杂交石斑鱼干扰素调节因子3(IRF3)基因的克隆及表达分析

干扰素调节因子家族(IRFs)具有抗病毒、免疫调节功能,干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF-3)是IRFs家族中的一员,也是免疫相关因子。为了解IRF3基因在杂交石斑鱼(Epinephelus. fuscoguttatus,♀)×清水石斑鱼(E.polyphekadion,♂)应对外源病毒刺激的免疫反应,利用cDNA末端快速扩充(Rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆了杂交石斑鱼IRF3基因,该基因cDNA全长为2 529 bp,包含5'非编码区(5'-UTR)325 bp,3'非编码区(3'-UTR)916 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)1 377 bp,可编码458个氨基酸。氨基酸序列包含N-末端DNA结合区(N-terminal DNA binding region,DBD)(1-108 aa)、1个C-末端干扰素相关区(C-terminal interferon related region,IAD)(255-435 aa)及色氨酸富含区(Tryptophan rich region,SRD)(440-450 aa)3个结构域。系统进化分析结果显示,杂交石斑鱼IRF3与花鲈(Lateolabrax maculatus)IRF3聚为一支,亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR检测IRF3基因在杂交石斑鱼肝、胃、鳃、肠和脾脏等9种组织表达情况,以及在外周血淋巴细胞(Peripheral blood lymphocytes,PBL)的时序性表达情况,结果显示,IRF3基因在9种组织中均有表达,肝、胃和肠中的表达量明显高于其他组织,头肾表达量最低。PBL在PolyI:C刺激1 h后IRF3基因表达量逐渐升高,4 h时表达量达到最大值(约为对照组的9.3倍),8 h后逐渐下降。     

黄鳝IRF-4和IRF-10的表达研究

目的:干扰素调节因子是一类能够调控干扰素及其相关免疫基因表达的转录因子,研究黄鳝干扰素调节因子的结构及表达有助于阐明黄鳝抗病毒的机理。方法:利用PCR扩增技术获得了黄鳝干扰素调节因子10(IRF-10)和IRF-4的部分cDNA序列,再利用半定量PCR技术检测了黄鳝不同发育阶段、不同组织IRF-10和IRF-4的表达。结果:IRF-10和IRF-4在黄鳝三个不同的发育阶段表达量基本一致,但两者在黄鳝不同组织表达呈现明显的差异,IRF-10组成型表达于黄鳝各个组织中,而IRF-4仅在肠、中肾和脑中呈现很高的表达,其他组织表达很弱。结论:IRF-10组成型地表达于黄鳝各个组织,且表达量很高;而IRF-4中仅在主要免疫器官表达,且表达量较弱。     

红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)干扰素调节因子2基因的克隆及原核表达

干扰素调节因子(Interferon regulatory factor,IRF)是一种多功能的转录因子。采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了红鳍东方鲀干扰素调节因子2(Interferon regulatory factor 2,IRF2)基因的全长c DNA。该基因全长为1 552 bp,其中5'非编码区(5'-UTR)187 bp,3'非编码区(3'-UTR)429 bp,编码区(CDS)为936 bp,共编码311个氨基酸。将IRF2的编码区序列连接到原核表达载体p ET32a(+),成功构建了重组体p ET32a(+)-IRF2。将重组体p ET32a(+)-IRF2转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,获得了重组表达IRF2的基因工程菌。经IPTG诱导,p ET32a(+)-IRF2在BL21中得到了融合表达。通过对表达产物的纯化和Western blotting检测,结果显示红鳍东方鲀IRF2基因在大肠杆菌中的表达效果较高,目的蛋白准确。     

干扰素调节因子的抑制肿瘤作用

干扰素（interferon,IFN）具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种作用,是机体防御系统的重要组成部分。目前,基因工程生产的干扰素已广泛应用于临床治疗多种肿瘤。干扰素调节因子（IRF）家族在IFN的诱导表达中起着重要的调节作用。已发现了9个IRF成员,其中IRF-1和IRF-2的表达水平与宫颈癌、乳腺癌等有关;IRF-3与食管癌、宫颈癌等密切相关;IRF-5可以抑制B细胞淋巴瘤;IRF-7与乳腺癌相关;IRF-8和IRF-4参与慢性髓细胞性白血病的发病机制。     

