大肠杆菌表达托佩克猪SLA-1胞外区的研究

为构建托佩克猪SLA-1重链基因原核重组表达载体并研究其在pET-21a(+)中的表达,设计引物,PCR扩增托佩克猪SLA-1基因胞外区(命名为SLA-1-TPKe),并克隆至pMD19-T Simple Vector,经酶切鉴定后将SLA-1-TPKe基因与表达系统pET-21a(+)连接,转化到BL21(Rosseta)菌进行诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白。提取SLA-1-TPKe包涵体,并经SDSPAGE检测。PCR结果显示,SLA-1-TPKe大小为851 bp,成功克隆到pMD19-T Simple Vector,酶切鉴定大小为831 bp,连接到pET-21a(+)并转化到BL21(Rosseta)菌,经诱导表达和SDS-PAGE检测目的蛋白的大小为31 kD。目的蛋白以包涵体形式存在,纯化后蛋白纯度达到90%以上。     

托佩克猪SLA-2基因克隆及功能区生物信息学分析

为研究托佩克猪SLA-2基因功能,设计引物,克隆了该品系猪SLA-2基因(SLA-2-TPK)cDNA全长序列,并通过分子生物学软件分析其基因特征.结果显示,SLA-2-TPK cDNA全长为1 119 bp,其中3-1 097为编码区,共编码364个氨基酸,分别在第125、188、227和283位置出现半胱氨酸残基,含有两对链内二硫键.氨基酸同源性分析显示,SLA-2-TPK与其他SLA-2、SLA-3和SLA-1序列的同源率分别为86.0％-98.9％、85.0％-89.4％和84.2％-91.7％.系统进化树显示,SLA-2-TPK与韩国品系猪DQ883211遗传距离较近:各功能区分析,SLA-2-TPK与人HLA-A2和小鼠H-2K分子结构相似,且保留了人HLA-A2基因的部分功能位点.结果表明,SLA-2-TPK是典型的SLA-2等住基因,在进化程度上接近于部分韩国品系猪.     

地方三品系猪SLA-1原核表达载体构建及表达研究

目的:为研究我国地方三品系猪SLA-1原核表达。方法:选取3个国内地方品系猪荷包、烟台黑猪及莱芜黑猪的SLA-1等位基因,PCR扩增地方品系猪SLA-1胞外区基因,再将胞外区基因克隆至pMD19-T Simple Vector,阳性重组子经过酶切,然后连接至pET-21a载体,构建其原核表达载体,并转化宿主菌BL21进行诱导表达。结果:PCR结果显示三个品系猪SLA-1胞外区大小约840bp,经克隆后成功连接至pMD19-T Simple Vector,经酶切回收后插入片段又成功连接至pET-21a载体,并在BL21成功表达,表达蛋白大小约31 kDa,与设计值大小相符。蛋白表达量约5%。结论:该研究成功表达了我国三个地方品系猪SLA-1胞外区,为下一步研究其空间结构及功能奠定基础。     

MAGE-3原核表达载体的构建和表达

通过RT-PCR扩增957bp的MAGE-3全长编码序列,将该片段克隆至Pgex-4T-2原核表达载体,转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达,并经12%SDSPAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色及Western blot鉴定,证明了目的基因的有效表达,目的蛋白高达细菌总蛋白的32%。表达产物经Glutathione Sepharose 4B 纯化后,每100mL菌液最终可获得3mg的目的蛋白,蛋白纯度在90%以上。纯化的GST-MAGE-3蛋白在体外冲击树突状细胞,能诱导特异性CTL杀伤肿瘤细胞活性。     

人IL-3基因原核表达载体的构建及表达

目的：构建人IL-3基因原核表达载体pET32a-IL-3,并在大肠杆菌中诱导表达。方法：通过佛波酯（TPA）和植物球血凝素（PHA）刺激人T淋巴细胞系Jurkat细胞,增加IL-3mRNA表达水平,提取mRNA,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）获得cDNA,以Jurkat细胞cDNA为模板,通过PCR方法扩增得到人IL-3基因,将其克隆入原核表达载体pET32a（＋）中,将重组质粒转化入大肠杆菌宿主菌株BL21中,以异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白表达,并通过改变IPTG浓度,诱导时间,诱导温度等条件最终实现蛋白的可溶性表达。表达产物用SDS-PAGE检测表达情况。结果：酶切鉴定和测序结果证明成功构建了原核表达载体pET32a．IL-3。SDS-PAGE检测结果证明实现了人IL-3基因在大肠杆菌中的可溶性表达。结论：成功构建了人IL-3基因的原核表达载体并在大肠杆菌中获得了良好的表达。     

