PinX1的原核表达、纯化及其与hTERT的相互作用简

目的：原核表达人Pin2/TRF1结合蛋白X1（PinX1）,确定该蛋白与人端粒酶逆转录酶（hTERT）催化亚基的相互作用。方法：用PCR方法从乳腺文库中扩增PinX1基因的编码序列,克隆至pET-32a载体构建重组质粒pHis-PinX1,经双酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21并进行诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹检测His-PinX1的表达;用His磁珠纯化His-PinX1,在人肾胚细胞293T内检测His-PinX1与hTERT的相互作用。结果：扩增得到980bp的PinX1基因;Western印迹检测表明,相对分子质量约57x10。的His-PinX1获得表达,且纯化的His-PinX1与hTERT具有相互作用。结论：表达并纯化得到了与hTERT相互作用的His-PinX1,为深入研究PinX1的功能奠定了基础。     

半乳糖凝集素-1的融合克隆及纯化

目的：表达和纯化半乳糖凝集素-1融合蛋白。方法：用PCR方法从乳腺文库中扩增半乳糖凝集素-1编码序列,将其以正确相位与pGEX-KG载体中的GST编码序列融合,将重组质粒转化大肠杆菌DH5α后,用谷胱甘肽-Sepharose 4B纯化融合蛋白,并用Western印迹检测融合蛋白的表达。结果：构建得到半乳糖凝集素-1的融合蛋白表达载体;Western印迹检测表明,GST-半乳糖凝集素-1融合蛋白成功表达,并纯化得到融合蛋白。结论：克隆和表达了半乳糖凝集素-1基因,并得到纯化的融合蛋白。     

类泛素家族SUMO-1和UBC9的克隆、融合表达及纯化

目的：克隆类泛素化家族SUMO-1和UBC9基因,表达并纯化二者与谷胱甘肽S-转移酶（GST）的融合蛋白。方法：用PCR方法从乳腺文库中扩增SUMO-1和UBC9的编码序列,分别将其以正确相位与pGEX-KG载体中的GST编码序列融合,得到重组质粒pGST-SUMO-1和pGST-UBC9,分别转化大肠杆菌DH5α,表达融合蛋白GST-SUMO-1和GST-UBC9;用谷胱甘肽-Sepharose4B亲和纯化融合蛋白;用Western印迹检测融合蛋白的表达及纯化。结果：分别构建了SUMO-1和UBC9的融合表达载体;Western印迹检测表明,GST-SUMO-1和GST-UBC9融合蛋白获得表达;纯化得到了融合蛋白。结论：克隆、表达并纯化了SUMO-1和UBC9与GST的融合蛋白。     

幽门螺杆菌CagA蛋白N端片段的表达、纯化及其与磷脂酰丝氨酸的亲和力检测

目的:表达和纯化幽门螺杆菌不同菌株的CagA蛋白N端片段,检测其与磷脂酰丝氨酸(PS)的相互作用及亲和力。方法:用PCR方法从幽门螺杆菌3个菌株中扩增出CagA蛋白N端基因,并连接到表达载体pET-28a上;转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导可溶性表达CagA蛋白N端880残基片段;经镍柱亲和纯化后,利用PLOA法检测CagA蛋白与PS的相互作用。结果:构建了3种幽门螺杆菌菌株cagA基因的原核表达质粒pET-28a/cagAJ99、pET-28a/cagA11637及pET-28a/cagASS1,并在大肠杆菌中获得可溶性表达,SDS-PAGE和Western印迹证实得到目标融合蛋白,亲和纯化得到高纯度CagA蛋白。PLOA结果表明,CagA蛋白与PS有明显的相互作用。结论:3种幽门螺杆菌菌株CagA蛋白与PS之间存在相互作用,且不同的CagA与PS有不同的亲和力。     

人GST-14-3-3σ融合蛋白的原核表达、纯化及活性检测

目的:构建人14-3-3σ基因的原核表达载体,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化及活性检测。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增14-3-3σ基因编码序列,将其克隆到pGEX-KG载体中,重组质粒转化大肠杆菌Rossate后表达重组蛋白,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,并通过SDS-PAGE和Western印迹检测融合蛋白的表达,采用GST pull-down技术检测已纯化的蛋白与已知体外相互作用蛋白AKT之间的相互作用。结果:从人乳腺文库中扩增获得约750 bp的DNA片段,并成功克隆至pGEX-KG载体上,经双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,测序与目的基因序列完全一致;在Rossate菌株中诱导表达出相对分子质量约52 000的目的蛋白,SDS-PAGE和Western印迹结果表明融合蛋白表达成功,并纯化得到GST-14-3-3σ融合蛋白;通过GST pull-down技术检测证实GST-14-3-3σ融合蛋白可以和AKT在体外结合,并证实其具有生物学活性。结论:获得了原核表达的活性较好的GST-14-3-3σ蛋白,为后续研究细胞周期蛋白调控机制奠定了实验基础。     

