孟氏隐唇瓢虫细胞色素P450基因的克隆与序列分析

采用同源克隆和RACE技术,从孟氏隐唇瓢虫Cryptolaemus montrouzieri Mulsant中克隆到细胞色素P450CYP9Z401基因的c DNA全序列(Gen Bank number:KP164813)。c DNA全长1722 bp,包含3'非编码区域(UTR)为86 bp和5'UTR为49 bp,开放阅读框(ORF)长1587 bp,编码528个氨基酸。预测的分子量为61.27 k D,理论等电点为6.58,无信号肽结构,在2-20氨基酸处存在跨膜螺旋。该基因拥有细胞色素P450特征序列螺旋C、螺旋K和Meander区域,另外还有血红素结合区(1个氨基酸差异)和螺旋I区(2个氨基酸差异)。与其他昆虫的CYP9家族基因比较,与赤拟谷盗Tribolium castaneum同源性最高,为47%,系统发育分析也表明两者的亲缘关系最近。CYP9Z401基因的克隆和比较分析为进一步深入研究孟氏隐唇瓢虫的细胞色素P450基因功能及其进化具有重要意义。     

天祝白牦牛IGF-2基因的cDNA克隆

旨在克隆天祝白牦牛胰岛素样生长因子2(IGF-2)基因编码区全长cDNA序列,为研究该基因的生理功能奠定基础。运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA序列。扩增获得天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA序列为1 060 bp(GenBank登录号:KF682139),ORF长540 bp,编码179个氨基酸。其编码的氨基酸与已报道哺乳动物IGF-2氨基酸序列同源性在80%-92%之间。天祝白牦牛IGF-2基因的成功克隆为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

沙冬青CBF/DREB1转录因子cDNA的克隆及序列分析

CBF/DREB1(C-repeat binding factor/dehydration resistance element binding protein 1)是一类抗逆相关的转录因子,它们的表达可以激活下游一系列抗逆应答基因的表达,从而提高植株的抗逆性.沙冬青(A mmopiptanthus mongolicus)主要生长在中国西北荒漠和半荒漠地带,是典型的旱生资源植物,具有突出的抗寒、抗旱、耐盐碱特性.本文以沙冬青为实验材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆了沙冬青CBF/DREB1基因cDNA序列,并对其进行了序列分析.结果表明:沙冬青CBF/DREB1转录因子基因序列全长为991 bp,包括624 bp的开放阅读框(ORF),起始密码子ATG,终止密码子TAA,114 bp的5UTR和253 bp的3UTR,以及加尾信号AATAAA及poly(A)_(11).生物信息学预测其演绎的氨基酸序列具有AP2结构域,且AP2结构域的两端拥有CBF家族特有的PKK/PPAGRxKFxETRHP和DSAWR两段短多肽序列,属于CBF家族.沙冬青CBF/DREB1转录因子的克隆为进一步研究植物抗逆和获得抗性基因提供了新的候选基因,也为进一步从分子水平上验证其功能,深入理解植物适应干旱、低温和高盐机制奠定基础.     

红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)干扰素调节因子2基因的克隆及原核表达

干扰素调节因子(Interferon regulatory factor,IRF)是一种多功能的转录因子。采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了红鳍东方鲀干扰素调节因子2(Interferon regulatory factor 2,IRF2)基因的全长c DNA。该基因全长为1 552 bp,其中5'非编码区(5'-UTR)187 bp,3'非编码区(3'-UTR)429 bp,编码区(CDS)为936 bp,共编码311个氨基酸。将IRF2的编码区序列连接到原核表达载体p ET32a(+),成功构建了重组体p ET32a(+)-IRF2。将重组体p ET32a(+)-IRF2转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,获得了重组表达IRF2的基因工程菌。经IPTG诱导,p ET32a(+)-IRF2在BL21中得到了融合表达。通过对表达产物的纯化和Western blotting检测,结果显示红鳍东方鲀IRF2基因在大肠杆菌中的表达效果较高,目的蛋白准确。     

