SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞体外培养体系的建立

目的 建立脊髓型肌萎缩症(SMA)小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)体外培养体系,研究反义寡核苷酸(ASO)对其生物学特性的影响,为深入研究SMA发病机制及药物筛选提供可靠的体内模拟工具细胞。方法 选取刚出生4 d的SMA小鼠,CO₂窒息法处死后,于75%乙醇中浸泡,分离、纯化骨髓细胞。细胞荧光检测细胞表面标志物;RT-PCR及Western Blot研究ASO对运动神经元存活基因2(SMN2)外显子(exon7)列入水平以及运动神经元存活(SMN)蛋白表达量;EDU法和TUNEL法检测细胞增殖和凋亡能力。结果 体外分离培养的SMA模型小鼠BMMSC具有贴壁生长、可以传代等特点;对P3代BMMSC进行细胞免疫荧光鉴定结果显示：CD44、CD29高表达,CD34、CD45低表达;转染ASO后细胞SMN2 exon7列入率显著上升以及SMN蛋白表达量显著上调,并显著促进细胞增殖能力,同时核内Gemini bodies(gems)数量也有所增多。结论 成功建立SMA小鼠BMMSC体外培养体系,通过阳性药物ASO验证可促进BMMSC SMN2 exon7列入及SMN蛋白表...     

脊髓性肌萎缩症患者尿液细胞模型的建立

脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy, SMA)大多数在儿童或婴幼儿期发病,表现为进行性、对称性的肢体无力和肌肉萎缩,迄今尚无有效的治疗方法,是婴幼儿最常见的致死性遗传病之一。患者来源的细胞系是该病研究的重要工具,但依赖于肌肉或皮肤活检等创伤性手术的成纤维细胞培养较难被患者及家属接受。文章收集SMA患者及健康对照的新鲜尿液,进行离心、尿液沉渣培养,观察尿液细胞的生长状况,用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析患者尿液细胞中SMN(Survival of motor neuron)蛋白的表达量,应用免疫荧光染色观察SMN蛋白在细胞内的定位。共建立了11例SMA患者和14例健康对照的尿液细胞系,尿液细胞体外增殖旺盛,细胞形态及生长速度较稳定。患者来源的尿液细胞SMN1(Survival of motor neuron 1) 基因缺失突变、SMN蛋白表达量降低,荧光染色提示SMN蛋白在胞浆和胞核中均有定位。尿液细胞培养步骤简单、无创伤性、患儿及其家属的依从性好,是获取和保存病人来源标本的有效方法,在脊髓性肌萎缩症发病机制研究和临床应用方面具有较好的应用价值。     

脊肌萎缩症的相关致病基因

脊肌萎缩症（SMA）是一种常染色脊肌萎缩症隐性遗传疾病,随着分子生物学的发展,在SMA相关基因的研究方面取得了重大进展,可能与运动神经元存活基因、神经元凋亡抑制蛋白基因和基本转录因子等基因突变有关。     

血管内皮细胞条件性敲除Cx43杂合子小鼠模型建立及其血管功能变化的研究

目的 建立血管内皮细胞连接蛋白43(connexin 43, Cx43)条件性敲除小鼠模型,并对其血管舒张/收缩功能进行检测。方法 将8只Cx43^flox/flox 小鼠与C57BL/6品系野生型(wild type, WT)小鼠交配,子代小鼠继续与C57BL/6小鼠回交9代进行基因背景转换;再将Cx43^flox/+小鼠与血管内皮细胞特异性表达Tie2-Cre重组酶小鼠(以下简称Cre小鼠)交配,获得Tie2-Cre/Cx43^flox/+小鼠。利用鼠尾PCR试剂盒进行基因型鉴定,Western Blot法和免疫荧光法检测小鼠肠系膜上动脉(superior mesenteric artery, SMA)中Cx43表达。利用离体张力测定技术检测SMA血管舒张/收缩功能,包括去甲肾上腺素诱导的收缩反应性和乙酰胆碱诱导的舒张反应性。结果 PCR电泳和血管蛋白表达检测结果证实Tie2-Cre/Cx43^flox/+小鼠成功构建,肠系膜上动脉中Cx43蛋白表达与野生型小鼠相比明显降低(P<0.01)。与WT...     