人IL-3基因原核表达载体的构建及表达

目的:构建人IL-3基因原核表达载体pET32a-IL-3,并在大肠杆菌中诱导表达。方法:通过佛波酯(TPA)和植物球血凝素(PHA)刺激人T淋巴细胞系Jurkat细胞,增加IL-3mRNA表达水平,提取mRNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得cDNA,以Jurkat细胞cDNA为模板,通过PCR方法扩增得到人IL-3基因,将其克隆入原核表达载体pET32a(+)中,将重组质粒转化入大肠杆菌宿主菌株BL21中,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,并通过改变IPTG浓度,诱导时间,诱导温度等条件最终实现蛋白的可溶性表达。表达产物用SDS-PAGE检测表达情况。结果:酶切鉴定和测序结果证明成功构建了原核表达载体pET32a-IL-3。SDS-PAGE检测结果证明实现了人IL-3基因在大肠杆菌中的可溶性表达。结论:成功构建了人IL-3基因的原核表达载体并在大肠杆菌中获得了良好的表达。     

荷包猪SLA-2-HB01真核表达载体的构建及在PK15细胞中的表达

为构建荷包猪SLA-2-HB01真核细胞表达载体,观察其在PK15细胞中的表达情况。首先参考SLA-2-HB01基因编码区序列设计了引物对,以SLA-2-HB01-pMD 18-T为模板PCR扩增获得SLA-2-HB01编码区基因片段,经TA克隆及菌落PCR筛选得到阳性克隆菌。测序正确后大量双酶切回收目的基因片段并与真核表达载体pEGFP N3相连接获得重组质粒SLA-2-HB01/pEGFP N3,重组质粒转化至大肠杆菌经大量克隆后,抽提阳性重组质粒并通过脂质体介导转染至PK15细胞,通过荧光显微镜观察转染后PK15细胞的荧光强度,进一步通过Western Blotting检测PK15细胞中SLA-2-HB01蛋白的表达情况。结果显示PCR成功扩增得到SLA-2-HB01,大小为1 104 bp,并成功构建重组质粒SLA-2-HB01/pEGFP N3,酶切鉴定证实插入片段大小为1 092 bp。SLA-2-HB01/pEGFP N3重组质粒转染PK15细胞后具有绿色荧光,Western Blotting显示SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白分子量大小为70 kD,与理论值相符。成功构建了SLA-2-HB01/pEGFP N3重组质粒,并初步确认SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白成功在PK15细胞中表达,为下一步进行SLA-2-HB01递呈多肽表位的研究奠定基础。     

原核和真核双表达载体的构建及功能分析

为了构建能驱动重组蛋白在真核及原核表达系统同时表达的双表达载体,该研究将T7启动子和T7终止子分别克隆到真核表达载体pIRES-EGFP启动子CMV下游和新霉素抗性基因上游,构建双表达载体pIRES-CMV/T7-EGFP,并进一步将增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)基因替换为人转铁蛋白(human transferrin,HTrf)基因,构建得到pIRES-CMV/T7-HTrf载体。将构建成功的重组载体转染中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞和转化大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli) BL21,再利用荧光显微镜、流式细胞术及Western blot分析重组蛋白是否表达及其表达水平。荧光显微镜观察、流式细胞仪分析及Western blot检测显示eGFP和HTrf既能在CHO细胞中成功表达,也能在大肠杆菌BL21中表达。该研究成功构建了在原核及真核表达系统中均可以表达重组蛋白的双表达载体。     

猪轮状病毒JL94株vp4全基因克隆及原核表达载体构建

根据GenBank已发表的猪轮状病毒vp4基因保守序列,设计一对引物扩增猪轮状病毒地方株JL94株vp4全基因;将扩增产物与载体pMD-18T连接进行序列测定并将测序结果同国外分离株进行序列比较。用限制性内切酶BamHI和SalI将vp4基因从pMD-18T-vp4切下;同样用BamHI和SalI双酶切表达载体pGEX-6P-1;将这2个双酶切产物连接并转化,通过酶切鉴定和PCR鉴定证明完成了vp4原核表达载体的构建。测序结果表明:vp4全基因长2362bp,JL94株同国外分离株BEN307株、Gottfried株vp4全基因片段核苷酸同源性分别为93.44%和69.43%;氨基酸同源性分别为96.06%和71.88%。说明JL94株同BEN-307株属同一VP4血清型,而同Gottfried株属于不同血清型。重组原核表达载体pGEX-6P1-vp4的构建为表达VP4蛋白,研制诊断性抗原和病毒重组活载体疫苗奠定了基础。     

玉米叶绿体表达载体的构建及AsRED基因原核表达

从玉米幼嫩叶片中提取玉米叶绿体基因DNA,通过PCR克隆出叶绿体同源重组片段trnA和trnI、叶绿体特异性启动子Prrn以及终止子psbA.构建玉米叶绿体表达载体pBAIRTARED,含有一个人工操纵子,其中,筛选标记基因aadA和红色荧光蛋白报告基因AsRED处于Prrn启动子和psbA终止子控制.将构建的载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,观测到重组细胞呈现红色,表明构建的载体可以用于玉米叶绿体转化以及表达报告基因.     