草鱼干扰素调节因子5的表达研究

干扰素调节因子是在研究干扰素转录调控时发现的1。到目前为止,在哺乳动物和鸟类中共发现10种干扰素调节因子IRF-1-10。一般认为干扰素调节因子(IRF)通过调节干扰素的表达而行使其抗病毒、应激、免疫调节等功能2,3。近年来, 研究人员发现IRF在细胞凋亡、细胞周期、细胞分化、肿瘤发生中也起着重要的调节作用4-6。       

尾叶桉GLU4无性系F5H基因的克隆表达及序列分析

[目的]克隆尾叶桉(Eucalyptus urophylla)GLU4中F5H基因全长,并对其进行序列和表达模式分析。[方法]根据NCBI公布的F5H基因保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4茎部组织为试验材料克隆其g DNA和c DNA片段,利用荧光定量PCR分析其在植株不同组织中的表达模式。[结果]该基因g DNA长2 358 bp,c DNA长1 610 bp,含有2个外显子、1个内含子。开放阅读框编码529个氨基酸,Eu F5H编码的蛋白为一个带负电荷、存在跨膜结构、定位在内质网起始分泌途径中的蛋白质,二级结构包含典型的的α-螺旋和β-折叠,根据三级结构推测其可能具有羟化酶活性。Eu F5H蛋白与蓝桉亲缘关系较近,Eu F5H在不同组织中表达水平差异显著,其中半木质化茎中表达水平相对最高。[结论]成功获得了尾叶桉GLU4木质素合成酶基因F5H的全长序列。     

干扰素调节因子新剪接异构体IRF7-e的结构及功能

干扰素调节因子7是诱导玉型干扰素表达的最主要的转录因子。寻找IRF7新的剪接异构体,研究其结构及功能,为探索IRF7参与调控玉型干扰素机制的多样性提供基础。通过PCR和Sanger测序获得了IRF7一种新的剪接形式IRF7-e,并通过RACE获取了IRF7-e 基因全长。IRF7-e全长为1994 bp,含5'-UTR 410 bp,3'-UTR 120 bp,开放阅读框1464 bp,编码487个氨基酸的蛋白,预测其等电点为6.659,蛋白分子量为52.8 kD。双荧光素酶报告分析表明过表达IRF7-e能够提高玉型干扰素IFNα和IFNβ启动子的活性,其中对IFNα启动子活性提高了12.18倍,对IFNβ的启动子活性提高了2.99倍。表明IRF7-e可能参与玉型干扰素的调控。     

黄鳝转铁蛋白受体1基因的克隆及表达分析

旨在研究黄鳝转铁蛋白受体1基因的功能及其组织表达特异性,采用同源克隆结合RACE技术从黄鳝肝脏中分离其转铁蛋白受体1基因,用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,用半定量RT-PCR技术研究各组织中Tf R1表达水平。结果表明,克隆获得黄鳝Tf R1,Gen Bank注册序列号为KF819396。该c DNA全长2 839 bp,5'UTR长134 bp,3'UTR长380 bp,编码一个长774个氨基酸的多肽链。氨基酸多序列比对结果表明,黄鳝Tf R1基因推断的氨基酸序列同其他鱼类的同源性较高,达55.68%-68.41%;而同哺乳动物的Tf R1基因同源性较低。半定量RT-PCR分析表明,黄鳝Tf R1基因转录本在不同组织表达量有明显差异;在血细胞中表达量最高,而在肾脏、脾脏和小肠中表达中等,在肝脏、胃、皮肤、脑、心脏和肌肉中表达量很低。     

家蚕淀粉酶基因的克隆、表达与分析

淀粉酶是家蚕体内比较重要的一种消化酶。利用real-time PCR技术对Bmamy5和Bmamy7基因在家蚕5龄3 d不同组织的mRNA转录水平进行了分析,结果显示Bmamy7只在家蚕5龄3 d中肠和马氏管组织中有转录,在中肠组织的转录高达3×10~9个拷贝/μg总RNA,在马氏管组织中的转录丰度较低,只有1.9×10~6拷贝/μg总RNA;Bmamy5只在中肠组织中有转录,转录水平为1.5×10~9个拷贝/μg总RNA。根据在家蚕转录组数据库中预测的编码家蚕淀粉酶的c DNA序列设计引物,利用RT-PCR技术克隆到两个家蚕淀粉酶基因Bmamy5和Bmamy7,Bmamy7基因长1 608 bp,ORF长1 512 bp,编码503个氨基酸;氨基酸序列分析表明Bmamy7具有典型的α-淀粉酶结构域。Bmamy5全长1 196bp,ORF长738 bp,编码245个氨基酸。对Bmamy5和Bmamy7进行了原核表达,Bmamy7重组蛋活性较弱,但未检测到Bmamy5重组蛋白的目的条带。研究结果为家蚕淀粉酶基因的研究与应用提供了参考。     

