猪源胰酶中特异病毒和非特异病毒安全检测简

目的：对猪源胰酶样品进行病毒检测,以评价其病毒安全性。方法：非特异性病毒检测采用致细胞病变、血凝吸附试验和形态学检测方法;特异性病毒检测包括猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）和猪伪狂犬病病毒（PRV）特异性核酸检测,以及CSFV、PPV、PRV特定性抗原蛋白直接免疫荧光检测。结果：受检样品非特异性病毒检测中,未见可观察到的细胞病变产生和病毒粒子,对豚鼠、鸡和人的0型红细胞无凝集现象。特异性病毒检测中,PRRSV、CSFV、PCV、PPV、FMDV和PRV核酸检测均为阴性,CSFV、PPV、PRV免疫荧光检测均为阴性。结论：猪源胰酶样品经非特异性病毒检测和特异性病毒检测均无可检出的病毒存在。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒三型、猪流感病毒三重RT-PCR检测方法建立及初步应用

【背景】猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒三型(porcine circovirus type III,PCV3)和猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)是3种影响猪只健康的重要呼吸道病原,对养猪业造成严重的经济损失,因此需要建立高效快速的检测方法,以了解3种病原在国内的流行情况。【目的】建立能同时检测PRRSV、PCV3和SIV的三重RT-PCR方法,为3种病毒的流行病学调查和疾病监控提供技术支持。【方法】针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪圆环病毒三型(PCV3),猪流感病毒(SIV)基因序列,分别设计3对特异性引物,扩增PRRSV M和N基因(436bp)、PCV3 Cap基因(619bp)和SIV M基因(199bp)。通过对退火温度和引物浓度优化建立三重RT-PCR检测方法,并对建立的多重检测方法进行特异性、敏感性、重复性试验验证。【结果】建立了能够同时快速检测PRRSV、PCV3、SIV的三重RT-PCR方法,而对猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type II,PCV2)、猪细小病毒2型(porcine parvovirus II,PPV2)、猪细小病毒3型(porcine parvovirus III,PPV3)和猪细环病毒1型(torque teno sus virus I,TTSuV1)等6种病原的扩增均为阴性,特异性较好。敏感性结果显示,同时检测PRRSV、PCV3、SIV这3种病原的检测下限为100copies/μL,批间与批内试验结果均一致。用该方法对黑龙江省部分地区猪场的67份临床病料进行检测,结果显示PRRSV阳性率为16.5%,PCV3阳性率为10.5%,SIV阳性率为10.5%,而且存在混合感染。【结论】该方法灵敏度高、特异性强,能够应用于临床样品检测,有效预测病原的流行情况。     

猪瘟病毒C株共感染口蹄疫病毒影响口蹄疫病毒复制

【背景】猪瘟(Classical Swine Fever)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的猪高度接触性传染病,致死率极高。在临床中存在着CSFV与猪其他病原菌共感染的情况,例如CSFV与口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)的共感染。【目的】利用CSFV与FMDV共感染猪源宿主细胞,研究CSFV与FMDV共感染对FMDV病毒复制的影响。【方法】构建体外共感染细胞模型,在正常PK-15细胞上进行CSFV共感染FMDV实验,通过观察细胞病变效应(Cytopathic Effect,CPE)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、Western Blot、间接免疫荧光检测CSFV和FMDV共感染及FMDV单独感染情况下FMDV复制水平的差异。利用RT-qPCR筛选鉴定能够影响FMDV复制的CSFV蛋白。【结果】CSFVC株共感染FMDV能够抑制FMDV的复制,而且灭活的CSFV同样抑制FMDV的复制。通过筛选鉴定出CSFV的C蛋白能够抑制FMDV复制。【结论】研究发现CSFV C株共感染FMDV能够抑制FMDV复制,而其C蛋白具有抑制FMDV复制的能力。     

检测PCV2、PPV、PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法

本文建立了一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、细小病毒(PPV)、及伪狂犬病毒(PRV)疫苗株与野毒株的多重PCR方法.根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV gB、gE基因序列,针对各自保守区各设计一对特异性引物,用这四对引物对同一样品中的PCV2、PPV和PRV gB、gE进行检测,结果可同时扩增出269bp(PCV2)、581bp(PPV)、372bP(PRV gB)及147bp(PRV gE)四条特异性片段.对JEV、PRRSRV、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR能检出10pg PCV2、PPV和PRV gB、gE检测敏感度分别为10-6.2、10-3.8、10-5.8TCID50的模板.该方法的建立对临床上进行这三种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测具有重要意义.     

