明胶酶谱实验方法的优化简

目的：优化明胶酶谱实验方法,并检测不同浓度凝血酶刺激人皮肤成纤维细胞分泌的明胶酶B（MMP-9）活性的变化。方法：用含明胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分开上清中各蛋白条带,经2．5％TritonX-100洗脱、明胶酶缓冲液孵育、考马斯亮蓝染色液染色及脱色液脱色后,经光密度扫描记录,应用ImageJ软件进行密度计量分析。结果：凝血酶刺激人皮肤成纤维细胞分泌MMP一9具有浓度依赖性。结论：利用优化的明胶酶谱实验方法可做出高质量的明胶酶谱图片,对检测明胶酶活性有重要意义。     

AcSDKP对TGF-β1介导的大鼠心脏成纤维细胞MMP-1、MMP-2和MMP-9表达的调节

目的:探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的大鼠心脏成纤维细胞MMP-1、MMP-2和MMP-9调节作用。方法:建立新生大鼠的心脏成纤维细胞系,分别用Westernblot法和明胶酶谱法检测心脏成纤维细胞MMP-1和MMP-2、MMP-9酶的表达。结果:10%血清能使心脏成纤维细胞MMP-2、MMP-9和MMP-1酶的表达增加,AcSDKP能进一步增加在10%血清诱导基础上三种酶的表达。TGF-β1促进心脏成纤维细胞MMP2和MMP-9酶的表达,而下调MMP-1酶表达。AcSDKP能进一步上调由TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞MMP2和MMP-9酶的表达,并上调MMP-1酶表达。结论:AcSDKP对TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞MMP-2、MMP-9和MMP-1酶表达有促进作用。     

机械拉伸对骨髓间充质干细胞迁移行为的影响

目的:研究机械拉伸刺激对大鼠骨髓间充质干细胞迁移行为的影响并探讨其相关分子机制。方法:应用单轴机械拉伸加载装置考察不同条件的周期拉伸刺激对大鼠骨髓间充质干细胞迁移行为的影响,采用Transwell和划痕法评价细胞迁移能力,采用明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶-2,-9(MMP-2,-9)表达的变化。结果:适宜的拉伸刺激可以明显促进大鼠骨髓间充质干细胞的迁移能力,1 Hz、10%应变拉伸8 h后可以使细胞迁移数量增加到对照组的1.58倍。拉伸刺激诱导骨髓间充质干细胞基质金属蛋白酶-2,-9(MMP-2,-9)表达。抑制剂GM6001抑制了拉伸诱导的MMP-2,-9分泌增加,同时抑制了拉伸刺激对细胞迁移的促进作用。结论:机械拉伸刺激影响大鼠骨髓间充质干细胞的迁移行为,MMP-2,-9在此过程中可能起着重要介导作用。     

利用骨骼肌细胞高效表达人基质金属蛋白酶-9

为探讨利用培养的骨骼肌细胞表达人基质金属蛋白酶的可行性,利用PCR和DNA重组技术构建人mmp-9-myc-his/pcDNA3基因表达载体,转染成肌细胞QM-7,G418筛选阳性转染子.诱导细胞分化成肌管后,收集细胞培养上清.经Western印迹检测,表达产物分子量为93kD,与蛋白标准品对照推测表达量约10~15mg/L.利用Ni-NTA琼脂糖从1L培养上清中纯化到4~6mgMMP-9纯品,纯化效率约50%.经明胶酶谱检测,表达蛋白可以降解明胶.这些结果表明所表达的MMP-9具有生物活性,为以MMP-9为靶分子的特异拮抗剂和/或药物的筛选、MMP-9定量检测试剂盒的开发以及MMP-9的功能研究奠定了基础;以鹌鹑成肌细胞QM-7作为外源蛋白脊椎动物细胞表达体系具有表达量高、经济等优点,有可能进一步研究开发成为新的外源重组蛋白脊椎动物细胞表达体系.     