马氏珠母贝STA RDL3基因的克隆与表达性分析

采用RACE技术克隆获得马氏珠母贝STARDL3基因c DNA全长序列(Pm-STARDL3);利用荧光定量技术检测Pm-STARDL3基因在各个组织中的表达量。结果表明,Pm-STARDL3基因c DNA序列全长3 655 bp,开放阅读框(ORF)长1 491 bp,编码496个氨基酸,5'非翻译区(5'UTR)长110 bp,3'UTR长2 054 bp。PmSTARDL3氨基酸序列同源比对分析显示与华贵类栉孔扇贝(Mimachlamys nobilis)STARDL3的序列的相似度最高。SMART软件分析得出,Pm-STARDL3有STARD类蛋白特有的结构域。荧光定量PCR检测结果表明Pm-STARDL3在肝胰腺中表达量最高,其后依次是外套膜、鳃与闭壳肌,各组织的表达量差异具统计学意义(p0.05)。     

小白杏脂氧合酶基因PaLOX的克隆与序列分析北大核心

[目的]克隆小白杏(Prunus armeniaca)PaLOX基因全长并对其进行序列分析。[方法]根据已有的ESTs序列,设计3'和5'端RACE引物,利用RT-PCR和RACE技术克隆小白杏PaLOX基因c DNA全长。[结果]PaLOX c DNA全长序列为2 723 bp,含有一个1 002 bp的ORF开放阅读框,编码334个氨基酸,含有PLAT高度保守的特异结构域,预测蛋白质的相对分子质量为26.558 1 k Da,推测理化等电点为8.77,分子式为C1689H2635N459O490S13;该蛋白主要表现为亲水性,α-螺旋和延伸链则散布于整个蛋白质中,空间结构不稳定,无信号肽和跨膜结构,可能存在于线粒体中。进化分析表明,PaLOX氨基酸序列与梅、碧桃、苹果、梨、草莓等蔷薇科聚为一类,相似性依次为98%、99%、78%、77%、63%。[结论]获得了编码小白杏脂氧合酶的基因PaLOX全长序列,登录号为KM067451。     

蒙古沙冬青AmDREB2C基因的克隆及表达分析

蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是中国西北荒漠区唯一的常绿阔叶灌木,具有很强的抗寒抗旱特性。利用PCR方法从该植物克隆到转录因子Am DREB2C的c DNA和基因组DNA的全长编码区,二者均由1191 bp组成,无内含子序列,编码由396个氨基酸残基组成的蛋白,其中含1个AP2结构域和1个核定位信号。表达分析显示,Am DREB2C的转录受低温和干旱胁迫的诱导。此外,将该基因编码区c DNA成功构建到植物表达载体p CAMBIA3300-35ST上,为后续研究其功能奠定了基础。     

血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)漆酶基因的克隆与序列分析

为克隆血红密孔菌 (Pycnoporussanguineus)漆酶基因 ,根据真菌漆酶氨基酸序列保守区设计了 1对简并引物 .以血红密孔菌基因组DNA为模板 ,PCR扩增出长 12 2 7bp的漆酶基因片段 .以此序列为基础 ,通过 5′及 3′RACE技术克隆出漆酶全长cDNA序列 ,序列长为 190 2bp ,其 5′端和 3′端非编码区长分别为 5 1bp和 2 97bp ,开放阅读框长 15 5 4bp ,编码 5 18个氨基酸的蛋白 .该蛋白具有 4个铜离子结合区域 ,预测其相对分子量为 5 6 313 2 ,等电点为 5 5 9,其氨基酸序列与Pycnoporuscinnabarinus漆酶 (lcc3 2 )的同源性最高 ,为 96 % .以该cDNA编码区的两端序列为引物 ,PCR扩增得到漆酶的长度为 2 15 4bp的全长DNA序列 ,序列中包括 10个内含子序列 ,长为 5 2～ 70bp     

小白杏脂氧合酶基因PaLOX的克隆与序列分析

[目的]克隆小白杏(Prunus armeniaca)PaLOX基因全长并对其进行序列分析。[方法]根据已有的ESTs序列,设计3'和5'端RACE引物,利用RT-PCR和RACE技术克隆小白杏PaLOX基因c DNA全长。[结果]PaLOX c DNA全长序列为2 723 bp,含有一个1 002 bp的ORF开放阅读框,编码334个氨基酸,含有PLAT高度保守的特异结构域,预测蛋白质的相对分子质量为26.558 1 k Da,推测理化等电点为8.77,分子式为C1689H2635N459O490S13;该蛋白主要表现为亲水性,α-螺旋和延伸链则散布于整个蛋白质中,空间结构不稳定,无信号肽和跨膜结构,可能存在于线粒体中。进化分析表明,PaLOX氨基酸序列与梅、碧桃、苹果、梨、草莓等蔷薇科聚为一类,相似性依次为98%、99%、78%、77%、63%。[结论]获得了编码小白杏脂氧合酶的基因PaLOX全长序列,登录号为KM067451。     