乌鳢(Channa argus)MHC Class I全长cDNA序列的克隆及表达特征

旨在探究乌鳢(Channa argus)MHC基因的分子特征、表达方式及多态性。应用抑制差减杂交(SHH)和快速扩增c DNA末端(RACE)技术克隆并鉴定了乌鳢全长MHC I c DNA序列Char-Ia-1、Char-Ia-2和Char-Ib,推测氨基酸序列与已知硬骨鱼MHC I基因同源。Char-Ia-1和Char-Ia-2 c DNA序列包含1 167和1 083 bp的开放阅读框,分别编码388和360 aa的膜型Ⅰ类分子;而Char-Ib c DNA序列包含978 bp的开放阅读框,编码325 aa,显著截短的羧基末端显示Char-Ib为潜在的分泌型Ⅰ类分子。比较发现Char-Ia与Char-Ib在3'非转录区存在显著差异,在细胞外区、跨膜区和细胞质区的氨基酸序列同源性均较低,推测二者来自不同的MHC I基因座。氨基酸序列比对显示乌鳢MHC I分子与抗原肽结合的关键氨基酸残基较保守,在α1和α3结构域均出现硬骨鱼特征性的氨基酸残基缺失。进化树分析表明Char-Ia-1和Char-Ia-2聚为一簇,与Char-Ib处于不同的进化分支上,进一步证实Char-Ia与Char-Ib分别由不同MHC I基因座编码。RT-PCR分析显示乌鳢MHC I在组织中呈现组成型表达。设计基因专一性引物检测乌鳢Char-Ia与Char-Ib两类MHC I基因在组织中的表达水平,结果显示Char-Ia以较低的浓度表达于所有被检测组织,而Char-Ib主要表达于脾、肠、鳃和外周血,呈现明显的组织表达特异性,提示两类MHC I分子在鱼类免疫反应中发挥不同的生理功能。     

乌鳢(Channa argus)MHC Class I全长cDNA序列的克隆及表达特征北大核心CSCD

旨在探究乌鳢(Channa argus)MHC基因的分子特征、表达方式及多态性。应用抑制差减杂交(SHH)和快速扩增c DNA末端(RACE)技术克隆并鉴定了乌鳢全长MHC I c DNA序列Char-Ia-1、Char-Ia-2和Char-Ib,推测氨基酸序列与已知硬骨鱼MHC I基因同源。Char-Ia-1和Char-Ia-2 c DNA序列包含1 167和1 083 bp的开放阅读框,分别编码388和360 aa的膜型Ⅰ类分子;而Char-Ib c DNA序列包含978 bp的开放阅读框,编码325 aa,显著截短的羧基末端显示Char-Ib为潜在的分泌型Ⅰ类分子。比较发现Char-Ia与Char-Ib在3'非转录区存在显著差异,在细胞外区、跨膜区和细胞质区的氨基酸序列同源性均较低,推测二者来自不同的MHC I基因座。氨基酸序列比对显示乌鳢MHC I分子与抗原肽结合的关键氨基酸残基较保守,在α1和α3结构域均出现硬骨鱼特征性的氨基酸残基缺失。进化树分析表明Char-Ia-1和Char-Ia-2聚为一簇,与Char-Ib处于不同的进化分支上,进一步证实Char-Ia与Char-Ib分别由不同MHC I基因座编码。RT-PCR分析显示乌鳢MHC I在组织中呈现组成型表达。设计基因专一性引物检测乌鳢Char-Ia与Char-Ib两类MHC I基因在组织中的表达水平,结果显示Char-Ia以较低的浓度表达于所有被检测组织,而Char-Ib主要表达于脾、肠、鳃和外周血,呈现明显的组织表达特异性,提示两类MHC I分子在鱼类免疫反应中发挥不同的生理功能。     