新城疫病毒(NDV)D90抑制口腔鳞癌细胞系迁移和侵袭的研究

目的:证明NDV D90是否具有抑制口腔鳞癌细胞系迁移和侵袭的能力。方法:免疫荧光染色法检测D90对细胞微管和微丝形态的改变;Transwell法检测D90对HN-6细胞迁移和侵袭率的抑制作用;蛋白印迹法检测D90对于SP1、RECK、MMP-2和MMP-9表达的影响;明胶酶谱法用于检测MMP-2和MMP-9活性的改变。结果:实验结果表明,D90通过改变细胞的微管和微丝形态来抑制细胞的能动性;D90具有抑制HN-6细胞的迁移和侵袭的功能。同时,D90通过下调SP1和上调RECK的表达来抑制MMP-2和MMP-9的表达和活性。结论:NDV D90能够有效地抑制口腔鳞癌细胞系HN-6的迁移和侵袭,为一种新的抗肿瘤制剂提供了临床试验基础。     

水飞蓟宾抑制人肺癌细胞浸润的作用机制研究

目的通过观察水飞蓟宾对有高转移能力的人肺癌细胞A549相关酶的作用来研究水飞蓟宾对浸润和运动性的影响。方法应用细胞活性测定、细胞浸润和运动性分析、细胞-基质黏附实验、逆转录聚合酶链反应等技术完成实验。结果A549细胞用高达100μM的不同浓度的水飞蓟宾处理一定时间后,行明胶酶谱、酪蛋白酶谱以及蛋白印迹分析来确定水飞蓟宾对金属蛋白酶-2（MMP-2）的影响。结论水飞蓟宾治疗可以浓度以及时间依存性方式减少MMP-2表达。半定量RT—PCR分析进一步表明,水飞蓟宾可在转录水平调节MMP-2表达。     

降钙素基因相关肽对LPS诱导肺泡巨噬细胞分泌MMP-9的影响

目的：探讨降钙素基因相关肽（CGRP）对经脂多糖（LPS）诱导大鼠肺泡巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的影响及其机制。方法：对经LPS诱导的大鼠肺泡巨噬细胞给予不同浓度的CGRP干预,并同时设置对照,分别收集上清液,采用明胶酶谱法测定LPS、CGRP或二者联合干预后大鼠肺泡巨噬细胞分泌MMP-9的变化。结果：①正常肺泡巨噬细胞仅分泌少量MMP-9,各浓度CGRP对其分泌无影响,但经LPS诱导后MMP-9的分泌均明显升高（P〈0．01）;②不同浓度的CGRP干预呈剂量依赖方式降低LPS诱导的肺泡巨噬细胞MMP-9的分泌（P〈0.01）。③CGRP下调LPS诱导的肺泡巨噬细胞MMP-9分泌的作用可为蛋白激酶C阻断剂H-7及钙调蛋白阻断剂W-7部分逆转（P〈0.05）。结论：CGRP可明显下调LPS诱导的大鼠肺泡巨噬细胞MMP-9活性,其机制与蛋白激酶C及钙调蛋白信号途径有关。     

白细胞介素1β抑制心肌成纤维细胞胶原合成并促进其分解

本文应用3H-胸腺嘧啶核苷(3H-thymidine, 3H-TdR)掺入法及3H-脯氨酸(3H-proline, 3H-Pro)掺入法观察白细胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)对Spague-Dawley乳鼠心肌成纤维细胞DNA及胶原合成的影响,并用明胶酶谱法和Western blot检测基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs) MMP-2、 MMP-9活性及MMP-2和MMP-9蛋白表达,用RT-PCR检测MMP-2、 MMP-9的mRNA表达.结果显示:(1)0.1、1、10、100ng/mL的IL-1β作用于细胞24h后,各组3H-TdR掺入量明显较对照组低(P<0.05, P<0.01),同时3H-Pro掺入量明显降低(P<0.05, P<0.01);而0.01ng/mL的IL-1β作用于细胞后,对3H-TdR掺入量和3H-Pro掺入量无明显影响.(2)不同剂量(0.01～100ng/mL)的IL-1β均刺激MMP-2和MMP-9活性升高,并呈剂量依赖性.IL-1β增加MMP-2和MMP-9蛋白表达(P<0.05, P<0.01).(3)IL-1β(0.01～100ng/mL)刺激MMP-2和MMP-9 mRNA表达升高(P<0.05, P<0.01).以上结果表明,IL-1β通过减少心肌成纤维细胞的细胞分裂来降低胶原的合成,同时促进MMP-2和MMP-9的转录及转录后的表达来促进胶原的分解,提示其在心肌重塑过程中起一定作用.     