猪细小病毒LDR-PCR检测方法的建立和应用

为准确特异灵敏地检测猪细小病毒(PPV),建立一种新的LDR-PCR方法。首先在病毒的保守区内设计一对LDR探针,LDR探针两端各连有一段引物对应序列,以连接产物为模板进行PCR,琼脂糖凝胶电泳检测结果。以标准质粒为模板,通过对LDR反应的退火温度、连接酶浓度及探针浓度等反应条件进行优化,确定了LDR最佳的反应体系,并建立了LDR-PCR方法。结果表明,可以特异地检测PPV,与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)无交叉反应;最低检测限为102个拷贝。利用建立的方法对41例临床样本进行检测,14份样品PPV阳性,与普通PCR检测结果符合率为97.6%。     

猪圆环病毒2型的PCR检测方法应用

本研究登录Genbank对猪圆环病毒2型基因的序列进行分析,用Primer 5.0设计了ORF2基因的扩增引物,试图选择一种比较合理的PCR方法检查PCV2感染的病原,以期这种PCR方法可以有效分析猪综合征障碍病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒的扩增(HCV)、猪伪狂犬病毒(PRV)等比较常见的病原。研究结果表明,在PCV2进行扩增阳性样品检测中,发现一条异常447 bp的DNA条带,对产物测序结果进行扩增分析,证明其是PCV ORF2基因序列。敏感性检验分析表明检测样本DNA浓度时达到了9.8×10^-4ng/μL。PCR实验具有良好的稳定性和重复性。根据对66例临床病猪的分析表明,在PCV2的检测中阳性感染率是27.26%,这可能受到HCV、PRRSV、PRV、PPV等多种病毒的感染,其中混合感染的比例达到了72.23%。     

口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用纯化的口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus,FMDV)免疫BALB/C小鼠,将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用有限稀释法进行克隆,经筛选获得多株能稳定分泌抗FMDV单抗的杂交瘤细胞株。选择其中一株(2G12)用于下列实验,其细胞培养上清液的效价是1:256,腹水效价是1:1280;以自行制备的兔抗FMDV高免血清IgG为捕获抗体包被酶联免疫吸附试验微量反应板,以单抗2G12为第二抗体,建立了快速检测FMDV抗原的双抗体夹心ELISA,该方法能检出90ng病毒,而且只与FMDV发生特异性反应,与猪瘟病毒(HCV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和乙脑病毒(JEV)均不发生反应。本研究为检测口蹄疫病毒抗原提供了灵敏和特异的方法。     

检测PCV2、PPV、PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法

本文建立了一种同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、细小病毒（PPV）、及伪狂犬病毒（PRV）疫苗株与野毒株的多重PCR方法.根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV gB、gE基因序列,针对各自保守区各设计一对特异性引物,用这四对引物对同一样品中的PCV2、PPV和PRV gB、gE进行检测,结果可同时扩增出269bp（PCV2）、581bp（PPV）、372bP（PRV gB）及147bp（PRV gE）四条特异性片段.对JEV、PRRSRV、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR能检出10pg PCV2、PPV和PRV gB、gE检测敏感度分别为10^-6.2、10^-3.8、10^-5.8TCID50的模板.该方法的建立对临床上进行这三种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测具有重要意义.     

猪细小病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备猪细小病毒（PPV）杂交瘤细胞株,并对其分泌的PPV单克隆抗体进行鉴定。方法按常规方法制备并获得2株杂交瘤细胞。用染色体分析对杂交瘤细胞进行鉴定,用间接ELISA、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）和间接免疫荧光试验（IFA）对其分泌的单克隆抗体进行效价测定、亚型鉴定和特异性鉴定。结果得到2株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株2H9、1F9,染色体数目介于90～110之间。细胞上清效价均达1∶1×104,腹水效价均达1∶1×107,其亚型分别为IgG1、IgM,均为kappa链。2H9、1F9单抗与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒I型（PCV-1）、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）、乙脑病毒（JEV）等均无交叉反应。IPMA和IFA检测结果显示2H9、1F9单抗均能与接种于PK-15细胞的PPV发生特异性反应。结论成功制备了2株抗PPV杂交瘤细胞株,证实其产生的单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性。     

猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪细小病毒混合感染的流行病学调查

根据GenBank上发表的PRRSV ORF7、PPV VP2及PCV的基因组序列设计合成引物,建立了分别用于检测PRRSV、PPV和PCV的RT-PCR、PCR及复合PCR方法.应用建立的复合PCR方法对送检的127份病料进行了PCV的检测,对鉴定为PCV2阳性的67份病料再分别进行PRRSV和PPV的检测,以确定猪群中PCV2与PRRSV和/或PPV混合感染情况,结果表明,35份样品表现为PRRSV与PCV2混合感染,占样品总数的52.3%;18份样品表现为PCV2与PPV混合感染,占26.9%.另外,还有一定比例的三重感染,共5个样品,占7.5%.由此可见,猪群中PCV2与PRRSV及PPV混合感染比较普遍.     

猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪细小病毒混合感染的流行病学调查

根据GenBank上发表的PRRSVORF7、PPVVP2及PCV的基因组序列设计合成引物,建立了分别用于检测PRRSV、PPV和PCV的RT-PCR、PCR及复合PCR方法。应用建立的复合PCR方法对送检的127份病料进行了PCV的检测,对鉴定为PCV2阳性的67份病料再分别进行PRRSV和PPV的检测,以确定猪群中PCV2与PRRSV和,或PPV混合感染情况,结果表明,35份样品表现为PRRSV与PCV2混合感染,占样品总数的52．3％;18份样品表现为PCV2与PPV混合感染,占26．9％。另外,还有一定比例的三重感染,共5个样品,占7．5％。由此可见,猪群中PCV2与PRRSV及PPV混合感染比较普遍。     

双重荧光RPA扩增方法快速鉴别两种血清型水泡性口炎病毒

本研究利用重组酶聚合酶扩增(RPA)技术,根据水泡性口炎病毒印第安纳型(VSV-IND)和新泽西型(VSVNJ)相对保守的L基因为靶序列设计并筛选出两套特异性的引物和探针,建立了快速鉴别检测水泡性口炎病毒两种血清型的双重荧光RT-RPA方法。试验结果表明,该方法特异性强,与猪水泡病病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪瘟病毒(CSFV)等灭活抗原核酸无交叉反应;灵敏度高,最低可检测核酸浓度为12.7fg/μL;简便快速,反应时间短(15min),且重复性好。利用所建立方法对124份临床样品进行检测,结果与双重荧光RT-PCR一致。本文为VSV-IND和VSV-NJ的快速鉴别检测提供一种新方法,尤其适合现场检疫或基层实验室的快速检测。     

多重RT-PCR一步法技术同时检测猪瘟病毒和蓝耳病病毒方法的建立以及初步应用

猪瘟病毒和蓝耳病病毒均能导致猪繁殖障碍,对养猪生产影响很大。根据猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病(PRRS)的基因保守序列设计了2对针对这2种病毒的特异引物,并建立了多重RT-PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明能同时扩增得到2条与试验设计相符的167bp(CSFV)和320bp(PRRS)特异性条带,同时具有较好的特异性;敏感性检测结果表明,临床阳性的样品提取的核酸稀释1000倍后仍能检测出CSFV和PRRSV。本方法的建立对于这2种病毒病的早期快速检测具有十分重要的意义。     

疫苗原辅料中猪圆环病毒1型、2型和猪细小病毒PCR检测方法的建立及验证

目的 建立疫苗原辅料中猪圆环病毒1型(porcine circovirus type 1, PCV1)、2型(porcine circovirus type 2, PCV2)和猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测方法并进行验证。方法 根据NCBI公布的PCV1、PCV2和PPV基因序列设计了3对特异性引物,通过优化反应条件,建立起检测疫苗原辅料中PCV1、PCV2和PPV的PCR检测方法,并对方法的重复性、中间精密度、专属性、耐用性和检测限进行了验证。结果 PCR反应的退火温度为55℃,特异性引物浓度为10μmol/L。该方法重复性、中间精密度、专属性和耐用性均良好,对PCV1、PCV2、PPV的最低检测限分别为1 pg/μL、100 fg/μL和10 fg/μL。结论 PCR检测方法可以有效检测出疫苗原辅料中外源病毒污染情况,能为生产合格的疫苗提供质量保证。     

