛋白对亲骨转移人乳腺癌细胞株生物学性质和超微结构的影响

目的：构建表达Cas9蛋白的亲骨转移人乳腺癌细胞株,并研究Cas9蛋白的表达对细胞生物学性质和超微结构的影响,为利用CRISPR/Cas9技术研究乳腺癌骨转移分子机制提供实验基础。方法：通过慢病毒载体介导Cas9蛋白基因转染亲骨转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO,通过G418筛选转染细胞,采用流式细胞术、Western blot、免疫细胞化学验证Cas9基因转染是否成功;运用实时无标记动态细胞分析技术和细胞划痕实验检测Cas9蛋白表达对细胞增殖及迁移的影响;透射电镜观察Cas9蛋白表达对细胞超微结构的影响。结果：成功构建稳定表达Cas9蛋白的亲骨转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO-Cas9,Cas9蛋白的表达对细胞的增殖、迁移和超微结构无明显影响。结论：MDA-MB-231BO-Cas9细胞可用于CRISPR/Cas9技术进一步研究。     

靶向剪切AAVS1位点CRISPR/Cas9腺病毒系统的构建

本研究拟使用腺病毒介导的CRISPR/Cas9系统靶向剪切AAVS1位点,为实现AAVS1位点基因定点插入奠定基础。设计针对AAVS1位点的gRNA序列,连接到pENTRY-U6-h EF1a-Cas9载体,通过Gateway技术重组到腺病毒骨架质粒pAD,转染293A细胞包装腺病毒。腺病毒感染Hela细胞系,使用T7E1酶切及测序检测AAVS1位点的打靶效率。T7EI酶切结果显示腺病毒介导的CRISPR/Cas9系统剪切效率达到28.5%。腺病毒介导的CRISPR/Cas9系统对AAVS1位点成功实施了剪切,为下一步在Hela细胞内进行基因定点敲入及基因治疗奠定了基础。     

利用 CRISPR／Cas9敲除大鼠胰岛素受体底物1（Ir s1）基因

目的：为研究胰岛素受体底物1（Irs1）基因与代谢病之间的关系,我们利用CRISPR/Cas9系统敲除大鼠Irs1基因,为研究代谢病提供基因敲除大鼠。方法针对Irs1第一外显子,设计CRISPR/Cas9作用靶点,构建sgRNA表达质粒。利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9。将Cas9 mRNA和sgRNA混合物注射入SD大鼠的受精卵中,实现靶基因敲除。用T7 EN1实验初步检测靶基因的修饰情况,再经过测序分析确定突变。结果获得了5个在Irs1基因突变的首建鼠,突变效率为83％。结论得到了稳定遗传的Irs1基因敲除大鼠。     

利用CRISPR/Cas9技术产生肌肉特异表达Cas9的小鼠胚胎

目的通过CRISPR/Cas9技术获得肌肉特异性表达Cas9蛋白小鼠胚胎,为建立肌肉特异表达Cas9小鼠动物模型奠定基础。方法设计小鼠Rosa26位点sgRNA并通过体外酶切验证活性,同时使用同源重组构建肌肉特异性同源打靶载体;通过显微注射将Rosa26sgRNA与Cas9蛋白注射到小鼠胚胎,通过PCR及测序检测胚胎的编辑情况,同时移植到假孕母鼠体内,待其生产;将同源打靶载体与Rosa26sgRNA和Cas9一起注射到小鼠胚胎,通过PCR检测整合情况。结果体外酶切实验表明,体外转录的sgRNA与Cas9蛋白联合可对靶位点产生编辑作用;成功构建了肌肉特异性同源打靶载体Donor-SP-px459;通过原核注射获得Rosa26基因编辑胚胎,经移植获得Rosa26基因编辑小鼠;注射同源打靶载体后,成功获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶小鼠胚胎。结论利用CRISPR/Cas9技术,成功获得Rosa26基因编辑胚胎和小鼠,并获得了肌肉特异性表达Cas9蛋白小鼠胚胎,为利用基因打靶构建肌肉特异表达Cas9的小鼠动物模型奠定基础。     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的EGFP基因定点整合表达

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,实现EGFP基因在CHO细胞ACTB基因座位置定点整合和表达,建立基于CRISPR/Cas9技术的外源基因定点整合和表达技术。方法:根据CHO细胞β-actin(ACTB)基因起始密码子区基因序列,设计相应CRISPR/Cas9系统,同时构建含有ACTB同源臂和EGFP基因的同源供体载体(donor vector),通过脂质体转染法同时转染CRISPR/Cas9和供体载体,流式分选EGFP阳性细胞,分析基因编辑技术在EGFP基因定点整合和表达方面的可行性。结果:构建了能有效切割CHO细胞ACTB基因的CRISPR/Cas9系统,筛选到EGFP定点整合至ACTB基因座并有效表达的细胞,ACTB基因缺失后由于γ-actin代偿性表达增强,ACTB缺失细胞形态和生长未受影响。结论:单纯依靠基因编辑技术可以实现1 kb以内的基因同源置换,但效率较低,如实现更大片段的外源基因置换,需借助其它实验技术。     