嗜水气单胞菌溶血素基因克隆与序列分析

[目的]对嗜水气单胞菌溶血素基因(HlyA)进行克隆、序列分析和蛋白三级结构预测。[方法]根据嗜水气单胞菌溶血素基因(HlyA)设计特异性引物,采用PCR方法扩增并亚克隆至pMD18-T载体中,进行DNA测序分析。[结果]获得Hly A基因片段大小为1 022 bp,推导编码297个氨基酸,其中1-30aa区域为信号肽序列,7-196aa区域为溶血素-N端结构域(PF12563),222-297aa区域为杀白细胞素结构域(PF07968)。HlyA蛋白三级结构与模板(PDB:1XEZ_A)相似性达41.76%,主要由β折叠、转角构成,与拉马钱德兰图方法检测Hly A蛋白空间结构基本一致。[结论]该研究有助于理解嗜水气单胞菌Hly A基因功能及其溶血机制。     

绵羊ARHGAP36全长cDNA的克隆及其蛋白在睾丸精细管中的分布检测

ARHGAP36是Rho GAPs家族的一员,在成神经管细胞瘤中超表达,可能参与调节细胞增殖。为了研究ARHGAP36在羊精子发生过程中的作用,采用RACE(rapid amplification of c DNA ends)技术从绵羊睾丸组织中克隆了SARHGAP36的c DNA全长序列。内部区域c DNA序列与5’RACE和3’RACE扩增的两端序列测序后拼接,得到了2698 bp的绵羊ARHGAP36 c DNA全长,其中包含一个长1593 bp的开放阅读框(ORF),编码530 aa,与Uni Prot中预测的牛ARHGAP36氨基酸序列(A7MB27)同源性为98%,说明我们克隆的c DNA是Rho GAP家族的成员ARHGAP36。对所克隆的绵羊ARHGAP36的氨基酸序列和Uni Prot数据库中所收集的所有其它ARHGAP成员的氨基酸序列比对分析显示,ARHGAP36没有其它ARHGAP成员都有的标志性"精氨酸指"基序,而它的对应基序中的保守精氨酸残基被苏氨酸替代了,暗示ARHGAP36很可能并不依靠酶催化活性发挥其功能。当把所克隆的c DNA与Gen Bank中发布的绵羊arhgap36序列比对时发现绵羊arhgap36基因组测序结果的第一个外显子中缺少一小段DNA,导致如果用该基因组序列预测绵羊ARHGAP36的c DNA,无法得到能编码正确氨基酸的c DNA,因此,实验为进一步研究ARHGAP36这个特殊ARHGAP成员的功能提供了正确的c DNA序列。绵羊睾丸总蛋白Western blot检测发现绵羊睾丸内的ARHGAP36有3种长度,免疫组织化学检测发现ARHGAP36蛋白在绵羊睾丸精细管中的精子发生过程中各类细胞中都有分布。     

黄鳝(Monopterus albus)P450(11β)基因cDNA的克隆和表达分析

11β-羟化酶(11β-hydroxylase)由P450(11β)(Cytochrome P450 11β-hydroxylase)基因编码,是一种重要的线粒体酶,指导合成11-羟睾酮,11-羟睾酮是合成硬骨鱼中最重要的雄性激素11-KT的前体物质,参与精子发生过程。本研究首先利用RT-PCR和RACE技术克隆了黄鳝(Monopterus albus)P450(11β)基因c DNA全长序列,然后利用生物信息学进行了分析,最后利用RT-PCR和荧光定量PCR方法对不同组织的表达情况进行了研究。结果显示:黄鳝P450(11β)基因c DNA全长为1 812 bp,开放阅读框1 632 bp共编码544个氨基酸氨基酸,5'非编码区(5'UTR)9个碱基,3'非编码区(3'UTR)168个碱基。黄鳝P450(11β)基因结构的保守性较高,具有细胞色素P450超家族基因的5个特征区域。氨基酸序列同源性分析表明黄鳝与其他鱼类的同源性在64%~76%之间,与舌齿鲈同源性最高为77%,但与人和老鼠的相似度仅为41.9%和37.7%。系统进化树分析以哺乳类为外群,黄鳝与点带石斑鱼、罗非鱼、舌齿鲈等聚为一大支。基因表达显示黄鳝P450(11β)基因在性腺和脑组织中表达,尤其在精巢中高表达,在卵巢中几乎检测不到。表明该基因对精子发生和精巢发育过程起着一定的作用。     

人赖氨酸乙酰基转移酶7结构域蛋白的原核表达及纯化

目的:克隆人赖氨酸乙酰基转移酶7(KAT7)的2个功能结构域基因,获得其原核表达产物,并纯化蛋白。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增人KAT7基因的2个功能结构域(1-330aa)和(331-611aa)编码片段,将其克隆到p ET28a载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达与纯化产物。结果:从人乳腺文库中分别扩增获得约990和840 bp的DNA片段,并克隆至p ET28a载体,测序结果表明与目的序列完全一致;在大肠杆菌Rossate中诱导表达出相对分子质量分别约为42 000和36 000的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白KAT7(1-330aa)和(331-611aa)。结论:获得了重组蛋白KAT7(1-330aa)和(331-611aa),为后续研究KAT7与肿瘤调控奠定了实验基础。     

