牛病毒性腹泻病毒E^rns-E2融合蛋白在果蝇S2细胞中的表达与鉴定

目的：利用果蝇S2细胞表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）Erns-E2融合蛋白,并对其抗体结合能力进行鉴定。方法：用RT-PCR方法扩增BVDV NADL株Erns和E2蛋白的编码基因,利用（G4-S）3柔性15肽基因将扩增的2个基因连接,再与昆虫表达载体pMT/BiP/V5-His连接构建重组表达载体pMT/BiP/V5-His-Erns-E2,将后者与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞后表达Erns-E2融合蛋白,并对表达产物进行鉴定。结果：SDS-PAGE结果表明,融合蛋白相对分子质量为76800;Western blotting检测表明,该融合蛋白具有与BVDV抗体良好的结合能力。结论：BVDV的Erns-E2融合蛋白能在果蝇S2细胞中进行表达;经鉴定,表达产物具有良好的抗体结合能力,可用于抗原检测。     

家蚕微孢子虫极管蛋白1 (NbPTP1) 在果蝇S2细胞中的表达与糖基化修饰

极管蛋白(Polar tube protein)是极管的主要成分,能特异性定位于微孢子虫极管,在微孢子虫侵染宿主过程中发挥重要作用。文中分析了家蚕微孢子虫极管蛋白1中潜在的O-、N-糖基化修饰位点,克隆了家蚕微孢子虫极管蛋白1全基因序列,并将其插入带有V5和His标签的真核表达载体pMT/Bip/V5-His A中,成功构建了pMT/Bip/V5-His A-NbPTP1重组质粒,经转染果蝇S2细胞后,发现NbPTP1基因能在果蝇细胞中高效表达。此外,Lectin blotting和β-消除反应分析结果表明:果蝇S2细胞内表达的NbPTP1具有O-糖基化修饰特征。以上结果为研究NbPTP1的糖基化修饰特征与其功能之间的关系提供了基础,有助于揭示微孢子虫侵染机制,建立可行有效的微孢子虫病诊断和防治措施。     

HIV包膜蛋白Gp120在果蝇Schneider 2细胞内的表达纯化及初步性质鉴定

构建pMT/BiP/V5-HisA-HIVgp120真核表达载体,通过稳定转染获得稳定表达gp120蛋白的果蝇Schnei-der2(S2)细胞系,并对gp120蛋白进行大量表达和纯化。应用聚合酶链式反应技术从重组载体PVR1012-gp120中扩增出中国流行株CRF07-BCgp120全长基因后,将其插入载体pMT/BiP/V5-HisA。应用脂质体转染技术将真核表达载体和抗性筛选质粒共转染果蝇S2细胞,通过杀稻瘟菌素反复筛选,建立稳定高表达gp120蛋白的果蝇S2细胞系,并通过镍柱亲和层析和分子筛法纯化目的蛋白。用SDS-PAGE对重组蛋白的分子量和纯度进行分析,并通过Western blot和酶联免疫吸附技术(ELISA)对其进行鉴定。成功构建了gp120真核表达载体并获得了稳定转染该蛋白的果蝇S2细胞系,成功的表达了具有良好抗体反应性的gp120全长蛋白。此结果为深入研究HIV包膜蛋白gp120的生物学特性及进行HIV疫苗的研究提供了良好的物质基础。     

人单链白细胞介素12基因在果蝇细胞中的表达

用PCR方法扩增不含信号肽序列的hscIL-12基因,并装载到果蝇表达质粒pMT/Bip/V5中,将其转化黑腹果蝇细胞S2中进行分泌表达,以淋巴细胞增殖实验检测表达的hscIL-12的生物学活性,结果表明hscIL-12可促进淋巴细胞增殖,呈剂量依赖性（P＜0.05 ),提示在果蝇系统中表达的hscIL-12具有与天然IL－12相同的生物学活性,有良好的研究和临床应用前景。     