人TRAIL 基因原核表达载体的构建及鉴定

目的:克隆肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因片段(114～281氨基酸残基)并构建原核表达载体。方法:取健康人外周血提取总RNA,设计合成引物并引入EcoR I和Xho I酶切位点,RT-PCR扩增TRAIL基因的胞外区片段,克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆。结果:从外周血cDNA中扩增出501 bp的目的片段,测序结果证实成功构建重组质粒pGEX-6P-1/TRAIL。结论:成功构建TRAIL基因的原核表达载体pGEX-6P-1/TRAIL,为肿瘤细胞的凋亡研究提供理论依据。     

K-ras原核表达载体的构建及生物学功能研究

目的:构建带Myc标签的K-ras原核表达载体,并初步鉴定其生物学活性。方法:利用PCR技术从人乳腺文库中扩增人K-ras结构域的基因编码序列,插入载体p XJ-40得到重组质粒,经Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定后,Western印迹检测其在人293T细胞中的表达;利用GST pull down实验检测与Raf1-RBD的结合情况,验证其生物性活性。结果:用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到约570 bp的目的片段,插入载体p XJ-40后构建了Myc-K-ras重组质粒,并经酶切鉴定及测序证实无误;Myc-K-ras能在293T细胞中正确表达,并能与Raf1-RBD结合,具有生物学活性。结论:为进一步研究K-ras的生物学功能奠定了重要基础。     

薄荷GPPS基因原核表达及RNA干扰载体构建

利用薄荷挥发油合成途径关键酶之一的薄荷牻牛儿基焦磷酸合酶(GPPS)基因特异引物,扩增得到GPPS基因开放式阅读框(1 131 bp),并将其插入到原核表达载体pET-28a中,经酶切测序验证的重组质粒pET-28a-GPPS转入Rosetta(DE3),利用IPTG诱导表达融合蛋白。结果显示,终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导后6 h,SDS-PAGE显示薄荷GPPS基因在Rosetta(DE3)中获得高效表达。目前利用RNA干扰技术研究基因功能的方法已日趋成熟,以GPPS大亚基基因为靶目标,成功构建了薄荷GPPS大亚基基因的pBI121-RNAi-GPPS干扰载体。     

CD36原核表达载体的构建及生物信息学分析

[目的]对CD36基因进行体外克隆表达,建立CD36基因cDNA在大肠杆菌中表达的实验技术以及进行CD36蛋白三级结构的预测并利用生物信息学方法进行分析。[方法]以人血液RNA为模板,RT-PCR扩增CD36的基因序列;并构建原核表达质粒pET-32a-CD36转化到大肠杆菌DE3中后,经过IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE验证。[结果]成功克隆了人CD36基因并构建出原核表达质粒,成功转入表达菌大肠杆菌DE3中后经IPTG诱导成功表达,且在1 mmol/L的诱导剂浓度下培养6 h表达量最佳。利用Phyre2和Abcpred软件预测蛋白质结构和B细胞抗原表位,B细胞抗原表位评分大于0.85的CD36的B细胞抗原表位有8个。[结论]成功建立了人CD36基因的原核表达的实验技术,并对CD36的结构及B细胞抗原表位进行了预测,为后续研究CD36基因的功能和抗体制备提供方向和奠定基础。     

人TRAIL基因原核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）基因片段（114～281氨基酸残基）并构建原核表达载体。方法：取健康人外周血提取总RNA,设计合成引物并引入EcoR I和Xho I酶切位点,RT-PCR扩增TRAIL基因的胞外区片段,克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆。结果：从外周血cDNA中扩增出501 bp的目的片段,测序结果证实成功构建重组质粒pGEX-6P-1/TRAIL。结论：成功构建TRAIL基因的原核表达载体pGEX-6P-1/TRAIL,为肿瘤细胞的凋亡研究提供理论依据。     

GST-His双标签原核表达载体的构建及应用

目的：在原有带有GST标签的pGEX-KG载体上添加His标签,构建双标签原核表达载体,以提高纯化后的融合蛋白的纯度。方法：双酶切pGEX-KG载体,将同样带有双酶切位点编码His标签的DNA序列酶切后与其连接、转化大肠杆菌DH5α、鉴定阳性克隆并测序,并将编码雌激素受体B（ERβ）的片段构建到该载体上,分别利用GST标签和His标签对ERβ蛋白进行2次纯化。结果：构建了GST-His双标签原核表达载体,将ERβ编码片段克隆入该载体中,在原核生物中得到表达;分别用GST和His抗体进行Westernblot分析,均可检测到GST-His-ERβ融合蛋白的表达;利用此双标签载体纯化得到了纯度较高的ERβ蛋白。结论：GST-His双标签原核表达载体的构建对提高目的蛋白纯度具有重要意义。     

