Toll样受体5激动剂CBLB502-Fc融合蛋白的表达纯化及初步鉴定

目的:构建Toll样受体5激动剂CBLB502-Fc融合蛋白的真核表达载体,并在CHO细胞中表达,纯化得到具有生物学活性的目的蛋白。方法:首先从合成的pUC57-CBLB502质粒中扩增出CBLB502基因片段,酶切后克隆至pUC57-Fc质粒中,然后双酶切pc DNA3.1和pUC57-CBLB502-Fc,将CBLB502-Fc基因片段克隆至载体pc DNA3.1,挑选阳性克隆并测序,再将重组质粒转染CHO细胞,筛选高表达细胞系,用免疫印迹鉴定表达情况,Protein A亲和柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE鉴定目的蛋白,用小鼠辐射试验初步验证目的蛋白的生物学活性。结果:构建了pc DNA3.1-CBLB502-Fc真核表达载体;转染CHO细胞,筛选得到CBLB502-Fc高表达细胞系,并经免疫印迹鉴定培养上清;纯化得到较高纯度的融合蛋白并经SDS-PAGE鉴定;小鼠辐射实验表明CBLB502-Fc具有抗辐射作用。结论:真核表达并纯化了具有抗辐射作用CBLB502-Fc融合蛋白,为后续研究CBLB502-Fc的生物学功能奠定了重要基础。     

人乳头瘤病毒l6型E6-E7融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的构建人乳头瘤病毒l6型(HPV16)E6-E7融合蛋白真核表达载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E6-E7基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7,双酶切及测序鉴定。将质粒转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E6-E7基因在HeLa细胞中的表达。提取质粒免疫小鼠,利用免疫组化方法检测在其肌肉组织中的表达。结果成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7;在转染pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7的细胞中检测到HPV16 E6-E7基因。在免疫该质粒的小鼠肌肉组织中可以检测到该质粒的蛋白表达。结论成功的构建的了真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7,该载体能在HeLa细胞内以及小鼠骨骼肌细胞内有效表达。     

NAMPT 真核表达载体构建及其对肝癌细胞增殖的影响

目的:为探索烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)对肝癌细胞增殖的影响,构建pc DNA3.1(+)-NAMPT真核表达载体。方法:以正常肝细胞的c DNA为模板,通过PCR扩增得到NAMPT全长序列,经酶切、连接、转化等步骤构建真核表达载体。重组质粒经酶切鉴定及测序验证后,用脂质体转染法转染肝癌细胞MHCC-97H和正常肝细胞HL-7702,免疫印迹检测NAMPT蛋白表达情况;WST实验检测过表达NAMPT后对MHCC-97H和HL-7702增殖的影响。结果:真核表达载体pc DNA3.1(+)-NAMPT构建成功,转染HL-7702和MHCC-97H细胞后,NAMPT蛋白表达水平较空白组分别升高了83%和180%;过表达NAMPT可促进细胞增殖,而抑制NAMPT活性后,细胞增殖被抑制(P0.001)。结论:成功构建了真核表达载体pc DNA3.1(+)-NAMPT,并发现NAMPT表达水平与细胞增殖密切相关,为进一步探索NAMPT表达在肝癌细胞增殖的分子作用机制和筛选新的肿瘤药物靶点奠定了基础。     

人p65真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建带Myc标签的人p65真核表达载体,对其在人宫颈癌He La细胞中的定位进行检测,并研究p65对核因子κB(NF-κB)转录活性的影响。方法:构建带Myc标签的p65真核表达载体pc DNA3.1-Myc-p65,质粒测序验证正确后脂质体法瞬时转染人胚肾HEK293T细胞,Western印迹鉴定p65的表达;细胞免疫荧光实验检测p65的亚细胞定位;重组质粒与NF-κB-Luc报告基因质粒共转染HEK293T细胞,加TNFα刺激后检测萤光素酶报告基因的活性。结果:测序结果证实pc DNA3.1-Myc-p65真核表达载体构建成功;脂质体法转染HEK293T细胞后检测到Myc-p65蛋白的表达;细胞免疫荧光实验显示Myc-p65蛋白定位于He La细胞的细胞质中,当加入TNFα刺激后大部分Myc-p65蛋白进入细胞核;萤光素酶活性检测结果显示,提高细胞内p65水平或加入TNFα刺激均可明显激活NF-κB信号通路的活性。结论:构建了带Myc标签的p65真核表达载体,并使其在HEK293T细胞中表达;正常情况下,Myc-p65蛋白定位于宫颈癌He La细胞的细胞质中,TNFα促进Myc-p65入核;Myc-p65能够以TNFα不依赖的方式激活NF-κB信号通路。pc DNA3.1-Myc-p65真核表达载体的构建,为进一步筛选NF-κB的相互作用蛋白及功能研究奠定了基础。     

