人类免疫缺陷病毒1型gp41结构与功能的研究进展

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)通过其包膜糖蛋白(Env)介导侵入靶细胞.Env由受体特异性结合单位gp120和膜融合单位gp41组成.HIV-1的gp41分为3个功能区:膜外区、跨膜区和膜内区.膜外区是病毒感染时膜融合的主要结构基础;跨膜区通过疏水残基使Env锚定在脂质膜上;膜内区则表现多重功能,参与病毒的感染、复...     

HIV-1 Env三聚体抗原改造研究进展

HIV-1疫苗研发是当前艾滋病研究的一大热点,其病毒表面包膜糖蛋白Env三聚体介导病毒与细胞融合,是HIV-1疫苗研究的重要靶点。因此,设计并在体外表达类天然Env三聚体对HIV-1疫苗的研发具有重要的意义。近年来,Env三聚体研究取得了显著的进展。SOSIP、NFL2P、UFO等抗原改造方法实现了类天然Env三聚体的体外表达,逐步解决了改造抗原产量低、结构不稳定等问题,且表达的Env三聚体抗原能在动物免疫中诱导机体产生较高的中和抗体水平。Env三聚体改造方法促进了HIV-1疫苗的研究。文中综述了SOSIP、NFL2P、UFO三种HIV-1 Env三聚体抗原改造方法,对比各个改造方法优缺点,并结合自身工作提出相关建议,为后续HIV-1抗原的相关设计提供指导。     

HIV包膜蛋白跨膜区的结构对疫苗设计的意义

人类免疫缺陷病毒(human immunodefi ciency virus,HIV)包膜蛋白(envelope protein,Env)是一个跨膜蛋白,其作用是介导病毒和细胞膜的融合,帮助病毒进入细胞。Env作为病毒粒子表面上的唯一抗原,是目前HIV疫苗设计的主要目标。近年来,关于这个包膜蛋白的胞外区的结构信息有很多研究报道,但是关于跨膜区(transmembrane domain,TMD)的结构机制还不清楚。我们利用最新建立的一整套高效的膜蛋白核磁技术,在类似磷脂膜的双分子Bicelle环境中,首次解析了HIV-1Env跨膜区的高分辨空间结构。结果表明,TMD形成有序的三聚体结构,保护埋在膜内保守的精氨酸残基。N-端卷曲螺旋和C-末端的亲水核心一起稳定这个三聚体,而后者可以在结构上连接到胞质区尾巴。生物学功能实验证明,一些氨基酸突变可以破坏TMD三聚体的稳定性,而这些突变也减弱了成熟Env对抗体的敏感性。也就是说,如果TMD不能形成稳定的三聚体,原本可以通过稳定Env三聚体而达到广泛中和病毒的抗体,也不能有效识别HIV-1Env抗原。因此,我们得出结论,Env的TMD对于维持整个Env的天然构象稳定性非常重要。也许可以通过考虑TMD对Env胞外区影响的分子机理,为针对艾滋病病毒的疫苗设计提供新的思路。     

人类免疫缺陷病毒1型gp140包膜蛋白三聚体在哺乳动物细胞中的高效表达及其性质鉴定

本研究目的是通过优化1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)gp140编码基因的密码子和克隆设计,从而实现在293T哺乳动物细胞中高效表达,并对纯化获得的gp140蛋白进行抗原性质鉴定。在本研究中选择HIV-1B亚型NL4-3全基因序列为模板进行gp140克隆构建,通过密码子优化、信号肽替换、增加柔性linker、三聚体折叠序列等方法优化设计。通过HIV-1转录反式激活因子tat共转HEK293T细胞进行gp140蛋白表达,采用镍柱纯化。SDS-PAGE、Western blot、ELISA、负染电镜等结果显示目的蛋白纯度高于70%,每升培养基可获得0.5mg gp140蛋白,并且具有良好的抗原活性,电镜下呈现三聚体结构。通过弗氏佐剂与目的蛋白混合免疫Balb/c小鼠,检测小鼠免疫血清显示gp140蛋白能有效刺激机体产生免疫应答。本研究通过优化表达获得B亚型HIV-1NL4-3gp140蛋白,为HIV-1病毒包膜蛋白结构和重组疫苗研究奠定基础。     