球毛壳菌（Chaetomium globosum）过氧化物膜蛋白过敏原基因克隆、序列分析及原核表达

以球毛壳菌cDNA文库中获得过氧化物膜蛋白（pero）基因片段（GenBank Accn:BP099709）为基础,用RACE 技术获得该基因的全长cDNA序列。序列长747bp,由412bp的3′RACE产物和508bp的5′RACE产物拼接而成。开放阅读框501bp,编码166个氨基酸,蛋白分子量为17.5kD,理论等电点为5.75。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA序列,序列分析表明该基因由2个内含子和3个外显子组成。ClustalX多序列比对表明：该基因与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的过氧化物膜蛋白过敏原同源性最高（83%）。将pero基因编码区克隆到原核表达载体pET28a中,构建成表达质粒pET28a-pero并转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况,结果发现在21kD处有一特异性融合蛋白带,大小与预期相符,说明该基因已经在大肠杆菌中表达。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY555771,AY584753,AAS66898)。     

珊瑚藻R-藻红蛋白γ亚基基因的克隆

根据珊瑚藻(Corallina afficinalis L.)R-藻红蛋白γ亚基N末端部分氨基酸序列(P83592)设计简并引物,结合RACE方法,扩增获得g亚基的全长cDNA序列.结果表明,序列全长为2 308 bp(AY209894),5'非编码区长1 203bp,3'非编码区长145 bp,编码区长960 bp,编码320个氨基酸组成的前体,包含71个氨基酸构成的信号肽和249个氨基酸组成的成熟蛋白.成熟蛋白序列内部存在重复序列与前人的报道一致.珊瑚藻亚基cDNA序列不同克隆子的测序结果表明,g亚基cDNA序列存在不同的3'末端,说明该基因可能存在多个拷贝或存在转录后加工.此外,扩增获得g亚基DNA序列(AY308999),比较表明编码区内部没有内含子存在.本文是对珊瑚藻R-藻红蛋白g亚基基因序列的首次报道.     

麻竹miR172a靶基因DlAP2的克隆及其表达

为了解开花麻竹(Dendrocalamus latiflorus)的Dl AP2基因功能,采用RT-PCR和RACE技术克隆了mi R172a靶基因AP2同源序列c DNA全长,命名为Dl AP2。结果表明,Dl AP2基因c DNA全长为1729 bp,包含5′端非编码区81 bp、开放阅读框1464 bp、3′端非编码区160 bp和24个碱基的Poly A尾巴,在编码框靠近3′端130 bp处有1个高度匹配mi R172a的结合位点(CTGCAGCATCATCAGGATTCT)。Dl AP2编码487个氨基酸的蛋白,具有两个AP2结构域,属于AP2/ERF家族AP2亚家族的AP2组,与来自其它单子叶植物的AP2蛋白均有较高同源性。RLM-5′RACE分析表明,mi R172a主要在靶序列的第11~12个碱基之间剪切靶基因Dl AP2的mi RNA。q RT-PCR结果表明,麻竹花芽中Dl AP2基因的表达规律与mi R172a表达变化正好相反,证明mi R172a对Dl AP2基因的表达具有调控作用。     