一种微管-荧光融合蛋白嵌合标记斑马鱼运动神经元系统的建立

运动神经元是一类支配运动行为的重要神经元。传统的荧光蛋白标记的转基因斑马鱼品系(用于活体成像分析运动神经元形态发生)存在胞体密集、突触交错、不好区分单个神经元等不足。为了优化活体成像分析运动神经元,本研究旨在建立一种微管-荧光融合蛋白嵌合标记斑马鱼运动神经元系统。首先通过Gateway克隆技术将运动神经元表达基因mnx1启动子序列与绿色荧光蛋白-α-Tubulin融合蛋白序列构建到含有Tol2转座位点的表达载体中,然后将该质粒和Tol2 mRNA同时注射到4～8细胞期斑马鱼受精卵中,在72 hpf (hours post fertilization)进行共聚焦显微成像分析。结果显示,该系统中绿色荧光融合蛋白在3种类型运动神经元中表达,从而实现单个运动神经元嵌合标记。本研究进一步探索注射剂量与嵌合标记神经元数量以及分布频率的关系,并确定了重组蛋白的合适剂量(15 ng)。此外,本研究在该模型上验证了insm1a和kif15表达下调导致的运动神经元异常发育。这些结果表明我们成功建立了一种微管-荧光融合蛋白嵌合标记斑马鱼运动神经元系统,为探究运动神经元的发育和形态发生提供了一个直观和快速的模...     

应用多重竞争性PCR联合毛细管电泳技术进行脊髓性肌萎缩症携带者筛查

脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传、儿童致死性神经系统疾病。SMA致病基因为运动神经元存活基因(survival motor neuron1, SMN1)。虽然检测SMN1基因拷贝数的方法众多,但目前适于大规模人群筛查的技术较少。为寻求一种快速准确的实验技术可以用于人群中SMA携带者的大规模筛查,了解区域人群携带情况及常见变异的分布,本研究应用多重竞争性PCR联合毛细管电泳技术检测12例SMA患者及其父母SMN1基因拷贝数,同时对江苏地区151例健康孕妇人群SMN1基因进行拷贝数检测,并通过多重连接依赖探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)技术验证检测结果。多重竞争性PCR联合毛细管电泳技术结果与MLPA结果一致,显示12例SMA患者均为SMN1基因零拷贝,其父母的SMN1基因拷贝数均为单拷贝,151例健康人群中检测出SMN1基因单拷贝3例(即SMA携带者),占2.0%;SMN1基因双拷贝134例,占88.7%;SMN1基因大于双拷贝14例,占9.3...     

肌内注射肉毒素后脊髓运动神经元电生理特性的变化

注射肉毒素(A 型)于成年猫一侧的内侧头腓肠肌、外侧头腓肠肌和比目鱼肮内,功能性地阻断这些肌肉与神经的联系。注射肉毒素约三星期后,用细胞内记录技术观察一侧被注射肉毒素肌肉(简称肉毒侧)的运动神经元电生理特性的变化,主要结果如下:(1)与正常动物的或一侧肌内注射肉毒素动物的对侧运动神经元比较,肉毒侧极大多数运动神经元的后超极化电位时程明显减短,动作电位上升相的弯折不明显,动作电位时程减短;并且这运动神经元在通较弱电流时就产生重复发放。(2)给二个逆向刺激时,肉毒侧的极大多数运动神经元在较短的刺激间隔时间就出现第二个 SD 峰电位。(3)肉毒侧运动神经元的静息电位、神经轴突传导速度及动作电位超射均无异常。第三项中的结果与切断轴突后的结果不同。肉毒侧内侧头腓肠肌、外侧头腓肠肌和比目鱼肌运动神经元的后超极化电位时程都减短的结果与切断轴突、横切脊髓或河豚毒阻断神经冲动使肌肉不活动后的结果也不同,后两者仅使比目鱼肌运动神经元的后超极化电位时程减短。最后讨论了产生这些结果的可能机制,它需要进一步进行研究。     