黄鳝β-actin基因的克隆及其在鱼类中的系统发生分析

β-actin是actin家族的一员,在维持细胞结构,细胞内运动,细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用。克隆的黄鳝β-actin基因的cDNA全长1860bp,编码375个氨基酸,在脊椎动物中不同物种的β-actin基因之间的序列同源性超过了98％。RT-PCR表明克隆的黄鳝β-actin基因在睾丸、卵巢、心、肝、脾、脑等组织中广谱表达。基于目前已知的全部鱼类β-actin cds,构建了进化树。星形辐射的树型结构一致支持将鱼类β-actin基因划分为4类。到目前为止,所有的鱼都没有发现拥有全部4个β-actin基因。这暗示伴随着鱼类的辐射式进化历程,可能发生了种系特异性的β-actin的丢失。     

罗非鱼补体C3基因的克隆及其表达分析

[目的]获得罗非鱼补体C3并了解其在罗非鱼免疫前后各组织中的表达特征。[方法]通过PCR扩增获得补体C3片段,通过DNA Star、MEGA 6.06等分析其序列及理化特性;将经纯化获得的Scp B蛋白以5μg/g的剂量免疫罗非鱼,利用实时荧光定量PCR测定C3在各组鱼体的表达变化。[结果]补体C3基因c DNA序列6 994 bp,ORF全长5 361 bp,共编码1 786个氨基酸。其在罗非鱼肝脏中表达量最高,且免疫组肝脏中C3表达量在感染后4h时显著高于对照组(p0.05);此外,感染前(0 h)免疫组头肾和脾脏中C3表达量均显著低于对照组(p0.05),但在感染后4~12h,免疫组表达量均呈升高趋势,而对照组则呈降低趋势。[结论]抗原免疫可提高罗非鱼感染无乳链球菌后组织中补体C3的表达量,补体C3在罗非鱼抵御无乳链球菌感染过程中发挥重要作用。     

干扰素调控因子3：细胞抗病毒反应的核心转录因子

固有免疫系统是宿主抵御病毒入侵的第一道防线．Ⅰ型干扰素是关键的抗病毒细胞因子,它在细胞建立抗病毒状态的过程中发挥了核心的作用．Ⅰ型干扰素的诱导表达是固有免疫的重要调节与效应机制．已有的研究表明：多种转录因子(NF-kappa B、ATF-2/c-Jun、IRF3、IRF7)通过在Ⅰ型干扰素的转录调控区形成稳定的转录增强复合物(enhanceosome),迅速并大量地诱导Ⅰ型干扰素表达．体内与体外的生物学分析已确立,干扰素调控因子3 (IRF3)是介导细胞表达Ⅰ型干扰素最关键的转录因子,其转录活力与生物学功能直接影响细胞的抗病毒的能力．近年来,IRF3相关的细胞信号转导与调控机制等研究取得重大进展．围绕IRF3的结构、功能以及分子调控机制等方面,概述相关的研究进展,并做前沿展望．     

小白杏脂氧合酶基因PaLOX的克隆与序列分析北大核心

[目的]克隆小白杏(Prunus armeniaca)PaLOX基因全长并对其进行序列分析。[方法]根据已有的ESTs序列,设计3'和5'端RACE引物,利用RT-PCR和RACE技术克隆小白杏PaLOX基因c DNA全长。[结果]PaLOX c DNA全长序列为2 723 bp,含有一个1 002 bp的ORF开放阅读框,编码334个氨基酸,含有PLAT高度保守的特异结构域,预测蛋白质的相对分子质量为26.558 1 k Da,推测理化等电点为8.77,分子式为C1689H2635N459O490S13;该蛋白主要表现为亲水性,α-螺旋和延伸链则散布于整个蛋白质中,空间结构不稳定,无信号肽和跨膜结构,可能存在于线粒体中。进化分析表明,PaLOX氨基酸序列与梅、碧桃、苹果、梨、草莓等蔷薇科聚为一类,相似性依次为98%、99%、78%、77%、63%。[结论]获得了编码小白杏脂氧合酶的基因PaLOX全长序列,登录号为KM067451。