利用细胞筛选法从噬菌体抗体库鉴定人源HIV-1单克隆中和抗体

以细胞法从HIV-1CRF07_BC特异性噬菌体抗体库中筛选和鉴定针对病毒包膜蛋白(Envelope,Env)的人源单克隆中和抗体。将pCH064.2-Env质粒转染293T细胞,以表达Env的活细胞淘洗噬菌体抗体库;利用细胞ELISA方法筛选Env特异性噬菌体阳性克隆,并测定抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列;以Ni+2-NTA层析柱纯化抗体Fab,SDS-PAGE分析抗体纯度;采用基于转染细胞和重组蛋白的ELISA以及流式细胞技术分析抗体的结合活性;以HIV-1假病毒系统评价抗体的中和活性。四轮淘洗使细胞特异性噬菌体得到约650倍的高度富集,细胞ELISA筛选到28个抗HIV Env的阳性克隆,序列分析发现五个具有不同VH和VL序列的抗体Fab(2801、2837、2863、2870和2920)。这些抗体与转染env的293T细胞反应,但不与重组表达的可溶性gp120蛋白反应,说明它们有可能针对依赖于Env复合物的空间构象表位。我们发现2801、2863和2870三个Fab抗体对HIV-1CRF07_BC亚型CH120.6毒株具有较强的中和活性,其IC50值分别为2.24μg/mL、0.89μg/mL和3.09μg/mL。其中,2801和2863对B亚型HIV-1毒株SF162具有较强的交叉中和作用,其IC50值分别为0.69μg/mL和3.52μg/mL。提示表达于293T细胞表面的HIV-1 Env可以有效富集和筛选噬菌体抗体库,并能成功分离和鉴定依赖于Env空间构象表位的HIV-1中和抗体。因此本研究为探讨HIV-1中和抗体的反应机制和研发艾滋病疫苗提供了新的技术平台。     

HIV-1 gp41 NC六螺旋的结构与功能研究

AIDS是严重危害人类健康的疾病,而HIV是导致这种疾病的病毒。gp41六螺旋在介导HIV-1病毒与靶细胞间的膜融合过程中起着重要作用。因此,对于gp41结合蛋白的研究有助于深入了解gp41在HIV-1感染整个过程中扮演的角色,解释gp41对靶细胞的调控机制,为寻找新的抗艾滋病药物靶点以及艾滋病抑制剂的设计提供有益的思路。作者的实验室相继发现了一批与gp41六螺旋结构相互作用的蛋白质,进而对HIV-1 gp41六螺旋介导的膜融合过程和HIV-1感染机理有了更深入的了解。     

共同受体CCR5与HIV gp120的相互作用及相关肽类抑制剂

存在于巨嗜细胞、树突状细胞等胞膜上的G蛋白偶联受体CCR5作为R5嗜性的HIV-1病毒的主要共同受体,可以和病毒的表面糖蛋白gp120相互作用,并由此决定了病毒的另一表面糖蛋白gp41融合构象的形成以及随后的病毒与细胞的膜融合。CCR5在细胞膜上迅速移动,并与其他分子(如CD4和胆固醇)存在相互作用,加速了与gp120的作用。CCR5的这种中心作用已经使其成为抗HIV-1药物研究的很有吸引力的靶点。目前已发现一系列衍生于CCR5的胞外区的多肽、天然存在的蛋白质以及设计的多肽,可干扰CCR5与gp120之间的相互作用,从而抑制病毒复制。     