脊髓性肌萎缩症SMN1基因2+0基因型携带者的家系研究

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy, SMA)是一种儿童时期较为常见的神经肌肉病,属于常染色体隐性遗传。绝大多数SMA由运动神经元存活基因1 (survival motor neuron 1, SMN1)的纯合缺失突变所致。而SMN1的2+0基因型个体作为一种特殊的SMA携带者,给携带者筛查以及家系的遗传咨询带来了巨大的挑战。已有研究表明,g.27134T>G和g.27706₂7707delAT多态位点变异对于Ashkenazi犹太人群中的2+0基因型个体具有提示作用。为进一步探究这两个多态位点是否在中国人群也具有特异性,本研究纳入了44例家系成员和204例已知SMN1基因拷贝数的对照样本。44例家系成员来自于9个无关的SMN1基因纯合缺失的SMA家系,先证者双亲之一疑似为2+0基因型携带者。利用多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)和短串联重复(short tandem repeat, STR)连锁分析进行基因型的鉴定以及多态位点的筛查,最终...     

A型肉毒毒素治疗上肢痉挛的应用进展

脑瘫、脑卒中、颅脑外伤、多发性硬化等疾病引起上运动神经元病损均可出现肌肉痉挛,给患者的肢体功能造成不良影响。肉毒毒素是肉毒梭状芽孢杆菌产生的一种毒力极强的嗜神经生物毒素,可阻断神经肌肉接头处的乙酰胆碱的释放,导致肌肉松弛性麻痹。一些临床专家利用肉毒毒素(主要为A型肉毒毒素Botulinum toxin type A,BTX-A)的这种生物活性,来治疗肢体肌肉痉挛,已成为相关医学生物学和临床研究的热点之一。     

人脊髓前角运动神经元190KD蛋白的初步研究

本研究采用ＳＤＳ凝胶电泳方法从人脊神经前根中分离出人脊髓前角运动神经元特有的蛋白—１９０ＫＤ。将该蛋白作为抗原,免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,经杂交瘤技术,获得了抗１９０ＫＤ蛋白的单克隆抗体。免疫细胞化学检测表明,１９０ＫＤ单抗与脊髓灰质前角神经元、前根及肌支发生阳性反应。实验结果提示,１９０ＫＤ蛋白分布在脊髓运动神经元胞体及脊神经的前根和肌支纤维中。     

基于诱导性多潜能干细胞的亨廷顿舞蹈病发病机制研究

目的:基于诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSC)多潜能性的特点将亨廷顿舞蹈病(Huntington disease,HD)患者和正常人特异性i PSC定向诱导分化成运动神经元,并在运动神经元的基础上探讨HD的发病机制。方法:将HD患者和正常人的i PS细胞在特定的生长因子和神经因子的作用下定向诱导分化成运动神经元。然后用免疫荧光染色检测运动神经元特异性标记物HB9和ISL1的表达。以DCFH-DA和JC-1为荧光探针,利用流式分析法分别对正常人和HD患者运动神经元细胞活性氧和线粒体膜电位进行检测。结果:经过25天诱导分化成功得到HD患者和正常人的运动神经元,并且免疫荧光染色显示,βIII-微管蛋白阳性的神经细胞同时表达运动神经元特异性的标志物HB9和ISL1。此外,经实验统计发现HD患者运动神经元细胞内代表活性氧水平的荧光强度(4704.33±390.50)较正常组(2840.33±166.20)有明显增强(P=0.002),而且代表线粒体膜电位红绿荧光强度比(2.74±0.13)较正常组(3.97±0.29)相比有明显降低(P=0.03)。结论:HD患者特异性i PSC能够诱导分化成运动神经元,为实验提供研究模型。HD的发病与运动神经元细胞线粒体功能障碍有关。     