基于宏基因组学的猪群样本病毒探测方法的建立

极其多样的病毒广泛存在于我们周围的环境和动物体内,其中很多病毒是人类所未知的,而发现未知病毒常常受制于病毒常规检测技术的局限性.[目的]构建未知病毒检测技术平台.[方法]应用病毒宏基因组学的理念,结合新型分子诊断技术,首先利用过滤和核酸酶处理去除样品宿主核酸干扰,然后随机PCR扩增潜在的病毒宏基因组,最后通过大规模测序及序列分析获取病毒核酸信息.[结果]利用此技术我们对猪瘟病毒(CSFV)细胞培养物和猪圆环病毒2型(PCV2)感染猪病料进行了分析,分别检测到序列总长度1680 bp,占基因组13.7％的CSFV序列和序列总长度834 bp,占基因组47.2％的PCV2序列;利用此检测技术平台研究一未知病原细胞培养物,通过测序和序列分析,结果显示56条序列中有26条为副流感病毒5型(PIV5)同源序列,覆盖了其基因组全长的16.4％;此外,应用本研究建立的方法结合新一代高通量测序,我们在混合的7份病原未知的病猪组织样品中检测到了1.1％的病毒序列,包括CSFV、PCV2、猪细环病毒(TTSuV)、猪bocavirus (PBoV)和人腺病毒6型(Ad6)等的部分基因序列.[结论]本研究建立的基于病毒宏基因组学的未知病毒的检测方法突破了传统病毒研究方法的缺陷,对于猪群样本中病毒的检测具有较高的敏感性,有望为新发、突发感染性疾病的诊断和监测提供技术支持.     

PCR检测伪狂犬病病毒DNA

 根据伪狂犬病病毒 (PRV)gB基因的序列 ,设计并合成了一对引物 ,以闽A株细胞培养毒为模板 ,筛选最佳反应条件 ,建立了检测PRV的PCR方法 应用该方法对Fb、Bartha、BJ、GD、V2F4、S、S3、SR、Buk、Shope、Norden、MinkⅢ、HB、F8、F9、F12等毒株的细胞培养液进行基因扩增 ,均获得了分子量为 2 81bp的特异性目的DNA片段 ,而对Vero细胞与FMDV、SVDV、HCV、PRRSV、JEV、PPV等病毒进行检测 ,结果均为阴性 ,没有出现交叉反应 对PRV毒株扩增的产物测序 ,结果序列与文献报道一致 ,证明PCR扩增产物和方法的特异性 对 1994～ 2 0 0 0年期间送检的临床样品和保存的PRV毒种 ,用病毒分离、双抗体夹心ELISA和PCR等 3种方法进行检测 ,结果前 2种方法检测为阳性的 ,PCR检测均为阳性 ;PCR检测为阴性 ,前 2种方法检测也为阴性 ;可是 ,前 2种方法检测为阴性的 ,PCR却检测出部分阳性 ;经x2 检验 ,证明PCR检出率明显高于前 2种方法的检出率 对PRV闽A株细胞毒提取物DNA进行检测 ,其最低检出量为 15 8pg 对 1999～ 2 0 0 0年期间广东、福建、海南等省的 31个大中型猪场送检的 191份病料进行检测 .结果病料阳性率为 2 6 2 % ( 50 191) ,猪场阳性率为 71% ( 2 2 31) 实验结果表明 ,所建立的PCR技术可用于伪狂犬病的快速诊断     