牛病毒性腹泻病毒Erns-E2融合蛋白在果蝇S2细胞中的表达与鉴定

目的:利用果蝇S2细胞表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Erns-E2融合蛋白,并对其抗体结合能力进行鉴定.方法:用RT-PCR方法扩增BVDV NADL株Erns和E2蛋白的编码基因,利用(G4-S)3柔性15肽基因将扩增的2个基因连接,再与昆虫表达载体pMT/BiP/V5-His连接构建重组表达载体pMT/BiP/V5-His-E(MS)-E2,将后者与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞后表达Erns-E2融合蛋白.并对表达产物进行鉴定.结果:SDS-PAGE结果表明,融合蛋白相对分子质量为76 800;Westem blotting检测表明,该融合蛋白具有与BVDV抗体良好的结合能力.结论:BVDV的Erns-E2融合蛋白能在果蝇S2细胞中进行表达;经鉴定,表达产物具有良好的抗体结合能力,可用于抗原检测.     

人乳头状瘤病毒癌蛋白E6和E7双标记质粒的构建及应用

目的:构建人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)-16 E6、E7癌蛋白及其突变型的双筛选标记质粒并筛选出稳定表达HPV-16癌蛋白的肺癌A549细胞株。方法:以携带新霉素抗性基因neo的pEGFP质粒(pEGFP-N1)为空载体,在EcoRⅠ和BamHⅠ位点间插入HPV-16 E6、E7及其突变型基因。新构建的质粒鉴定后转染A549细胞并用G418筛选,多次挑取单克隆后用流式细胞仪分选带荧光的细胞。结果:PCR、双酶切鉴定结果及DNA序列测定结果均证实质粒构建正确;PCR扩增结果显示细胞中存在目的基因;流式细胞术结果显示细胞阳性率高;Western blotting结果显示细胞能表达HPV-16 E6、HPV-16 E7蛋白。结论:成功构建pEGFP-E6、E7质粒并筛选出稳定表达E6和E7癌蛋白的A549细胞株,为进一步研究HPV对肺癌的影响奠定了基础;同时发现G418筛选结合流式细胞仪分选可提高稳定转染细胞的阳性率。     

甲型H1N1流感病毒HA基因在昆虫细胞中的截短表达

目的:利用Bac-to-Bac Baculovirus Expression System表达重组HA蛋白,Western blot及IFA方法鉴定其表达。方法:采用PCR方法扩增A/California/04/2009(H1N1)HA基因,将其克隆到pFastBacHT A载体上,重组质粒pFastBacHT-HA经双酶切及测序鉴定正确后,转化阳性重组载体进入E.coli DH10Bac感受态细胞中,通过Bluo-gal蓝白斑筛选、PCR鉴定获得重组转座子rBacmid-HA。从重组转座子中提取rBacmid-HA质粒DNA转染sf 9昆虫细胞,制备重组杆状病毒。重组杆状病毒感染sf 9细胞表达重组蛋白,Western blot及IFA鉴定重组蛋白表达情况。结论:成功构建了甲型H1N1流感病毒HA基因的昆虫杆状病毒表达载体,该表达载体转染昆虫细胞后制备的重组杆状病毒病毒滴度较高,重组杆状病毒表达的重组蛋白经Western blot 及IFA 鉴定后具有良好的免疫反应原性。     

重组人凝血因子Ⅷ表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的:构建含有B区缺失型(△760aa-1639aa)人凝血因子Ⅷ(B domain-deleted human FⅧ,BDDhFⅧ)的真核表达质粒,转染HepG2细胞使其稳定表达人凝血因子Ⅷ。方法:将BDDhFVIII基因片段插入pcDNA4/v5-his空载体中构建重组真核表达质粒,测序正确后电转入HepG2细胞,经Ni-NTA纯化,利用Western blot检测凝血因子Ⅷ在HepG2细胞中的表达,持续培养获得稳定表达BDDhFⅧ蛋白的细胞株。结果:经限制性酶切和测序鉴定均证实重组真核表达质粒pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ成功构建,在转染HepG2细胞后,Western blot检测证实人凝血因子Ⅷ可以在HepG2细胞中正确表达。结论:成功构建了人凝血因子Ⅷ的稳定细胞株,并能在HepG2细胞表达目的蛋白。     