小鼠IL-27真核表达载体的构建及其在RAW264.7 细胞中的表达

目的:构建小鼠白介素27(Interleukin 27,IL-27)单链融合基因的真核表达载体并检验其在RAW264.7细胞中的表达情况。方法:提取小鼠脾细胞总RNA,通过RT-PCR扩增出小鼠EBI3和p28 c DNA。采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)通过编码疏水性多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列连接小鼠EBI3和p28基因片段,构建小鼠IL-27单链融合基因(mouse single chain IL-27,msc IL-27),并将其克隆至pc DNA3.1(+)载体。通过酶切和测序鉴定阳性重组载体,将重组质粒pc DNA3.1-IL-27通过脂质体转染法转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果:测序分析表明,小鼠IL-27单链融合基因中EBI3、linker和p28的连接顺序、方向及碱基序列与预期相符。在转染后的RAW264.7细胞中检测到了小鼠IL-27 m RNA的表达。结论:成功构建了小鼠IL-27单链融合基因及其真核表达载体,并在RAW264.7细胞中实现表达,为进一步探讨IL-27的生物学功能奠定了基础。     

人snail真核表达载体构建与鉴定

目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定。方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长c DNA,经Bam H I、Eco R I双酶切、连接,插入pc DNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达。结果:pc DNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBI Gen Bank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高。结论:成功构建pc DNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础。     

pcDNA3.1-Pax6载体的构建及其对胶质瘤细胞增殖的影响

目的:构建pc DNA3.1-Pax6过表达质粒并观察其对胶质瘤U251细胞增殖的影响。方法:以K562细胞c DNA为模版,采用RT-PCR的方法扩增Pax6基因,将扩增产物酶切回收后与同样酶切回收的真核表达载体pc DNA3.1连接、转化,构建pc DNA3.1-Pax6重组质粒,再经菌落PCR、酶切及测序鉴定重组质粒;利用脂质体lipofectamine 2000转染重组质粒至U251细胞。Real-time PCR检测Pax6 mRNA的表达水平,Western blot检测PAX6蛋白的表达,MTT法检测U251细胞增殖。结果:PCR扩增获得长度为1 131 bp的阳性产物,经pc DNA3.1真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pc DNA3.1-Pax6构建成功;Real-time PCR结果显示,Pax6过表达后的U251细胞Pax6 mRNA表达水平明显高于正常对照组;Western blot结果显示,PAX6蛋白表达亦明显高于正常对照组,差异具有统计学意义(P0.05);MTT结果显示,与正常对照组细胞比较,转染pc DNA3.1-Pax6组的细胞,细胞增殖能力明显降低,差异亦具有统计学意义(P0.05)。结论:成功构建人Pax6基因的pc DNA3.1-Pax6重组质粒,过表达Pax6基因抑制U251细胞的增殖。     

柔嫩艾美耳球虫保守蛋白CHP559基因克隆与真核表达

为构建柔嫩艾美耳球虫保守蛋白Et CHP559基因的真核表达重组质粒pc DNA3.1-flag-Et CHP559,并转染DF-1细胞进行表达。利用5'RACE技术克隆获得了柔嫩艾美耳球虫Et CHP559基因全长c DNA序列,该基因全长为1 746 bp,ORF为104-1 327 bp,编码407个氨基酸,编码蛋白的分子量约为46 k D,并利用生物信息学分析该基因编码蛋白的性质、结构等特征,发现该蛋白含有跨膜结构和信号肽。通过RT-PCR扩增得到含完整开放阅读框的基因片段,并将其与真核表达载体pc DNA3.1-flag连接,构建了真核重组表达质粒pc DNA3.1-flag-Et CHP559,所构建的真核重组表达质粒pc DNA3.1-flag-Et CHP559经过PCR和双酶切鉴定,可见一条大小约为1 224 bp的目的条带;重组质粒转染DF-1细胞后,免疫印迹检测可见大小约为47 k D的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验显示在DF-1细胞中检测到绿色荧光。这些研究结果表明已成功获得了Et CHP559的全长序列,并成功构建了Et CHP559的真核重组表达质粒,在真核细胞DF-1中获得表达,为深入研究Et CHP559的功能奠定了基础。     