HIV-1 CRF07 B/C亚型gp41的表达、纯化和初步结构分析

HIV-1跨膜蛋白gp41是HIV-1包膜与靶细胞膜融合过程中的关键蛋白,而且序列保守,是理想的HIV-1作用靶点。为获得HIV-1中国流行株CRF07 B/C gp41蛋白的晶体结构来指导疫苗设计及药物开发,采用CRF07 B/C gp160基因序列为模板,经PCR、酶切、连接,将gp41 helix-bundle区域克隆到pET30-his表达载体中,经表达、纯化和结晶筛选,获得了gp41 helix-bundle的晶体并解析了结构,为针对中国艾滋病病毒流行株疫苗的设计及药物开发提供了结构参考。     

表达HIV-1 CRF01＿AE亚型结构基因小鼠模型的建立和鉴定

目的:构建并鉴定表达HIV-1 CRF01_AE亚型结构基因的小鼠模型。方法:使用哺乳动物密码子优化的HIV-1 CRF01_AE gp160基因,通过慢病毒包装系统构建重组慢病毒LV-GFP-AE gp160,将上述重组慢病毒感染小鼠肺上皮细胞TC-1,经嘌呤霉素抗性筛选获得稳定表达gp160基因的TC-1细胞。采用RT-PCR、流式细胞术检测gp160基因在细胞内的表达稳定性,将稳定表达Gp160蛋白的TC-1-HIV AE gp160细胞接种小鼠,用免疫组化方法检测小鼠体内细胞团块中HIV Gp160蛋白的表达。结果:菌落PCR、酶切鉴定和测序表明重组质粒pLVX-AE gp160构建正确,RT-PCR、GFP荧光及流式细胞术结果均显示gp160基因能在细胞TC-1中稳定表达,免疫组化结果也表明小鼠体内接种的细胞可以稳定表达HIV Gp160蛋白。结论:建立了稳定表达HIV-1 CRF01_AE亚型Gp160蛋白的TC-1细胞及小鼠模型,为HIV-1 CRF01_AE亚型HIV疫苗的临床前研究提供了可靠的体外、体内免疫原性评价工具,为该疫苗的进一步开发奠定了坚实的实验基础。     

一种拮抗HIV-1并靶向DC的融合基因的设计及表达鉴定

艾滋病病毒 (Human immunodeficiency virus,HIV) 通过与靶细胞膜的融合感染宿主细胞,研究表明阻断HIV与受体靶分子的结合可以阻止HIV进入宿主细胞,抑制HIV病毒的感染。设计合成了一个包含CD4和CCR5与HIV-1结合的主要功能结构区,及Flt3-L和Mip-3α分子的融合基因,构建了2个融合基因的真核表达载体pABK-CKR5-CD4/Flt3L-Mip3α (pABK-HIV-MF) 和pABK-CKR5-CD4 (pABK-HIV-MT),在人胚肾293细胞中进行了表达。RT-PCR、细胞免疫荧光技术、ELISA和Western blotting检测结果表明融合基因在真核细胞中获得了正确的表达,这为进一步研究其对于HIV-1的拮抗并靶向树突状细胞 (DC) 清除研究奠定了基础。     

多肽作为HIV-1与胞膜融合抑制剂的研究进展

艾滋病已在世界范围内给人类健康和社会发展带来了严重影响.抑制HIV-1与细胞膜融合的多肽抑制剂由于其分子量小、结构简单、生物毒性低和作用效果明显等优点而受到研究者的重视.针对HIV-1与细胞的融合过程中涉及gp160的分裂、gp120与CD4受体及辅助受体的结合、gp41自身的折叠及与细胞膜的并列与融合等步骤,可以设计一些新的多肽药物靶点,以达到阻止HIV-1侵入的目的.目前针对上述三步骤已分别设计出了相应的多肽抑制剂,如M3、HRPs、CD4M、S肽、DAPTA及C22等,这些多肽抑制剂在体外实验、动物实验或临床实验中均表现出较好的抑制HIV-1与细胞融合的能力,具有十分巨大的潜在应用前景.     