基于CRISPR/Cas9系统定点编辑小鼠MAD2L1基因及其脱靶效应分析

目的建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系,并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列,并构建Cas9-MAD2L1载体,将该载体转染到NIH/3T3细胞中,通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察GFP后,提取细胞转染后的基因组DNA,利用PCR方法,结合T7E1分析和桑格尔测序,鉴定对小鼠MAD2L1基因编辑情况,并对转染后的NIH/3T3细胞进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析。结果将Cas9-MAD2L1载体转染到NIH/3T3细胞并进行嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜下观察到大量表达GFP的细胞,PCR结合T7E1结果显示,以转染后的细胞DNA为模板扩增出的228 bp MAD2L1 PCR产物,可被酶切成166 bp和62 bp片段,测序结果显示,成功对MAD2L1基因第二外显子靶点处进行基因编辑,脱靶效应分析未检测到CRISPR/Cas9有对脱靶位点进行基因编辑。结论成功建立对小鼠MAD2L1基因第二外显子进行基因编辑的方法体系,设计的对MAD2L1基因编辑靶点未检测到脱靶效应的发生。     

靶向miRNA前体不同类型sgRNA的丰度及特异性评估

CRISPR/Cas技术能高效进行基因组定点编辑,但不同细菌来源或人工改造的Cas9以及Cpf1等核酸酶识别的PAM (protospacer adjacent motif)有差异,因此不同的基因编辑核酸酶可能采用不同类型的sgRNAs(small guide RNAs)。MicroRNAs (miRNAs)是一类调控性的小分子非编码RNAs,为了研究miRNA前体中是否可能存在特异性高的sgRNAs靶点,本文利用本课题组前期开发的生物信息学软件CRISPR-offinder,对靶向28 645条miRNA前体的11种不同类型sgRNA的丰度及特异性进行了分析,并利用CRISPR/Cas9慢病毒技术构建了猪miR-302/367基因簇敲除细胞系,对构建的猪miRNA敲除细胞系的效率进行了检测。结果表明,每个miRNA前体中平均存在约8种不同类型sgRNA的靶点;通过评估靶向猪miRNA前体sgRNA的脱靶效应,发现其中特异性高的sgRNA仅占18.2%;通过CRISPR/Cas9慢病毒技术成功构建了猪miR-302/367基因簇敲除细胞系,发现通过该技术构建miRNA敲除细胞系的效率为40%。本研究为利用CRISPR/Cas技术靶向敲除miRNA提供了重要资源。     

利用CRISPR/Cas9技术对人多能干细胞进行高效基因组编辑

CRISPR/Cas9技术提供了一个全新的基因组编辑体系。本文利用CRISPR/Cas9平台,在人胚胎干细胞株中对选取的一段特定基因组区域进行了多种基因组编辑：通过在基因编码框中引入移码突变进行基因敲除;通过单链DNA提供外源模板经由同源重组定点敲入FLAG序列;通过同时靶向多个位点诱导基因组大片段删除。研究结果表明CRISPR/Cas9可以对多能干细胞进行高效基因编辑,获得的突变干细胞株有助于对基因和基因组区域的功能进行分析和干细胞疾病模型的建立。     

sgRNAcas9软件图形用户界面开发及应用

CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术是新一代功能强大的基因修饰技术。然而,脱靶效应(Off-target effects)是目前CRISPR/Cas9技术面临的最大问题。因此,设计脱靶风险低的sgRNA(single guide RNA)就成为关键。sgRNAcas9是一款专门用于sgRNA设计和评估脱靶效应的软件包。针对其核心运行程序,我们利用Java程序语言开发了其图形用户界面。此外,依据脱靶位点碱基数和sgRNA种子序列(seed sequences)的特异性,通过设置不同的风险等级对sgRNA的脱靶效应进行评估。随后,利用此软件设计了34 124条靶向人、小鼠、大鼠、猪和鸡中共4691个microRNA(miRNA)前体的sgRNAs。此外,随机挑选了一个靶向人miR-206前体的sgRNA进行脱靶效应评估和验证。结果发现,sgRNAcas9软件人机交互界面友好,大多数miRNA前体可通过该软件寻找到sgRNA,且他们的GC%含量范围集中于40%~60%。利用sgRNAcas9软件设计的靶向miR-206的sgRNA,其基因组编辑活性和脱靶位点可被实验验证。本研究表明sgRNAcas9图形用户界面软件能针对任意物种设计特异性的sgRNA,其可在BiooTools(http://www.biootools.com/)网站下载。     

CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing in Soybean Hairy Roots

As a new technology for gene editing, the CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/Cas (CRISPR-associated) system has been rapidly and widely used for genome engineering in various organisms. In the present study, we successfully applied type II CRISPR/Cas9 system to generate and estimate genome editing in the desired target genes in soybean (Glycine max (L.) Merrill.). The single-guide RNA (sgRNA) and Cas9 cassettes were assembled on one vector to improve transformation efficiency, and we designed a sgRNA that targeted a transgene (bar) and six sgRNAs that targeted different sites of two endogenous soybean genes (GmFEI2 and GmSHR). The targeted DNA mutations were detected in soybean hairy roots. The results demonstrated that this customized CRISPR/Cas9 system shared the same efficiency for both endogenous and exogenous genes in soybean hairy roots. We also performed experiments to detect the potential of CRISPR/Cas9 system to simultaneously edit two endogenous soybean genes using only one customized sgRNA. Overall, generating and detecting the CRISPR/Cas9-mediated genome modifications in target genes of soybean hairy roots could rapidly assess the efficiency of each target loci. The target sites with higher efficiencies can be used for regular soybean transformation. Furthermore, this method provides a powerful tool for root-specific functional genomics studies in soybean.     

CRISPcut: A novel tool for designing optimal sgRNAs for CRISPR/Cas9 based experiments in human cells

The ability to direct the CRISPR/Cas9 nuclease to a unique target site within a genome would have broad use in targeted genome engineering. However, CRISPR RNA is reported to bind to other genomic locations that differ from the intended target site by a few nucleotides, demonstrating significant off-target activity. We have developed the CRISPcut tool that screens the off-targets using various parameters and predicts the ideal genomic target for –guide RNAs in human cell lines. sgRNAs for four different types of Cas9 nucleases can be designed with an option for the user to work with different PAM sequences. Direct experimental measurement of genome-wide DNA accessibility is incorporated that effectively restricts the prediction of CRISPR targets to open chromatin. An option to predict target sites for paired CRISPR nickases is also provided. The tool has been validated using a dataset of experimentally used sgRNA and their identified off-targets.URL: http://web.iitd.ac.in/crispcut     

An efficient CRISPR/Cas9 platform for targeted genome editing in rose (Rosa hybrida)

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-related nuclease 9(Cas9) system enables precise, simple editing of genes in many animals and plants.However, this system has not been applied to rose(Rosa hybrida) due to the genomic complexity and lack of an efficient transformation technology for this plant. Here, we established a platform for screening single-guide RNAs(sgRNAs) with high editing efficiency for CRISPR/Cas9-mediated gene editing in rose using suspensio...     

基于新的CRISPR/Cas9技术实现斑马鱼LHX9基因的快速编辑及对F0突变体性腺发育的初筛

目的:CRISPR/Cas9系统在斑马鱼的反向遗传学中的到了广泛应用,但突变基因的表型观察往往需要在突变鱼系的F1中进行,费时较长。LHX9作为LIM家族的一种转录因子,在胚胎早期的泌尿生殖嵴中有广泛分布;且LHX9基因敲除的小鼠存在性腺发育不良。本研究拟通过一种新的CRISPR/Cas9基因编辑技术,采用四条sgRNA对LHX9基因进行VASA转基因斑马鱼的基因敲除,以观察该基因缺陷对斑马鱼性腺发育的影响。方法:利用新的CRISPR/Cas9技术,设计四条针对斑马鱼LHX9基因3号外显子的20bp的sgRNA,通过非克隆体外转录得到靶位点的四条sgRNA。将以上靶位点的四条sgRNA与Cas9核酸酶蛋白同时注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内,利用PCR鉴定突变型类型和突变比例。通过对LHX9基因突变体的VASA转基因斑马鱼进行荧光观察,发现LHX9基因缺陷的斑马鱼性腺发育的情况。结果:靶向Exon 3的四条sgRNA可成功编辑斑马鱼LHX9基因,敲除效率高达82%,Sanger测序发现产生10种不同的移码突变类型。通过该方法对VASA转基因斑马鱼的LHX9基因进行编辑,发现LHX9基因突变导致dph6的的斑马鱼原始生殖细胞增殖和迁移受到影响。结论:基于4条sgRNA注射的CRISPR/Cas9技术,可以快速地产生具有突变表型的G0斑马鱼,具有应用潜力。LHX9基因敲除导致原始生殖细胞的发育和迁移受到影响,提示该基因参与了斑马鱼早期性腺的发育。