HBV PreS2＋S／INF—α融合基因真核表达载体的构建及其表达

构建含HBV PreS2 S和INF-α融合基因的真核表达载体HBV PreS2 S/INF-α并在真核细胞中进行表达,应用重叠延伸剪切技术（splicing by overlapping extension,简称SOE）经两次PCR获得嵌合基因片段S2S／IFN－α,回收后直接克隆到pcDNA3.1 V5/His TOPO TA克隆载体,得到真核重组载体pcDNA3.1.S2S/IFN-α然后用指质体法转染Vero E6细胞。对重组载体进行了限制性酶切及PCR鉴定证明连续正确;经间接免疫荧光检测证实该重组载体能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。真核表达载体pcDNA3.1.S2S/IFN-α成功构建及在Vero E6细胞中的有效表达,为进一步探讨HBV感染的特异性免疫治疗提供了实验依据。     

人LC3B基因的真核表达及鉴定

目的:构建带HA标签的重组人LC3B基因的真核表达载体,获得HA-LC3B融合蛋白,并初步检测其生物学功能。方法:从人乳腺文库中通过PCR技术扩增LC3B基因编码序列,将其插入pc DNA3.0-HA载体,获得HA-LC3B真核表达载体;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测转染细胞的表达情况,免疫共沉淀实验证实其生物学活性。结果:双酶切和测序结果表明HA-LC3B真核表达质粒构建成功,Western印迹表明重组质粒转染293T细胞后获得表达;免疫共沉淀实验显示HA-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白相互作用,具有较好的生物学活性。结论:在真核表达系统中表达了带HA标签的人LC3B,为进一步研究细胞自噬奠定了基础。     

hAng-1真核表达载体的构建及其在MSCs中的表达

目的:通过基因重组技术,构建人血管生成素-1(human angiopoietin 1,hAng-1)真核表达载体体系,并将其转染至大鼠的骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)内进行培养,进而验证hAng-1的表达.方法:将hAng-1编码序列(互补脱氧核糖核酸)通过酶切,插入至pcDNA3.1(+)质粒的多克隆位点,构建质粒pcDNA 3.1 (+)/hAng-1真核表达质粒;重组质粒经脂质体介导转染鼠MSCs.应用逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)等方法检测hAng-1的表达情况.结果:pcDNA 3.1 (+)/hAng-1真核表达质粒转染鼠MSCs后,应用流式细胞仪检测,转染效率约为15％.同时应用RT-PCR能够检测出目的基因mRNA,Western blot能够检出hAng-1的蛋白表达.结论:本实验通过基因重组技术,构建的pcDNA3.1 (+)/hAng-1真核表达载体能够在转染的鼠MSCs中表达,且表达较为持续,为hAng-1基因应用于基因治疗的研究奠定了基础.     

IκBα缺失突变体真核表达载体的构建、表达及其生物活性检测

旨在构建缺失N端前36个氨基酸的IκBα突变体真核表达载体,并对其表达及生物学活性进行检测.从人源子宫颈癌细胞HeLa中提取总RNA,利用RT-PCR的方法获得IκBα缺失突变体的cDNA,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1/myc-His A中,构建重组载体pcDNA3.1-IκBαΔN.通过PCR方法、NcoⅠ酶切以及核酸测序分析对其进行鉴定;采用Western Blot检测IκBα缺失突变体蛋白在HeLa细胞中的表达.将pcDNA3.1-IκBαΔN和pNF-κB-Luc共转染 HeLa细胞,经TNF-α诱导后,利用萤光素酶报告系统来检测重组载体对NF-αB的抑制活性.结果表明,经PCR方法、NcoⅠ酶切鉴定及核酸测序分析后,证实成功构建了重组载体pcDNA3.1-IκBαΔN;IκBα缺失突变体蛋白在HeLa细胞中高效表达,并对NF-κB有显著的抑制活性(P＜0.01).因此,真核表达载体pcDNA3.1-IκBαΔN构建成功,为一步研究NF-κB信号传导通路及其相关疾病提供有效的分子工具.     