可溶性重组CD4(rCD4)对HIV-1感染单核细胞和巨噬细胞的作用

<正>CD_4糖蛋白已被识别系人免疫缺陷病毒(HIV)的细胞受体。HIV与CD_4受体的结合是通过病毒表面糖蛋白gp120所介导的,该步骤不仅引发细胞水平病毒感染,而且也能导致部分HIV的细胞病变特征。尽管HIV-1分离物间具有无数的株间差异,HIV-1和HIV-2的,基因组亦存在着差异,但在感染过程中,外膜糖蛋白与CD4受体的结合却表现出高度保守的机理,这可能是医学界的一个课题。     

一例艾滋病痴呆综合征病人HIV-1 gp120基因多样性及生物学活性位点分析

为探讨人类免疫缺陷病毒1型HIV-1 gp120基因多样性和生物学活性位点与艾滋病痴呆综合征之间的关系,从一例艾滋病痴呆综合征病例尸检标本的淋巴结和中枢神经组织(大脑5个部位:颞叶灰/白质连接处、脑室周围组织、脉络丛、枕叶白质及枕叶灰/白质连接处)提取不同组织来源的基因组DNA,经PCR法扩增HIV-1 gp120基因,经克隆后挑选阳性克隆菌株,对插入片段进行测序。用生物学软件处理并绘制系统发生树,分析糖基化位点,计算ds/dn值,分析V3顶端四肽及关键位点的氨基酸。结果显示,该病人感染的病毒是HIV-1B亚型;分离自不同组织的HIV-1 gp120基因存在差异;与标准序列相比,分离自该病人的HIV-1 gp120基因的部分生物学活性位点存在改变,且源自外周淋巴组织与中枢神经组织的HIV-1 gp120基因中部分生物学活性位点也存在差异。结果表明,HIV-1 gp120基因多样性及与脑组织相关的某些生物学活性位点的改变可能与艾滋病痴呆综合征的发病机制存在一定关系。     

HIV-1限制因子及其基因多态性

HIV-1是造成世界艾滋病大流行的主要病毒,其在细胞中的复制过程大体分为:吸附,膜融合,脱衣壳,逆转录,入核,整合,转录翻译,病毒包装及出膜。针对这些过程,宿主细胞进化出各种细胞限制因子来限制HIV-1感染细胞。本文简要介绍TRIM5α、APOBEC3G和束缚蛋白(tetherin)等3个细胞限制因子及其基因多态性。     

分子内二硫键对HERV囊膜蛋白融合核心结构的影响

合胞素(Syncytin)是一类由人俘获的逆转录病毒囊膜蛋白,与胎盘的形态发生中细胞滋养层到合胞滋养层的分化过程十分相关。Syncytin与人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)囊膜蛋白(Env)在结构上具有相似的特点,二者可能具有相似的膜融合机制。本文通过PCR对融合核心部位七肽重复区HR1和HR2之间linker中自然存在的一对保守的分子内二硫键进行定点突变,表达纯化该突变蛋白,并进行了相应的结构及稳定性探讨,通过与未突变蛋白的性质比较确证该分子内二硫键在蛋白结构的正确形成及稳定性上起着一定的作用。     

分子内二硫键对HERV囊膜蛋白融合核心结构的影响

合胞素(Syncytin)是一类由人俘获的逆转录病毒囊膜蛋白,与胎盘的形态发生中细胞滋养层到合胞滋养层的分化过程十分相关.Syncytin 与人免疫缺陷病毒I型(HIV-1) 囊膜蛋白(Env)在结构上具有相似的特点,二者可能具有相似的膜融合机制.本文通过PCR对融合核心部位七肽重复区HR1和HR2之间linker中自然存在的一对保守的分子内二硫键进行定点突变,表达纯化该突变蛋白,并进行了相应的结构及稳定性探讨,通过与未突变蛋白的性质比较确证该分子内二硫键在蛋白结构的正确形成及稳定性上起着一定的作用.     