可溶性尿激酶受体的表达、纯化和结晶

克隆尿激酶受体可溶区域(suPAR)到果蝇胚胎细胞分泌表达载体pMT/Bip/v5-his,重组质粒与pCoHygro共转染果蝇S2细胞,筛选多拷贝稳定表达细胞系suPARS2.suPAR表达蛋白经尿激酶N端片段亲和柱、ResourceQ阴离子交换柱两步纯化后,得到高纯度的、稳定的suPAR单体.纯化后的蛋白质,与其抗体ATN615及尿激酶N端片段结构域等摩尔混合,浓缩至10g/L,以透析法进行该三元复合物晶体生长,获得衍射分辨率为1.9#的蛋白质晶体.     

TNFalph 和 IL-1bet 靶点抗炎药物筛选细胞模型的构建

目的:构建两个高表达人TNFα和IL-1β细胞系,建立抗炎药物筛选细胞模型。方法:运用PCR的方法从载体pCMVSport-TNFα和p CMVSport-IL1β上扩增目的基因,以亚克隆方法将目的基因分别插入真核表达载体pcDNA3.1和pFLAG-CMV中,用单酶切、PCR扩增和基因测序的方法鉴定重组效果,然后将重组成功的质粒转入HEK293细胞系内,挑选能够稳定表达并遗传的单克隆细胞株,用蛋白免疫印迹(Western blot)法分析其表达效果。结果:三种鉴定方法均显示重组质粒构建成功。Western blot结果显示,细胞株T3、T4均能较高表达炎症因子TNF-α;细胞株I2、I3、I5均能较高表达炎症因子IL-1β。结论:成功构建了TNFα和IL-1β靶标的药物筛选细胞模型,为筛选具有抗炎作用的中药提供了一个新平台。     

EEF1A2基因慢病毒表达载体的构建及慢病毒表达系统的建立

利用PCR方法合成EEF1A2的基因全长,经NotⅠ和NsiⅠ酶切后克隆到慢病毒载体pGLV5-EF1a-EGFP/Puro上。构建的重组质粒pGLV5/EEF1A2经PCR、酶切及测序鉴定正确后,利用慢病毒表达系统(pGLV5 Lentiviral Expression Systems),将重组质粒与包装系统质粒(pVSV-G,pGag/Pol,pRev)4质粒共转染293T细胞,收集培养上清并感染人胰腺癌SW1990细胞,经嘌呤霉素筛选出稳定过表达细胞株EEF1A2/SW1990。Real-time PCR和West-ern blot检测结果显示EEF1A2在EEF1A2/SW1990细胞中表达较原代细胞明显增高(P<0.05),MTT结果显示EEF1A2/SW1990细胞的增殖能力亦较原代细胞显著增强(P<0.05)。成功构建了EEF1A2基因的慢病毒载体质粒pGLV5-EEF1A2及其慢病毒表达系统,并筛选出稳定过表达EEF1A2的人胰腺癌细胞株EEF1A2/SW1990。     

稳定表达重组小鼠FAPα蛋白细胞株的构建

采用RT-PCR方法从BALB/c胚鼠成纤维细胞克隆FAPα基因,将其连接至表达栽体pTd-FL-N,转化Stbl3感受态.筛选重组质粒,经酶切、PCR检测及测序鉴定,证实表达质粒构建正确.将表达载体转染HEK293细胞,经G418筛选单克隆阳性细胞,采用Western blot技术证实稳定表达FAPα细胞株构建成功.通过流式细胞术确定FAPa蛋白可定位表达于细胞膜上.     