幽门螺杆菌HP0762蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

目的:表达和纯化幽门螺杆菌HP0762蛋白,并制备该蛋白的多克隆抗体。方法:从幽门螺杆菌SS1中经PCR扩增得到了hp0762基因,将其克隆至含有6×His编码序列的原核表达载体pET-28a(+)中,再将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行蛋白表达;用HiTrap Chelating HP亲和柱纯化重组蛋白,Western印迹进一步鉴定;以纯化后的蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备该蛋白的多克隆抗体;用ELISA和Western印迹检测抗血清。结果:目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度可达90%以上;制备了针对HP0762重组蛋白的抗血清,抗体ELISA效价为1:256000,Western印迹分析表明该抗体能特异性识别内源性HP0762。结论:完成了HP0762蛋白的原核高效表达与纯化,并制备了其高效价的多克隆抗体,为进一步对其进行疫苗研制与基因功能研究奠定了基础。     

人表皮生长因子受体结构域蛋白的原核表达、纯化及活性检测

目的:构建人表皮生长因子受体(EGFR)胞外结构域(ED)和胞内激酶结构域(PKD)的原核表达载体,获得纯化的GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD融合蛋白,并检测其活性。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增EGFR的ED和PKD基因编码序列,将其正确插入p GEX-KG载体,重组质粒转化大肠杆菌Rossate表达后,用GST-Sepharose4B珠子纯化融合蛋白。结果:构建得到GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出与预期位置相符的目的蛋白,经Western印迹检测,融合蛋白成功表达;纯化得到融合蛋白GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD。结论:克隆了GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD基因,并获得了活性良好的GST-EGFR-ED和GST-EGF-PKD融合蛋白,为研究EGFR在肿瘤中的作用奠定了实验基础。     

人生长分化因子15的原核表达、纯化与多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化、鉴定人生长分化因子15(GDF-15),制备其多克隆抗体。方法:从人结肠癌细胞系HT29的cDNA扩增出GDF-15基因片段并插入pET-32a(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达重组GDF-15,用镍亲和柱纯化,SDS-PAGE、Western印迹鉴定重组蛋白。用纯化的重组GDF-15免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,鉴定并检测其效价。结果:制备了pET-32a(+)-GDF-15表达载体;经IPTG诱导重组蛋白表达后,采用Ni亲和柱纯化蛋白,并经SDS-PAGE和免疫印迹鉴定;免疫BALB/c小鼠后获得了GDF-15多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为1∶100000,并应用于肿瘤细胞的GDF-15检测中。结论:用基因工程和免疫学方法制备了重组人GDF-15及其多克隆抗体,为后续的分子机制和靶向治疗研究奠定了基础。     

酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ的融合表达及纯化

目的:利用大肠杆菌融合表达酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ(CcoⅡ)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)并纯化。方法:根据酮古龙酸菌Y25基因组序列设计引物,通过PCR扩增CcoⅡ基因,酶切后连接pGEX-KG表达载体,转化至大肠杆菌获得重组菌,经IPTG诱导表达融合蛋白GST-CcoⅡ,用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂亲和纯化融合蛋白,并利用Western印迹及质谱对表达蛋白进行鉴定。结果:扩增得到867 bp的CcoⅡ基因,构建了pGEX-KG-CcoⅡ融合表达载体,重组菌经0.4 mmol/L IPTG于20℃诱导16 h,SDS-PAGE分析显示有可溶性表达条带,相对分子质量约为59×103;Western印迹及质谱分析表明,利用亲和层析方法纯化到了目的蛋白。结论:表达并纯化了GST-CcoⅡ融合蛋白,为酮古龙酸菌电子传递链的研究奠定了基础。     

核心组蛋白的融合表达和纯化

目的:克隆核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4的基因,表达并纯化组蛋白与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4的编码序列,分别将其以正确相位与pGEX-KG载体中的GST编码序列融合,得到重组质粒pGST-H2A、pGST-H2B、pGST-H3和pGST-H4,分别转化大肠杆菌BL21,表达融合蛋白GST-H2A、GST-H2B、GST-H3和GST-H4;用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和纯化融合蛋白;用Western印迹检测融合蛋白的表达及纯化。结果:分别构建了核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4的融合表达载体;Western印迹检测表明,融合蛋白GST-H2A、GST-H2B、GST-H3和GST-H4获得表达及纯化。结论:表达并纯化了H2A、H2B、H3和H4的融合蛋白,为进一步研究核心组蛋白的功能奠定了基础。     