利用CRISPR/Cas9技术产生肌肉特异表达Cas9的小鼠胚胎

目的通过CRISPR/Cas9技术获得肌肉特异性表达Cas9蛋白小鼠胚胎,为建立肌肉特异表达Cas9小鼠动物模型奠定基础。方法设计小鼠Rosa26位点sgRNA并通过体外酶切验证活性,同时使用同源重组构建肌肉特异性同源打靶载体;通过显微注射将Rosa26sgRNA与Cas9蛋白注射到小鼠胚胎,通过PCR及测序检测胚胎的编辑情况,同时移植到假孕母鼠体内,待其生产;将同源打靶载体与Rosa26sgRNA和Cas9一起注射到小鼠胚胎,通过PCR检测整合情况。结果体外酶切实验表明,体外转录的sgRNA与Cas9蛋白联合可对靶位点产生编辑作用;成功构建了肌肉特异性同源打靶载体Donor-SP-px459;通过原核注射获得Rosa26基因编辑胚胎,经移植获得Rosa26基因编辑小鼠;注射同源打靶载体后,成功获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶小鼠胚胎。结论利用CRISPR/Cas9技术,成功获得Rosa26基因编辑胚胎和小鼠,并获得了肌肉特异性表达Cas9蛋白小鼠胚胎,为利用基因打靶构建肌肉特异表达Cas9的小鼠动物模型奠定基础。     

性别及日龄对转人神经生长因子基因小鼠唾液中蛋白分泌的影响

神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)是一种能促进神经元发育、分化、再生的蛋白。为高效生产药效更佳的人源NGF (hNGF)药物,最近,笔者实验室构建出唾液腺特异表达hNGF的转基因小鼠,并从该转基因小鼠唾液中纯化获得具有高生物学活性的h NGF蛋白。为了选择性别和日龄最适宜的转hNGF基因小鼠用于收集纯化hNGF蛋白,文中比较了28日龄(性成熟前)雄性、雌性,63日龄(性成熟后)雄性、雌性转hNGF基因小鼠,共4组转hNGF基因小鼠分泌的唾液量、唾液总蛋白量、唾液鼠源NGF (mNGF)蛋白量和唾液h NGF蛋白量等指标。结果显示,63日龄的转hNGF基因小鼠分泌的唾液量、唾液总蛋白量、唾液mNGF蛋白量和唾液hNGF蛋白量显著高于28日龄同一性别的转hNGF基因小鼠,且63日龄的雄性转hNGF基因小鼠分泌的唾液hNGF蛋白量显著高于同一日龄的雌性转hNGF基因小鼠;在4组小鼠中,63日龄的雄性转hNGF基因小鼠分泌的唾液hNGF含量最高,比28日龄雌性转hNGF基因小鼠高出约46倍,最适宜用于收集唾液并从中纯化hNGF。     

微囊蛋白基因及其与疾病关系研究进展

微囊蛋白(caveolin)基因家族已鉴定出3个成员:微囊蛋白-1、微囊蛋白-2、微囊蛋白-3,并被定位于抑癌基因位点区域.微囊蛋白-1是细胞质膜微囊的标记蛋白,其中间疏水区域在细胞膜内形成发夹结构,并使其N端区域与C端区域在细胞膜内表面聚合形成支架结构.微囊蛋白-1与微囊蛋白-2以组成异源寡聚体的形式存在,在脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞中表达最丰富,微囊蛋白-3则特异表达于肌肉.离体与活体研究结果均表明微囊蛋白-1可能具有抑癌功能,并可能在细胞信号传导中起刹车作用.微囊蛋白-1基因敲除小鼠心血管NO与Ca²⁺信号途径受损、功能异常,肺泡上皮细胞出现异常扩增,脂质代谢失衡,身体消瘦.微囊蛋白-2基因敲除小鼠肺功能与耐力均严重受损,与微囊蛋白-1基因敲除小鼠的表型非常相似.微囊蛋白-3为维持心脏正常功能所必需,可能还与一些肌肉营养不良症有关.     