朱砂叶螨几丁质合成酶基因1全长cDNA的克隆与表达分析

【目的】克隆朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus几丁质合成过程中的关键酶几丁质合成酶基因,并检测该基因在朱砂叶螨生长发育不同阶段的相对表达量。【方法】本研究采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及c DNA末端快速扩增(RACE)技术首次克隆获得朱砂叶螨几丁质合成酶基因1的全长c DNA序列(命名为Tc CHS1,Gen Bank登录号为KM242062),并使用实时荧光定量PCR技术首次检测了Tc CHS1基因在朱砂叶螨生长发育不同阶段的相对表达量。【结果】朱砂叶螨Tc CHS1基因的c DNA全长为4 881 bp,包括198 bp的5'非翻译区(5'-UTR),4 425 bp的开放阅读框(ORF),258 bp的3'非翻译区(3'-UTR),开放阅读框编码1 474个氨基酸,预测其蛋白质分子质量约为168.35 ku,理论等电点为6.26。其包含EDR和QRRRW这2个几丁质合成酶基因的标签序列。氨基酸序列同源性分析结果表明:Tc CHS1与其他昆虫该基因编码蛋白的氨基酸序列相似度在50%左右,与二斑叶螨Tetranychus urticae的氨基酸相似度最高(98%),与西方盲走螨Metaseiulus occidentalis的相似度为55%。分子系统进化的结果也表明Tc CHS1与其他昆虫的CHS1聚在一起,并且和二斑叶螨具有最近的亲缘关系。荧光定量分析表明Tc CHS1基因在朱砂叶螨生长发育的不同阶段(卵、幼螨、第1若螨、第2若螨、雌成螨和雄成螨)均有表达,在卵和雌成螨中的表达量较高,在第2若螨的表达量最低。【结论】Tc CHS1基因可能在朱砂叶螨生长发育过程中具有重要作用。     

紫杆柽柳与其它物种脂质转运蛋白基因编码蛋白的同源性比较

根据从柽柳cDNA文库克隆获得的脂质转运蛋白(LTP)的部分序列,用RACE技术克隆出其全长cDNA序列.基因的5'非翻译区96bp,3'非翻译区222bp,开放阅读框285bp,编码94个氨基酸,预计蛋白的分子量为9.9 kD,等电点为8.02.此基因有8个位置保守的Cys残基及26个氨基酸的信号肽,为典型的植物脂质转运蛋白基因.其基因序列数据库(GenBank)登录号为AY574218(基因)和AAS79106(蛋白).     

西伯利亚蓼硫堇基因的克隆和序列分析

根据西伯利亚蓼抑制消减文库(SSH)中获得的硫堇(THI)基因的部分序列,应用RACE技术克隆了具有PolyA的全长cDNA序列。基因全长789bp,5'非翻译区90bp,3'非翻译区276bp,开放阅读框编码140个氨基酸。序列分析表明,该编码蛋白与大多数植物THI蛋白前体高度相似,N端具24个氨基酸的信号肽,中间46个氨基酸为成熟THI部分,C端的70个氨基酸为酸性多肽部分。西伯利亚蓼THI蛋白与丹参等双子叶植物THI蛋白有较高的同源性,具保守的植物THI标签序列C-C-X(5)-R-X(2)-[FY]-X(2)-C。此成熟THI蛋白带正电荷,偏碱性,推定可能具有抗病原微生物活性,为一种新的植物THI蛋白,GenBank登录号为DQ981482。     

粘虫核糖体蛋白S7 cDNA的克隆和表达分析

运用RT-PCR和RACE技术克隆了粘虫Mythimna separata(Walker)核糖体蛋白S7基因(RPS7)的全长cDNA序列(GenBank登录号:JN582331),并对其进行生物信息学分析。结果表明,粘虫RPS7全长cDNA序列为762 bp,包括5'非编码区32 bp和3'非编码区67 bp。其开放阅读框(573 bp)编码190氨基酸肽链,具有核糖蛋白S7e蛋白家族典型特征。该肽链理论分子量为21.924 ku,等电点为9.82,富含4种类型的特定功能位点。该蛋白序列与其他动物RPS蛋白序列具有96.8%～98.2%高度同源性。应用荧光实时定量技术建立了粘虫脑部胚后发育RPS7表达模式。RPS7表达量随胚后发育脑部重建呈现出动态变化,这一结果显示RPS7是在转录水平上呈现发育性调节。     

大黄鱼CYP1A基因cDNA的克隆与表达分析

由于外源化合物能诱导鱼类CYPIA(P4501A)的表达,因而它广泛被用作评价水环境污染生物标记物.利用RT-PCR结合RACE技术从大黄鱼(Larimichthys crocea)肝脏克隆了CYP1A基因全长cDNA序列.经分析,该cDNA的5'末端有175 bp的非翻译区.开放阅读框为1 566 bp,编码521个氨基酸和一个终止密码子,3'末端有857 bp的非翻译区,3'非翻译区有一个多聚腺苷酸信号及两个与mRNA的快速降解有关的AUUUA序列.推测大黄鱼CYP1A的氨基酸序列和欧洲鲈鱼的相似度最高迭89.6%.用RT-PCR检测大黄鱼CYP1A的表达特征发现,在所检测的9个组织中均有表达,以肝脏、消化道、脾脏和肾脏的表达量较高.     