稳定表达流感病毒基质蛋白2的哺乳动物细胞系的建立

本研究构建了稳定表达甲型流感病毒基质蛋白2(M2)的哺乳动物细胞系。应用PCR方法扩增A/PR/8/34(H1N1)株流感病毒M2基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA5/FRT(pDF)上,构建出pDF-M2重组质粒。将鉴定正确的pDF-M2与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In-CHO细胞,通过体内同源重组使目的基因整合到宿主细胞染色体上。筛选具有Hygromycin B抗性的重组细胞株命名为CHO-M2。以间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法检测M2的表达,共获得15株高表达M2蛋白的重组细胞株。这些重组细胞株在连续培养10代后,PCR方法仍可检测到M2基因的存在,IFA也检测到蛋白的稳定表达。本研究成功获得了稳定表达甲型流感病毒M2的哺乳动物细胞系,为M2蛋白的功能研究和非复制型流感病毒疫苗的研制提供了新的工具。     

Netrin-1慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建携带有Netrin-1基因的逆转录病毒载体,为研究Netrin-1在神经发育中的作用奠定基础。方法:PCR扩增Netrin-1基因片段后,将其克隆入慢病毒表达载体pLXSN;通过PCR、酶切、测序鉴定重组质粒。重组质粒转染PA317包装细胞后获得包装的病毒颗粒。病毒颗粒感染人脑胶质瘤细胞SW038-C2,经Western blot证明重组病毒在真核细胞内表达Netrin-1的情况。结果:经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒构建正确,命名为pLX-NT。Western blot证明在感染细胞泳道有一特异性条带。结论:成功构建了能表达Netrin-1的慢病毒载体。     

高表达Snail蛋白诱导黑色素瘤EMT细胞模型的构建及鉴定

目的:构建稳定表达Snail蛋白的可用于肿瘤上皮-间质化研究的肿瘤细胞模型.方法:采用亚克隆方法从质粒pCMV6-mSnail中PCR扩增小鼠Snail基因,连接至表达质粒pL-tdTomato-Neo,筛选重组质粒并经双酶切及测序鉴定.构建成功的重组质粒pL-tdTomato-mSnail转染小鼠黑色素瘤B16细胞,G418筛选稳定细胞株.采用荧光定量PCR和Western blot技术检测胞内Snail及上皮/间质标志物的变化.建立裸小鼠皮下移植瘤模型,活体成像系统观测移植瘤.结果:重组质粒pL-tdTomato-mSnail成功构建,其稳定转染株B16/dT-mSN胞体发出强烈红色荧光.胞内Snaill水平显著上调,E-钙粘蛋白下调,波形蛋白表达上调,呈现典型的上皮-间质化表型.结论:成功获得稳定高表达小鼠Snail蛋白的EMT细胞模型,且可用于体内外荧光成像观测,为研究Snail蛋白在介导肿瘤EMT过程中的生物作用提供了重要的实验工具.     

利用CRISPR/Cas9n系统敲除人源SNF5基因

目的:建立敲除人源基因组中SNF5基因的CRISPR/Cas9n系统。方法:设计一对靶向人源SNF5基因第1个外显子的sg RNA,分别克隆至p X461、p X462表达载体后,转入人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测细胞株中SNF5基因的敲除效果。结果:测序证明构建的靶向SNF5基因CRISPR/Cas9n重组质粒与设计吻合。Western印迹结果显示,重组质粒p X461-h SNF5sg RNA转染293T细胞后24 h,细胞内SNF5表达水平明显降低;重组质粒p X462-h SNF5sg RNA转染293T细胞后48 h,细胞内SNF5表达水平显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9n系统获得了靶向SNF5基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除SNF5基因的表达。     