戊二醛复合消毒剂对猪病病毒杀灭效果的研究

目的　研究戊二醛复合消毒剂对猪病病毒的杀灭效果。方法　将猪细小病毒 (porcinepavrovirusvirus ,PPV)、猪繁殖呼吸综合征病毒 (porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)和猪伪狂犬病病毒(porcinepseudorabiesvirus,PRV)分别与不同浓度的戊二醛复合消毒剂作用后 ,接种于长满细胞单层的细胞培养板中 ,根据细胞是否产生病变情况 ,确定消毒剂杀灭病毒的最佳浓度 ;同时 ,还将不同浓度的消毒剂与猪瘟病毒 (hogchloeravirus,HCV)作用后 ,对兔进行静脉注射 ,根据兔的体温变化情况 ,判断消毒剂杀灭病毒的最佳浓度。结果　1%浓度的消毒剂 ,可在 2 0min之内有效杀灭PPV、PRRSV和PRV ;0 5 %浓度的消毒剂 ,可在 10min之内有效杀灭HCV。结论　戊二醛复合消毒剂具有高效杀灭病毒的作用 ,适用于养殖场、医疗卫生行业及传染病流行地区的消毒灭菌 ;采用细胞感染法检测和评价消毒剂对病毒的杀灭效果是一种可行的体外试验方法     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病RT-PCR快速鉴别诊断方法的建立与临床应用

根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2基因的缺失信息,设计了3条特异性引物,以含高致病性PRRSV Nsp2基因的质粒pMDNSP2及普通PRRSV VR2332株RNA为模板,建立了快速诊断高致病性PRRSV RT-PCR方法.通过对临床组织病料的总RNA进行不同稀释倍数检测,结果表明该方法能从0.265 pg的总RNA中检测到PRRSV的基因,说明敏感性高.用该方法对猪瘟病毒(CSFV)、Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)、伪狂犬病病毒(PRV),链球菌(Streptococcus)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)和大肠杆菌(Escherichia coli)同条件检测,结果都为阴性.进一步对36份疑似高致病性PRRSV临床组织病料细胞培养物、2株PRRSV商品活疫苗以及52个猪场所送检的184份临床样品进行了检测应用,结果36份疑似高致病性PRRSV临床组织病料的细胞培养物有5份样品为阳性且都为高致病性PRRSV,2株PRRSV商品活疫苗为普通PRRSV,52个猪场中有42个猪场(123份样品)呈阳性,其中只有1份为普通PRRSV.实验表明该方法能够准确地鉴别诊断高致病性PRRSV和普通PRRSV,且具有快速,敏感和特异的特点,具有临床实用性.     

多重PCR检测PRV、PPV、PCV方法的建立及其应用

根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病病毒(PRV)的gE、gI基因序列、猪细小病毒(PPV)的E蛋白的基因序列、II型猪圆环病毒(PCV-2)的ORF2基因序列,分别设计并合成3对能特异性扩增PRV、PPV、PCV-2的引物,通过DNAstar软件分析这3对引物不存在cross d im er。建立了PCR方法分别检测PRV、PPV、PCV-2,然后通过条件的优化,建立了PCR同时检测PRV、PPV、PCV-2的方法并研制出试剂盒。对试剂盒的特异性和有效期进行了研究。结果表明,该试剂盒具有很好的特异性,有效期在-20℃至少可以保存1年。     

环介导间接PCR鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒方法的建立

建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)环介导间接PCR检测方法,用于该病毒的感染检测和高致病性毒株与低致病性毒株的鉴别诊断。根据GenBank数据库中PRRSV中国流行株ORF7和ORF1a基因序列的保守性,设计2对特异性探针,分别标记于大豆Lectin基因两端,作为报告基因,经过一步链置换反应后,采用反向PCR扩增报告基因,建立PRRSV环介导间接PCR检测方法,该方法扩增HP-PRRSV可得大小为193bp和355bp的特异片段,扩增LP-PRRSV可得大小为193bp和442bp的特异片段。试验结果表明,该方法能成功鉴别HP/LP-PRRSV,可检测出5.6TCID50/mL LP-PRRSV和18TCID50/mL HP-PRRSV的病毒RNA,HP/LP-PRRSV混合感染不影响检测灵敏度,与CSFV、PPV、PRV、PCV2、ETEC和Haemophilus parasui等常见猪源性病原的检测无明显交叉反应;对20份临床样本进行比较检测,环介导间接PCR检测出14份PRRSV阳性样本,其中4份LP-PRRSV、9份HP-PRRSV和1份LP/HP-PRRSV,与常规PCR检测结果一致。环介导间接PCR是一种简便快速、灵敏、特异的病原学诊断工具,适合PRRSV感染的快速检测和HP/LP-PRRSV鉴别诊断,尤其适合HP/LP-PRRSV混合感染的鉴别。