六味地黄丸水提液对体外培养人牙周膜成纤维细胞增殖的影响

目的:研究六味地黄丸水提液体外培养人牙周膜成纤维细胞增殖的影响。方法:以体外培养的人牙周膜成纤维细胞为实验基础,六味地黄丸水提液分组:药物浓度为0.001、0.01、0.1、1、10mg/ml,对照组药物浓度为0mg/ml,分别作用1、2、3、4、5天。用MTT法检测六味地黄丸水提液对体外培养人牙周膜成纤维细胞增殖的影响。结果:六味地黄丸水提液在浓度0.001-0.1mg/ml范围内对人牙周膜细胞增殖有促进作用,而1、10mg/ml时对细胞增殖表现抑制作用,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论:六味地黄丸水提液在一定药物浓度范围内能够促进体外培养人牙周膜成纤维细胞增殖。     

人基质金属蛋白酶-9在酵母Pichia pastoris中的表达

基质金属蛋白酶 - 9( MMP- 9)可促进恶性肿瘤的侵袭、转移 ,并在组织重建、胚胎发育以及伤口愈合等生理过程中发挥重要作用 .为研究这一蛋白的性质 ,并以之为靶标筛选抗肿瘤转移药物 ,在酵母 Pichia pastoris中实现了重组人 MMP- 9蛋白的高效、高活性、分泌表达 .首先用 PCR扩增了 MMP- 9基因编码区 (不含信号肽序列 ) ,经测序证实后 ,将其插入 p PIC9质粒中 ,构建表达载体 .用 Li C1 - PEG法转化酵母后 ,采用明胶 -酶谱法筛选获得 5株高效分泌表达 MMP- 9的克隆 ,经PCR证实 MMP- 9基因整合在阳性克隆的染色体中 .重组蛋白分子量为 93k D,表达量为 1 0 mg/L.重组蛋白可水解明胶及 型胶原 ,并可经有机汞 APMA诱导发生自剪切 ,转换成 85k D的激活形式 ,表明重组蛋白具有与天然人 MMP- 9蛋白相似的底物水解活性和自剪切激活特性 .     

原代成人皮肤真皮成纤维细胞系的构建

目的:对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定,探讨优化的分离及纯化方法,为构建表皮-真皮皮肤模型提供种子细胞。方法:使用两步消化法提取人真皮层,酶消化法提取成纤维细胞后培养数代,对细胞进行形态学观察,HE染色,免疫细胞化学鉴定细胞标志物Vimentin,MTT法测定细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:利用倒置显微镜及HE染色,可见细胞为散在分布的壁细胞,细胞汇流时呈鱼群样或漩涡状排列,细胞在30代内形态保持不变;细胞增殖曲线大体呈S型,流式细胞仪测得细胞凋亡率分别为(8.15±0.618)%和(7.83±0.415)%。结论:优化提取真皮成纤维细胞的方法,构建2株不同年龄的真皮成纤维细胞系,为药妆研究以及重组皮肤模型的研究奠定了基础。     

艾滋病猴特异性细胞免疫的胞内细胞因子检测方法优化与应用

目的 为准确检测艾滋病猴模型特异性细胞免疫,优化、确定胞内细胞因子染色(ICS)影响因素和条件.方法 使用三种多克隆激活剂分别刺激SIV感染猴外周血单个核细胞(PBMC),确定最佳阳性刺激物和刺激时间;然后使用五种浓度SIVmac239混合肽库分别刺激SIV感染猴PBMC,体外培养,不同时间点进行细胞染色和流式检测,确定肽库的最适刺激浓度和最佳刺激时间.最后,初步应用该方法检测SIV感染猴细胞免疫水平.结果 PMA+离子霉素组合可用作本实验的阳性刺激物;2μg/mL肽库,37℃5％ CO2培养16 h,能更有效的刺激T细胞分泌TNF-α、IL-2、IFN-γ.结论 该方法的优化对艾滋病药物的临床前评价和疫苗研发等研究具有重要意义.     

中华真地鳖醇提物对人前列腺癌PC3细胞体外作用及其机制研究

探究中华真地鳖醇提物(ESWE)对人前列腺癌PC3细胞生长、迁移和侵袭的影响及作用机制。采用MTT法检测ESWE对PC3细胞的毒活性,流式细胞术、Hoechst 33258染色检测细胞凋亡情况,划痕实验和Transwell细胞侵袭实验检测ESWE对肿瘤细胞体外迁移和侵袭作用的影响,Western Blot法测定不同浓度ESWE处理PC3细胞后,转移相关蛋白金属基质蛋白MMP-2和MMP-9的表达。结果表明,ESWE对人前列腺癌PC3细胞的生长、迁移和侵袭有明显的抑制作用,呈一定的剂量依赖关系,且能下调转移相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达。流式和凋亡染色结果显示,ESWE不能诱导PC3细胞凋亡。综上说明ESWE能够抑制人前列腺癌PC3细胞的增殖、迁移和侵袭能力,其机制可能与下调MMP-2和MMP-9蛋白表达有关。     