顺铂诱导三阴性乳腺癌4T1耐药小鼠模型的建立

目的建立一种耐药性稳定的三阴性乳腺癌4T1耐药小鼠模型,为研究体内肿瘤耐药机制和逆转药物的筛选奠定实验基础。方法采用顺铂(DDP)低剂量诱导及体内外交叉致瘤结合的方法建立三阴性乳腺癌耐药小鼠模型;MTT法检测细胞耐药特性;实时荧光定量PCR法分析耐药相关基因MDR1、BCRP、MMP7及GST-π表达差异;免疫组化分析耐药相关蛋白P-gp、BCRP、MMP7表达差异;蛋白印迹法检测磷酸化Akt(phosphorate-Akt,p-Akt)和总Akt(total-Akt,t-Akt)蛋白表达;小动物成像检测观察肿瘤生长情况。结果 MTT显示建立的三阴性乳腺癌耐药4T1小鼠模型的耐药指数为12.84;耐药小鼠肿瘤组织中MDR1、BCRP、MMP7、GST-π基因mRNA的表达量及P-gp、BCRP、MMP7蛋白的表达量均高于非耐药小鼠(P0.01);Western blot显示,耐药小鼠肿瘤组织的p-Akt蛋白表达明显高于非耐药小鼠,t-Akt蛋白表达没有差异。非耐药小鼠与耐药小鼠肿瘤组织生长速度未见明显区别(P0.05)。分别给予这两种模型小鼠相同剂量的DDP治疗后,耐药小鼠对DDP的敏感性明显低于非耐药小鼠(P0.01)。结论初步建立了三阴性乳腺癌耐药4T1小鼠模型,为三阴性乳腺癌临床个体化治疗及耐药逆转研究等提供了良好的实验动物平台。     

汉坦病毒核酸疫苗在小鼠体内表达分布的初步研究

运用生物荧光技术,肌肉免疫接种小鼠含汉坦病毒S抗原基因片段的核酸疫苗,观察重组核酸疫苗在其体内的表达分布。进一步探讨汉坦病毒核酸疫苗的应用前景。扩增纯化已构建好的含有汉坦病毒S抗原基因片段和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组质粒pEGFP/S;免疫接种小鼠胫前肌,观察pEGFP/S在小鼠体内的表达分布。免疫接种3 d后在实验组小鼠肝、肾、脾、肌肉各组织均检测到较强的绿色荧光。重组质粒pEGFP/S能在小鼠的多个组织器官表达,为深入研究汉坦病毒核蛋白和有效的核酸疫苗奠定了基础。     

糖尿病下肢溃疡小鼠模型的建立与评价

目的建立和评价糖尿病下肢溃疡小鼠模型,揭示糖尿病下肢溃疡小鼠手术肢血流和病理生理的改变,初探其发病机制,为研究糖尿病外周血管病变提供基础和参考。方法小鼠分为下肢缺血组、糖尿病组和糖尿病下肢溃疡组。糖尿病下肢溃疡和糖尿病组腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立1型糖尿病模型。糖尿病下肢溃疡和下肢缺血组,采用高位结扎股动脉、股静脉并断离股动脉的方法建立下肢缺血模型;糖尿病组仅做假手术处理。术后第0、3、7、14、21天,用激光多普勒监测血流变化,观察肢体缺血坏死。第21天后HE切片观察组织形态变化,分析血小板-内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1/CD31)及抗平滑肌抗体(SMA)表达。结果缺血术后,与下肢缺血组小鼠比较,糖尿病下肢溃疡组体重显著下降,肢体坏死情况更严重。术后,糖尿病下肢溃疡组和下肢缺血组小鼠手术肢血流灌注下降明显;术后第3、7、14天,糖尿病下肢溃疡组和下肢缺血组血流灌注逐渐恢复;第21天,下肢缺血组接近正常水平,而糖尿病下肢溃疡组略有下降。糖尿病组无肢体坏死情况,血流灌注无明显变化。糖尿病下肢溃疡组和下肢缺血组小鼠手术肢腓肠肌组织有肌肉结构破坏和炎症浸润,CD31表达明显增加;糖尿病下肢溃疡组和糖尿病组SMA有显著表达,而下肢缺血组表达不明显。结论成功建立了糖尿病下肢溃疡小鼠模型,与下肢缺血小鼠模型对比,该模型有明显的肢体坏死症状和血流灌注恢复障碍。该模型可用于研究糖尿病血管病变发病机制的研究以及治疗药物的筛选。     