GALNT14对人乳腺癌MCF-7细胞迁移的影响

构建真核表达载体pcDNA 3.1-Flag-T14,重组质粒经酶切分析及测序鉴定后,利用脂质体将重组质粒转染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞,经G418筛选并建立稳定转染GALNT14细胞株.应用半定量RT-PCR、Western blot检测稳定细胞株GALNT14 mRNA及蛋白表达水平,细胞划痕修复及穿膜试验检测GALNT14基因对MCF-7迁移能力的影响,同时RT-PCR检测GALNT14对MMP-2,MMP-9,TGF-β1及VEGF等肿瘤浸润转移相关因子表达的影响.结果显示成功构建了真核重组表达载体pcDNA 3.1-Flag-T14,经RT-PCR和Western blot检测显示成功获得了稳定表达GALNT14的MCF-7细胞株;GALNT14能够提高MCF-7细胞株的迁移能力,且能增加侵袭转移相关因子MMP-2,MMP-9,TGF-β1及VEGF的表达.结论:GALNT14可明显促进MCF-7细胞的迁移,可能在肿瘤侵袭转移中起重要作用.     

融合表达新冠病毒S1与N蛋白的非复制型重组腺病毒的构建与鉴定

体外构建融合表达新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S1抗原与N抗原的复制缺陷型重组腺病毒疫苗,为深入开展该疫苗免疫原性的研究提供基础。利用Overlap PCR和同源重组方法构建插入SARS-CoV-2的S1-N基因的重组腺病毒质粒pKAd5-S1-N,通过琼脂糖凝胶电泳、多酶切、测序等方法鉴定重组质粒正确性;重组质粒转染HEK293A细胞获得病毒毒种AdV5-S1-N并扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,有限稀释分析法测病毒滴度,Western blot方法验证AdV5-S1-N重组腺病毒S1-N融合蛋白表达情况;将AdV5-S1-N疫苗通过肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,第14d采集颌下静脉血,ELISA法检测血清针对S1和N蛋白抗原的特异性抗体滴度。成功获得滴度为9.45×10¹¹IU/mL的重组腺病毒AdV5-S1-N。Western blot结果发现：AdV5-S1-N感染细胞后,融合蛋白可正常表达,与抗S1蛋白及抗N蛋白抗体均有特异结合。ELISA结果显示免疫重组腺病毒的小鼠可产生针对S1和N蛋白的特异性IgG抗体。应用复制缺陷型腺病毒载体成功获得...     

p16真核表达载体的构建及其稳定表达的NIH3T3细胞株的建立

目的　构建pCR○R3 1 p16真核表达质粒 ,并建立其稳定表达的NIH3T3细胞株。方法　将人的p16cDNA亚克隆至pCR○R3 1,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌 ,筛选阳性克隆 ,进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定及DNA测序 ,将已鉴定的pCR○R3 1 p16经脂质体介导转染至NIH3T3细胞中。结果　重组质粒双酶切后 ,出现约 80 0bp片段 ,提示p16cDNA片断已插入pCR○R3 1多克隆位点内 ,DNA测序显示p16cDNA按照正确方向和阅读框插入表达载体pCR○R3 1。通过pCR○R3 1 p16转染NIH3T3细胞 ,获得 10个G4 18抗性克隆 ,其中 2个为RT PCR阳性。结论　成功构建pCR○R3 1 p16真核表达载体并建立了其稳定表达的NIH3T3细胞株。为建立p16转基因鼠奠定基础。     

柯萨奇B3病毒结构和非结构蛋白基因重组质粒的构建及其在体外真核细胞中的表达

制备CVB3结构蛋白和非结构蛋白重组质粒DNA疫苗时 ,采用RT PCR从CVB3感染的HeLa细胞中扩增VP1、VP2、2A和 3D基因 ,重组入真核表达质粒 pcDNA3中 ,构建pcDNA3/VP2、pcDNA3/VP1、pcDNA3/ 2A和pcDNA3/ 3D重组质粒 ,经酶切和测序证实扩增的序列并将各重组质粒体外转染真核细胞COS 7,用RT PCR检测mRNA的转录 ,用Western blot检测表达产物。结果 4种重组质粒酶切出相应大小的目的片段 ,经测序证实为CVB3相应序列 ,Western blot证实能够在体外真核细胞中表达。本文成功构建CVB3结构与非结构蛋白的重组质粒DNA疫苗 ,为进一步研究其免疫效果奠定了基础。