人自噬相关蛋白ATG7的原核表达及纯化鉴定

目的:原核表达并纯化自噬相关蛋白ATG7,初步鉴定其生物学活性。方法:利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人ATG7基因的编码序列,插入载体p ET-28a(+)得到重组质粒,经Bam HⅠ和NotⅠ双酶切鉴定后转化大肠杆菌Rossate菌株进行小量诱导,纯化融合蛋白His-ATG7,通过Western印迹和SDS-PAGE检测融合蛋白的纯化效果。结果:用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到约2031 bp的目的片段,插入载体p ET-28a(+)后构建出His-ATG7重组质粒,并经酶切鉴定及测序证实无误;转化大肠杆菌Rossate并进行小量诱导,纯化后SDS-PAGE检测显示获得相对分子质量约为78×103的融合蛋白。结论:纯化得到原核系统表达的His-ATG7融合蛋白,为后续研究ATG7在自噬中的作用机制奠定了实验基础。     

具有抗HIV活性的天花粉蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:天花粉蛋白(TCS)有较强的抗HIV活性。利用基因工程技术在大肠杆菌中表达TCS并进行纯化。方法:从新鲜栝楼叶片中获取TCS基因组DNA,利用PCR技术扩增其全长基因,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后与原核表达载体pRSET-A连接,转化感受态E.coliDH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序;将所获阳性重组质粒转化感受态E.coliBL21(DE3)得到工程菌,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE及Western印迹鉴定;用Ni-NTA柱对所获目的蛋白进行纯化。结果:获得了目的蛋白的可溶性高效表达,并通过了Western印迹鉴定。经Ni-NTA柱纯化后,得到大量均一的6His-TCS融合蛋白。结论:TCS在大肠杆菌中的表达与纯化,为通过基因工程方法研制具有抗HIV活性的药物奠定了基础。     

重组人磷脂爬行酶1的原核表达及纯化

目的:建立重组人磷脂爬行酶1(hPLSCR1)原核表达及纯化工艺。方法:PCR扩增hPLSCR1编码基因并连接到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达,Western印迹鉴定所表达蛋白;优化表达条件后,Ni2+柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:构建了pET-28a-PLSCR1重组质粒,诱导表达后,经SDS-PAGE分析目的蛋白的表达量达32%,Ni2+金属螯合法纯化目的蛋白后纯度达到95%以上,Western印迹验证了融合蛋白的特异性。结论:建立了高效稳定的His-PLSCR1表达体系,获得大规模生产His-PLSCR1的分离纯化工艺,为进一步研究其蛋白功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌16-kDa α晶体蛋白的原核表达及纯化

目的:利用基因工程技术原核表达并纯化结核分枝杆菌α晶体蛋白(Acr)。方法:以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增Acr的编码基因,以pCold为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析和纯化该表达产物。结果:构建了具有正确基因序列的Acr重组表达质粒,重组Acr在大肠杆菌BL21(DE3)中经低温诱导得到可溶性表达;分别用6×His的单克隆抗体和16-kDa单克隆抗体对表达产物进行Western印迹分析,结果显示在相对分子质量约19 000处均有特异性条带,与预计大小吻合;纯化后蛋白纯度达90%,浓度达0.8 mg/mL。结论:表达了重组可溶性Acr,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。     

vMIP-II-TfN融合蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化

目的:构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体,表达纯化vMIP-II-TfN融合蛋白。方法:利用PCR方法扩增编码人转铁蛋白N端半分子的基因片段,通过酶切、连接、转化等分子克隆方法构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体;电击法转化X33酵母菌;用甲醇诱导重组酵母菌表达融合蛋白,利用硫酸铵沉淀、透析、Ni-NTA层析等技术进行蛋白纯化,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达和纯化情况,利用趋化实验进行纯化蛋白活性检测。结果:经过两次PCR扩增了一个长约1.1kb的包含Xba I酶切位点的IgG3-TfN基因片段,插入pPIC-vMIP-II的Xba I酶切位点,经菌液PCR鉴定获得重组子,测序结果表明构建载体pPIC-vMIP-II-TfN的表达框正确无误,转化X33酵母菌,用甲醇诱导表达出48kDa的vMIP-II-TfN融合蛋白,经硫酸铵沉淀、透析、Ni-NTA纯化后得到纯度约为95%的vMIP-II-TfN融合蛋白。Western印迹结果表明融合蛋白能与转铁蛋白抗体特异性结合。活性检测表明经过诱导表达的vMIP-II-TfN融合蛋白具有趋化抑制活性。结论:成功构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体,重组酵母工程菌经甲醇诱导成功表达出vMIP-II-TfN融合蛋白,纯化后的vMIP-II-TfN融合蛋白具有趋化抑制活性。     