Aurora-A高表达对食管癌细胞侵袭和 MMP-9表达的影响

目的:建立Aurora-A高表达的稳定细胞系,并探讨Aurora-A高表达对食管癌细胞侵袭和MMP-9蛋白表达与活性的影响。方法:利用脂质体法稳定转染Aurora-A表达质粒,通过Westernblot和RT-PCR鉴定Aurora-A高表达的稳定细胞系。利用细胞体外侵袭实验观察细胞的侵袭能力,并通过Western blot、ELISA和明胶酶谱的方法观察MMP-9的蛋白表达水平和活性。结果:建立了Aurora-A高表达的稳定细胞系,且Aurora-A高表达能增加食管癌细胞的体外侵袭能力,并提高了MMP-9的蛋白表达水平和活性。结论:初步阐明了Aurora-A促进食管癌细胞侵袭的作用以及分子机制,为Aurora-A可能成为治疗食管癌的有效靶点提供了依据。     

HGF基因真核表达质粒的构建及其细胞表达

目的:构建真核表达质粒p EGFP-N1-HGF并观察干细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)在人皮肤成纤维中的表达。方法:从扩增人的间充质干细胞中提取全长RNA为模板,设计合成引物,用RT-PCR法扩增出HGF基因片段,然后将HGF基因片段连接于真核表达质粒p EGFP-N1中。双酶切鉴定及测序分析后,用脂质体包裹转染体外培养的人的皮肤成纤维细胞,通过荧光显微镜观察其转染效果,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测HGF蛋白的表达。结果:经酶切鉴定及测序验证p EGFP-N1-HGF构建正确,经转染的人皮肤纤维细胞中观察到较强的绿色荧光并且可以表达一定量的HGF。结论:成功构建了真核表达质粒p EGFP-N1-HGF,为基因治疗脱发疾病提供实验基础。     

黑果腺肋花楸花色苷对人皮肤成纤维细胞紫外辐射损伤的保护作用

为了探讨黑果腺肋花楸花色苷对紫外辐射所致人皮肤成纤维细胞氧化损伤的保护作用,将体外培养的人皮肤成纤维细胞分为对照组、辐射组和辐射给药组。采用MTT法检测不同浓度花色苷添加量对细胞增殖的保护作用,以选择最优添加浓度。采用化学荧光法检测细胞活性氧(ROS)含量,ELISA法检测细胞MMP-1分泌水平。结果表明:UVA辐照剂量为10 J/cm2条件下,与辐射组相比,MTT法显示花色苷添加组浓度为125μg/m L对损伤细胞增殖保护作用有极显著的提高(P0.01),同时,125μg/m L花色苷添加组能够显著降低辐射损伤后细胞ROS含量以及MMP-1分泌水平(P0.01)。由此可见,适宜浓度的黑果腺肋花楸花色苷能够降低细胞ROS含量及MMP-1分泌水平,从而对辐射损的细胞起到一定的保护作用。     

黄酒中抑制同型半胱氨酸诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖和迁移成分探讨

目的:探索黄酒中具有抑制同型半胱氨酸(Hcy)诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和迁移作用的活性成分。方法:SD大鼠主动脉VSMCs原代细胞培养鉴定,取4~7代细胞用于实验。VSMCs分为control组、Hcy(浓度为1 mmol/L)组、低聚糖组(Hcy+黄酒低聚糖)、多肽组(Hcy+黄酒多肽)、多酚组(Hcy+黄酒多酚)、酒精组(Hcy+酒精)、黄酒组(Hcy+黄酒)共7组。MTT法检测各组VSMCs的增殖情况;划痕法和Transwell法检测各组VSMCs的迁移情况;Western blot法检测各组VSMCs中基质金属蛋白酶-2/9(MMP-2/9)、基质金属蛋白酶的组织抑制剂-2(TIMP-2)的表达情况;明胶酶谱检测各组VSMCs中MMP-2/9的活性。结果:与control组相比,Hcy组VSMCs增殖迁移增加、MMP-2/9表达和活性增加(P0.01)。与Hcy组相比,多肽组、多酚组、黄酒组VSMCs增殖迁移减少、MMP-2/9表达和活性减少(P0.05)。各组之间TIMP-2的表达没有显著差异。结论:黄酒中的多肽类和多酚类成分具有抑制Hcy诱导的VSMCs增殖和迁移的作用。     