西伯利亚蓼谷氨酰胺合成酶基因的克隆及碱性盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼(Polygonum sibiricum Laxm.)地下茎抑制消减文库(SSH)中获得的谷氨酰胺合成酶基因(Glutamin synthetase,GS)EST序列,应用RACE技术克隆了具有Poly A的全长cDNA序列,以下简称为PsGS基因。该序列全长1 273 bp,其5'非翻译区178 bp,3'非翻译区24 bp,开放阅读框编码356个氨基酸残基;根据与其他植物谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列的比对以及系统进化分析的结果,确定此基因为谷氨酰胺合成酶基因家族成员;经过SignalP3.0预测该蛋白没有信号肽,无切割位点,为非分泌蛋白。经过ProtParam计算该蛋白的理论等电点为5.55,分子量为39.2 kD,不稳定系数为43.82%,为非稳定蛋白。实时定量PCR分析表明,PsGS在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎中均有表达。在3%NaHCO3诱导下,该基因在叶和茎中表达升高,在地下茎中表达受到抑制,推测该基因在抵御碱性盐迫时具有重要作用。     

朝仓花椒几丁质酶类似基因的克隆及分析

根据本实验室已建立的朝仓花椒转录组数据库提供的序列信息设计引物,以朝仓花椒嫩芽为材料提取总m RNA,采用RACE技术克隆了朝仓花椒几丁质酶基因5'端1 080 bp和3'端896 bp c DNA片段,连接至p UC19载体,经测序拼接后获得全长1 373 bp的(Zanthoxylum piperitum DC.var.inerme Makino Chitnase 1,Za CHI 1)c DNA序列,其中开放阅读框969 bp,共编码322个氨基酸残基。在NCBI中BLASTp比对,Za CHIT 1与c克莱门柚、土瓶草CHIT序列同源性分别为88%和81%;预测的蛋白质Za CHIT 1氨基酸序列经BLAST比对,显示该预测蛋白质序列属于lysozyme-like超家族。对Za CHIT 1基因在不同器官中的表达量进行测定后发现,该基因在不同器官中的表达量有明显的差异,在器官中具体表现为在茎中最高,其次是果实,最后是叶片。此外,该基因的表达量与性别无关。     

扩展青霉PF898碱性脂肪酶基因组DNA的克隆及序列分析

扩展青霉 (Penicilliumexpansum)PF898可产生一种具有重要工业生产价值的碱性脂肪酶(PEL) .在通过 3′RACE和 5′RACE获得PEL完整的cDNA序列的基础上 ,通过PCR方法首次克隆了该脂肪酶的完整的基因组DNA序列 (GenBank登录号为AF330 6 35 ) .该脂肪酶DNA全长 14 0 4bp ,包括PEL编码区、3′非翻译区和部分 5′非翻译区基因的序列 .编码区DNA由 1135个碱基组成 ,含有 5个内含子 ,大小分别为 5 8bp、4 7bp、5 0bp、5 6bp和 6 9bp .在已报道的丝状真菌脂肪酶中 ,PEL基因的内含子数量最多 ,而其大小与其它丝状真菌脂肪酶基因的内含子一样 ,均为只有几十个碱基的小内含子 .PCR扩增获得的PLEDNA序列还包括由 195个碱基组成的 3′端非编码区序列 ,74个碱基的部分 5′端非编码区序列 .PELDNA全长序列中的 - 2 4至 - 2 7nt为TATAbox ,终止码TGA下游15 6nt出现AATAAA序列 ,TGA下游 182位出现poly(A)尾 ,为典型的真核基因结构 .同源性序列分析表明 ,PEL与其它真菌来源脂肪酶的基因组DNA序列同源性约为 39%～ 4 9% ,PEL内含子之间或PEL内含子与其它丝状真菌脂肪酶基因的内含子之间的序列同源性约 4 2 %～ 5 7% .