脊髓损伤修复相关10号蛋白在COS7细胞中的表达、纯化与鉴定

目的:在COS7细胞中表达脊髓损伤修复相关10号蛋白(SCIRR10),并对表达产物进行纯化和鉴定。方法:在实验室前期研究基础上,用PCR方法扩增SCIRR10基因,将其克隆入pcDNA3.1/myc-HisA穿梭质粒中,转染COS7细胞进行表达;对表达产物用金属螯合层析方法纯化,并进行SDS-PAGE和Western印迹检测。结果及结论:构建了含有SCIRR10基因的穿梭质粒pcDNA3.1/myc-His-SCIRR10,并使其在COS7细胞中得到表达,纯化后的重组蛋白SCIRR10-His-myc的纯度在80%以上,可用于下一步的实验研究。     

耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌OXA-23-like基因的克隆和表达

扩增耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii) OXA-23-like基因,并表达纯化该蛋白,为深入研究鲍曼不动杆菌亚单位蛋白疫苗提供理论基础。从60份样品中分离并扩增出OXA-23-like基因,构建于p GEX-6p-1表达载体中,用BL21表达宿主细胞诱导表达并纯化蛋白;免疫印迹试验(Western blotting)验证OXA-23-like蛋白保守性。结果显示,成功构建pGEX-6p-1-OXA-23-like质粒,表达并纯化蛋白;Western blotting实验表明临床菌株OXA-23-like蛋白表达阳性。OXA-23-like基因和蛋白表达保守性高,具有免疫原性,是鲍曼不动杆菌疫苗良好的抗原靶点。     

小鼠黑色素瘤相关抗原MART1的原核表达及抗体制备

目的:利用基因重组技术获得鼠黑色素瘤相关抗原MART1,并制备兔抗鼠多克隆抗体。方法:采用RT-PCR方法从小鼠黑素瘤B16-F1细胞株总RNA中扩增MART1的编码c DNA序列,并构建p ET32a-MART1原核表达质粒,将此质粒转化大肠杆菌Rosseta(DE3)菌株后用IPTG诱导表达,获得的MART1融合蛋白依次用Ni-NTA亲和层析和制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化,纯化的MART1融合蛋白用SDS-PAGE和Western印迹鉴定;以纯化的MART1融合蛋白为抗原,皮内接种日本大耳白兔,制备多克隆抗体,采用ELISA、Western印迹和细胞免疫荧光法分别检测兔血清中抗体的效价及抗原的特异性。结果:构建出MART1原核表达质粒,小鼠MART1基因在大肠杆菌Rosseta(DE3)中可诱导性表达并有效纯化;用纯化的MART1蛋白在日本大耳白兔中制备出高效价的多克隆抗体(效价1∶1 024 000),该抗体可与原核及真核表达的MART1蛋白特异性结合。结论:建立了鼠MART1蛋白原核表达和纯化技术,制备出的高效价和特异性抗MART1多克隆抗体将为黑色素瘤的防治研究提供技术支撑。     

GST/MKRN1融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:利用大肠杆菌BL21(DE3)表达GST/MKRN1融合蛋白,亲和层析分离纯化目的蛋白,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法:MKRN1cDNA全长1449bp,编码482个氨基酸残基。将其基因片段克隆到pGEX-4T-1载体上,获得pGEX-4T-1-MKRN1原核表达重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得可溶性表达,经谷胱甘肽Sepharose4B介质填充的层析柱分离纯化蛋白,制备抗原免疫动物,得到pGEX-4T-1-MKRN1多克隆抗体。结果:ELISA结果显示血清抗体效价可达到1∶256000。通过Western免疫印迹及免疫细胞荧光分析,自制的多克隆抗体能特异地与MKRN1蛋白相互作用,可用于免疫细胞化学分析。结论:制备了效价和特异性良好的抗MKRN1多克隆抗体,经实验验证获得的免疫血清能够满足针对MKRN1的Western免疫印迹和细胞免疫组化检测的实验要求,为今后深入研究MKRN1表达的组织分布、细胞内定位及与端粒酶催化亚基(hTERT)之间相互作用的生物学意义提供了有用的实验工具。     

VEGF121-KLAK融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中高效表达并纯化VEGF121与两性分子KLAK的融合蛋白,为进一步研究其抗肿瘤血管形成作用奠定基础。方法:用RT-PCR法扩增目的基因,插入表达载体pET28a后,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白,对产物进行SDS-PAGE及Western印迹分析。结果:克隆出目的基因,构建了融合蛋白表达载体,诱导表达后经SDS-PAGE检测表明获得了目的条带。结论:在大肠杆菌中高效表达并纯化了融合蛋白VEGF121-KLAK。