串联亲和纯化原核表达载体的构建

【目的】构建串联亲和纯化原核表达载体,用于研究细菌中(生理状态或接近生理条件下的)蛋白-蛋白相互作用。【方法】设计并合成两条串联亲和标签序列,分别可以在靶蛋白N端和C端融合Protein G和链亲和素结合肽(Streptavidin binding peptide,SBP)标签;以pUC18载体为骨架,去除原有的阻遏蛋白基因,构建组成型表达载体pNTAP和pCTAP。【结果】成功构建N端和C端标签表达载体pNTAP和pCTAP,它们在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)、肠出血性大肠杆菌O157:H7和痢疾杆菌福氏5型M90T菌株中都可以实现表达。【结论】本实验构建的两个串联亲和纯化表达载体可以在部分革兰氏阴性细菌中表达,为研究细菌内蛋白-蛋白相互作用及致病菌毒力蛋白的作用机制奠定了基础。     

pEASY-TAZ-5原核表达载体的构建及在大肠杆菌中表达

TAZ基因在心磷脂代谢异常导致线粒体功能障碍中起重要作用。本研究旨在构建人TAZ-5(h TAZ-5,Δ5)的基因工程菌,用乳糖诱导TAZ-5蛋白的表达,为后续h TAZ-5纯化、抗血清的制备及生理功能检测奠定基础。以h TAZ全长为材料,通过PCR方法扩增人h TAZ-5基因,将其插入到原核表达载体p EASY中。经菌落PCR筛选阳性克隆,并通过DNA测序确定原核表达载体p EASY-TAZ-5构建成功。将p EASY-TAZ-5转入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞Transetta(DE3)中,用乳糖诱导蛋白表达,分别对诱导剂浓度、时间、时机及温度等条件进行优化,确定最优的乳糖诱导条件,并对表达产物进行可溶性分析。结果表明PCR扩增出约786 bp的目的产物,与预期的片段长度一致;h TAZ-5蛋白最优表达条件为终浓度2.0 g/L乳糖、A600=0.8、37℃下诱导4 h,可以达到良好的诱导效果;收集菌体中的上清和沉淀,进行可溶性分析,目的蛋白以包涵体的形式存在。Western Blot分析表明重组蛋白TAZ表达成功。成功构建p EASY-TAZ-5原核表达载体,乳糖可诱导h TAZ-5(Δ5)基因表达,且效果很好。     

小鼠神经细胞粘附分子胞内段原核表达载体构建及表达

[目的]构建小鼠神经细胞粘附分子胞内段(NCAM ICD)原核表达载体,诱导蛋白表达,并进一步对蛋白进行纯化和鉴定。[方法]以小鼠脑c DNA文库为模板,采用PCR技术分别扩增NCAM跨膜亚型NCAM140及NCAM180的胞内片段,连接p JET1.2克隆载体。经DNA测序正确后,构建pET29b-NCAM140 ICD及pET29b-NCAM180 ICD原核表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导目的蛋白的表达,经Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化,以Western blot和质谱的方法鉴定表达的蛋白。[结果]成功构建了pET29b-NCAM140 ICD及pET29b-NCAM180 ICD原核表达质粒,并用Western blot及质谱法证实NCAM140 ICD及NCAM180 ICD蛋白的表达,分子量分别约为25 kDa及80 k Da。[结论]该方法成功构建小鼠pET29b-NCAM140 ICD及pET29b-NCAM180 ICD原核表达载体,实现了其蛋白表达,为进一步研究NCAM ICD的功能奠定了基础。     

人FGF21原核表达载体的构建及重组蛋白表达

构建人FGF21(fibroblast growth factor,FGF)cDNA的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。提取人肝脏总RNA后,经RT-PCR扩增获得目的片段,构建其T载体进行保存。再构建重组原核表达载体pET-28a(+)-h FGF21,重组质粒转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,在IPTG诱导下得到可溶性表达,采用亲和层析法纯化表达产物后,进行Western blot鉴定。成功构建重组质粒pET-28(+)-hFGF21,对其进行可溶性表达后成功纯化出his-hFGF21,经Western blot鉴定该融合蛋白可与FGF21抗体特异性结合。成功构建pET-28(+)-hFGF21,并可溶性表达his-hFGF21蛋白。