Piwil2 及Stat3、Bcl-2 蛋白在雄性不育小鼠 睾丸组织中表达

本研究主要是探讨Piwil2、Stat3、Bcl-2蛋白在不育的雄性小鼠中的表达量及三者之间的表达位置相关性。取雄性昆明种小鼠60只,随机分为实验组与对照组,每组30只。实验组采用雷公藤多苷药物灌胃造小鼠不育模型28 d;对照组按照同样剂量的生理盐水进行灌胃,持续时间及频次同实验组。造模后将两组雄性小鼠分别与雌性小鼠交配;再处死雄性小鼠取出两组的睾丸组织,采用免疫组织化学染色法和蛋白印迹检测法分别检测样本中Piwil2、Stat3及Bcl-2蛋白的表达状况。将实验组与对照组的检测结果进行比较,观察两组的蛋白表达差异性及三个蛋白表达的相关性。H.E染色显示,实验组小鼠睾丸组织生精小管结构与对照组相比,明显被破坏,精原细胞及初次级精母细胞数量明显减少,结合与雌鼠交配后受精能力明显下降的结果,说明不育造模成功。免疫组化(IHC)染色结果显示,实验组Piwil2、Stat3及Bcl-2蛋白的染色程度及阳性细胞数均明显低于对照组(P 0.01)。Western Blot结果同样显示,三种蛋白在实验组的表达量明显低于对照组(Piwil2蛋白P 0.05,Stat3蛋白P 0.05,Bcl-2蛋白P 0.01)。本研究说明,Piwil2、Stat3及Bcl-2蛋白在雄性不育小鼠中表达量均显著降低,这三个蛋白对小鼠精子生成及小鼠不育的发生起到重要调节作用。     

Gsα调控小鼠大脑皮层发育

异源三聚体G蛋白激活alpha亚基(Gsα),是一种普遍存在的鸟苷酸结合蛋白,调节受体介导的胞内cAMP信号通路进而参与调控细胞的生命活动。目前Gsα信号通路的研究主要在生物化学和药物方面,但在小鼠大脑皮层发育中的作用还没有详尽的描述。本研究首先利用cre-loxP系统在小鼠大脑皮层神经前体细胞中成功敲除Gsα基因;其次,通过收集出生后不同天数的正常小鼠和敲除小鼠,统计分析后发现敲除鼠的脑重和体重减轻;最后,对小鼠大脑做切片后染色,发现在小鼠大脑皮层条件性敲除Gsα基因的成年鼠中表达thy1-EGFP(增强绿色荧光蛋白)的神经元的数量减少,皮层形成异常。由此推测,Gsα在小鼠大脑皮层发育中发挥重要作用。     

六周有氧运动改善动脉粥样硬化小鼠骨骼肌氧化损伤和促进肌肉因子生成

动脉粥样硬化累及外周动脉能引起骨骼肌病变，其中氧化损伤是骨骼肌病变的重要表现，并且动脉粥样硬化也会减少有益肌肉因子的生成分泌。肌肉因子鸢尾素(irisin)、肌肉素(musclin)和BAIBA被认为参与改善动脉粥样硬化。然而，目前尚不明确动脉粥样硬化诱导骨骼肌病变的分子机制，以及有氧运动训练对其骨骼肌氧化损伤和肌肉因子生成的影响。本研究采用高脂饮食(HFD)喂食载脂蛋白E基因敲除(ApoE^-/-)小鼠12周，以建立动脉粥样硬化模型，然后观察动脉粥样硬化小鼠骨骼肌中的氧化损伤、Nrf2抗氧化信号通路以及肌肉因子鸢尾素、musclin和BAIBA生成的变化，并通过6周有氧运动观察对动脉粥样硬化小鼠骨骼肌氧化损伤的改善作用，以及鸢尾素、肌肉素和BAIBA生成的影响。ApoE^-/-小鼠在HFD喂养12周时，采用多普勒超声评估动脉粥样硬化病变，与标准饮食喂养的野生型(WT)小鼠相比，ApoE^-/-小鼠主动脉内-中膜厚度(P<0.01)、峰值血流速度(P<0.05)和阻力指数(P<0.05)显著增加，血浆甘油三酯...