寒冷刺激支气管上皮细胞产生外泌体促肺成纤维细胞表达气道重塑相关因子

外泌体可由多种细胞分泌,是具有多种生物学功能的细胞外囊泡,但其在气道重塑中的作用尚不明确。为探讨经寒冷刺激的人支气管上皮细胞（BEAS-2B）分泌的外泌体对人胚肺成纤维细胞(HLF1)气道重塑相关因子表达的影响,收集BEAS-2B细胞株培养液提取外泌体,利用透射电镜及Western印迹对外泌体进行其大小、形态及标志性蛋白的检测;提取的外泌体与HLF1共同培育,分别设置空白对照组、正常对照组（加入未作干预的BEAS 2B细胞所产的外泌体）及寒冷刺激组（加入经寒冷刺激后的BEAS-2B细胞所产的外泌体）。运用Real-time-PCR及Western印迹技术,分别检测各组HLF1表达FGF-2、TNF-α、MMP-9的mRNA及蛋白情况。结果显示,提取BEAS-2B细胞分泌的外泌体为直径小于100 nm的圆形或椭圆形结构,并表达外泌体标志性蛋白CD9、TSG101、ALIX;寒冷刺激组24 h后,其FGF-2、TNF-α、MMP-9的mRNA及蛋白表达均显著高于空白对照组及正常对照组（均P<0.05）。本研究结果表明,BEAS-2B细胞能够释放外泌体;经寒冷刺激后的BEAS 2B细胞所释放的外泌体可以携带并传递生物信号,诱导HLF1表达气道重塑相关因子。     

寒冷刺激支气管上皮细胞产生外泌体促肺成纤维细胞表达气道重塑相关因子北大核心CSCD

外泌体可由多种细胞分泌,是具有多种生物学功能的细胞外囊泡,但其在气道重塑中的作用尚不明确。为探讨经寒冷刺激的人支气管上皮细胞(BEAS-2B)分泌的外泌体对人胚肺成纤维细胞(HLF1)气道重塑相关因子表达的影响,收集BEAS-2B细胞株培养液提取外泌体,利用透射电镜及Western印迹对外泌体进行其大小、形态及标志性蛋白的检测;提取的外泌体与HLF1共同培育,分别设置空白对照组、正常对照组(加入未作干预的BEAS-2B细胞所产的外泌体)及寒冷刺激组(加入经寒冷刺激后的BEAS-2B细胞所产的外泌体)。运用Real-time PCR及Western印迹技术,分别检测各组HLF1表达FGF-2、TNF-α、MMP-9的mRNA及蛋白情况。结果显示,提取BEAS-2B细胞分泌的外泌体为直径小于100 nm的圆形或椭圆形结构,并表达外泌体标志性蛋白CD9、TSG101、ALIX;寒冷刺激组24 h后,其FGF-2、TNF-α、MMP-9的mRNA及蛋白表达均显著高于空白对照组及正常对照组(均P<0.05)。本研究结果表明,BEAS-2B细胞能够释放外泌体;经寒冷刺激后的BEAS-2B细胞所释放的外泌体可以携带并传递生物信号,诱导HLF1表达气道重塑相关因子。     

E1A 激活基因阻遏子促进人血管平滑肌细胞分化和迁移

为探讨 E1A 激活基因阻遏子 (cellular repressor of E1A-stimulated genes , CREG) 蛋白在人血管平滑肌细胞株 HITASY 分化和迁移中的调控作用,构建了重组逆转录病毒载体 pLNCX₂( ＋ )/CREG 和 pLXSN( － )/CREG. 以带绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein , GFP) 的空载体 pLNCX( ＋ )/GFP 和正常 HITASY 为对照,用磷酸钙共沉淀法将重组逆转录病毒载体转染 293 细胞,包装出完整的逆转录病毒后,感染 HITASY. 经 G418 筛选,获得稳定感染的细胞克隆 . 应用免疫荧光染色、蛋白质印迹等方法检测 CREG 和平滑肌分化标志蛋白α- 肌动蛋白 (SMα -actin) 表达,同时通过刮伤实验、慢速显微摄像技术检测细胞迁移能力以及用明胶酶谱方法分析细胞基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase , MMPs) 的活性 . 结果表明： pLNCX₂( ＋ )/CREG 稳定感染的 HITASY 中 CREG 和 SMα-actin 蛋白表达上调, MMP-2 和 MMP-9 活性升高,细胞迁移速度加快; pLXSN( － )/CREG 稳定感染的 HITASY 中 CREG 和 SMα -actin 蛋白表达下调, MMP-2 和 MMP-9 活性降低,细胞迁移速度减慢 . 上述研究提示 CREG 在诱导血管平滑肌细胞分化的同时促进细胞迁移 .