生物信息大分子结构修饰对其功能的影响——酵母甘露聚糖硫酸酯化衍生物的制备及其对HIV-1细胞生长抑制效应的初步研究

研究由安徽大学ADF实验室以拟规模化环保型循环工艺生产流程分离、提取、纯化制得的生物多糖-酵母甘露聚糖(Yeast Mannan,简称Man),在对其结构、性质和生物活性研究的基础上,进一步对其结构进行硫酸酯化修饰,制得新产品硫酸酯化酵母甘露聚糖(Man-Sulfated),并探索Man、Man-Sulfated对HIV-1病毒细胞生长的抑制作用。研究结果表明:1)Man对宿主细胞C8166无毒性;2)实验用HIV-1病毒细胞对宿主细胞C8166有毒性,TCID50为1.1×10~6Cells/m L;3)用氯磺酸∶吡啶(2∶1)甲酰胺法制得的Man-Sulfated对宿主细胞C8166也无毒性,并具有抑制HIV-1病毒细胞生长的功能,而Man则无此新功能;4)Man-Sulfated具有抑制HIV-1生长的效能,其与硫酸酯化修饰Man结构时使用的硫酸酯化试剂类别、方法及反应条件的不同,而引起对Man结构、构象的修饰变化程度不同密切相关。浓硫酸酯化法对Man结构修饰太强烈,构象变化过大,影响其生物功能。     

不同宿主H1N1病毒血凝素蛋白(HA)受体结合位点的变异特征

2009年全球性爆发的H1N1病毒已经导致213个国家和地区受到感染, 有16 226人死亡。病毒与宿主细胞表面受体的结合是病毒感染不可缺少的第一步, 从而导致病毒膜与宿主细胞膜的融合。血凝素(Hemagglutinin, HA)就是介导这种受体结合与膜融合的病毒蛋白, 受体结合位点(Receptor binding sites, RBSs)位于HA蛋白三聚体中每个单体的球形头部, 主要由190位螺旋(190~198aa)、130位环(135~138aa)和220位环(221~228)3个二级结构域组成。文章收集了1918~2009年间1 221株H1N1病毒株的HA1序列(长度为327个氨基酸残基), 通过序列比对、各位点氨基酸残基的熵值以及3D结构模拟等生物信息学研究。结果显示不同宿主的不同病毒RBSs具有不同的熵值, 而且不同宿主的病毒HA1其RBSs具有不同的优势序列。3D结构模拟也显示了H1N1不同HA1之间在190位螺旋构象上的细微差异。该研究揭示了不同HA1上RBSs的一些新的特征, 为进一步探讨病毒感染的机理提供了新的信息     

上海设施核磁系统用户在HIV-1病毒包膜刺突蛋白质的跨膜区结构研究取得进展

正2016年6月24日,Science在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所国家蛋白质科学中心(上海)周界文研究组与哈佛医学院Bing Chen博士研究团队的合作研究论文"Structural Basis for Membrane Anchoring of HIV-1Envelope Spike"。该研究采用液体核磁共振技术首次揭示了HIV病毒包膜刺突(HIV-1 Envelope Spike)跨膜区域的精细三维结构,首次在原子水平上展示了跨膜结构区域是如何锚定、稳定和调控HIV病毒包膜刺突三聚体的分子机理,为针对艾滋     

HIV-1 C亚型密码子优化gp120基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建含有HIV-1C亚型gp120基因重组腺病毒载体,并在293细胞中表达gp120蛋白。方法PCR扩增,获得HIV-1C亚型gp120片段,定向克隆人腺病毒转移载体pTrack-CMV,线性化后转化至含有腺病毒骨架载体pAd-easy-1的大肠埃希菌BJ5183,获得重组子prAd—gp120,PacI酶切纯化后转染293细胞,包装成复制缺陷型重组腺病毒vAd—gp120。结果经PCR、酶切及DNA测序,插入片段大小、方向正确,获得了具有感染力的vAd—gp120重组腺病毒;通过Western印迹检测,重组腺病毒在293细胞中表达出分子量为120kD的蛋白。结论成功构建了含有HIV-1C亚型gp120基因重组腺病毒载体,并获得该基因的表达。