SUSD2基因真核表达载体构建及其在H322细胞中表达

[目的]构建SUSD2基因真核表达载体,并观察其在真核细胞H322细胞中的表达。[方法]从H322细胞中提取总RNA并逆转录为c DNA,采用PCR技术扩增出含有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的人SUSD2基因片段,以质粒pc DNA3.1为表达载体,构建重组质粒pc DNA3.1-SUSD2。采用PCR、双酶切鉴定以及测序验证c DNA片段大小和序列正确。将重组载体pc DNA3.1-SUSD2转染H322细胞,Western Blot法检测SUSD2蛋白的表达。[结果]PCR、双酶切鉴定以及测序结果显示pc DNA3.1-SUSD2包含大小、序列正确的SUSD2片段;Western Blot结果显示SUSD2蛋白在转染pc DNA3.1-SUSD2的H322细胞中表达高于转染pc DNA3.1的H322细胞。[结论]成功获得SUSD2基因全长序列,并成功构建SUSD2基因真核表达载体,有效地在非小细胞肺癌细胞株H322中表达,为进一步研究该基因功能及机制奠定了基础。     

CD20抗体亲和力和免疫原性的改造及表达

[目的]构建较高亲和力较低免疫原性的CD20抗体。[方法]通过专利分析,进行高亲和力和人源化的设计改造,将抗体的轻链和重链分别克隆到pc DNA3.1/ZEO(+)、pc DNA3.1(+)真核表达载体中,共转染中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1,通过RT-PCR检测mRNA的转录,夹心ELISA检测抗体表达量,流式细胞术检测细胞上清与CD20阳性细胞Raji的结合活性。[结果]得到了高亲和力的人源化CD20抗体的轻链和重链基因片段,并成功地构建了重组表达载体pc DNA3.1/ZEO(+)-CD20L和pc DNA3.1(+)-CD20H,并可在CHO-K1细胞中表达,通过RT-PCR证明基因在CHO细胞中成功表达,ELISA法测得培养上清的含量在0.45~4.72μg/m L之间,流式检测表明上清中的抗体可与Raji细胞结合。[结论]成功构建并表达筛选了17株单克隆抗体,15号的表达量最大,为4.72μg/m L,为下一步研究抗体的亲合力、免疫原性以及生物学功能打下基础。     

活化型及失活型SUMO1真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建活化型及失活型SUMO1(small ubiquitin-related modifier 1)真核表达载体并鉴定其蛋白活性。方法:以野生型HA-SUMO1-pc DNA3.1为模板,采用PCR扩增目的基因,将其连接入克隆载体T vector,筛选阳性重组子;将目的基因酶切回收后亚克隆入真核表达载体pc DNA3.1。将阳性克隆转染HEK293细胞,免疫印迹鉴定底物蛋白与SUMO1的结合情况(即SUMO化水平)。结果:活化型及失活型SUMO1目的基因被扩增,并且亚克隆入pc DNA3.1,且测序结果与预期一致。免疫印迹分析显示,转染活化型SUMO1组检测到显著的蛋白SUMO化条带,而失活型组则无明显条带。结论:活化型及失活型SUMO1真核表达载体成功构建,并可于HEK293细胞高效表达。     

人星状病毒非结构蛋白基因nsP1a/1真核表达载体构建及其在293T细胞中的表达

目的将人星状病毒非结构蛋白ns P1a/1基因连接到真核表达载体上,转染人胚肾上皮细胞48 h后检测其表达。方法设计特异性引物PCR扩增人星状病毒非结构蛋白ns P1a/1片段,分别插入真核表达载体pc DNA3.1(+)和p EGFP-N2载体,构建重组表达质粒pc DNA3.1(+)-ns P1a/1-His和p EGFP-N2-ns P1a/1。在转染试剂PEI的介导下将重组表达质粒分别转染293T细胞,转染48 h后分别在荧光显微镜下观察EGFP的表达以及通过Western blot检测ns P1a/1基因的表达。结果重组表达质粒pc DNA3.1(+)-ns P1a/1-His和p EGFP-N2-ns P1a/1构建成功;转染p EGFP-N2-ns P1a/1后48 h能够在荧光显微镜蓝色激发光下观察到较强的黄绿色荧光;转染pc DNA3.1(+)-ns P1a/1-His后48 h收集细胞进行Western blot检测,能够检测到ns P1a/1-His融合报告基因的表达。结论成功构建了人星状病毒非结构蛋白ns P1a/1基因真核表达质粒,并在人胚肾上皮细胞293T细胞获得表达,为进一步深入研究ns P1a/1在人星状病毒抵御宿主细胞抗病毒天然免疫中是否发挥作用奠定了基础。     

SARS病毒s1基因片段真核表达载体的构建及免疫效果

本研究根据GenBank登录的BJ01株SARS-CoV序列合成801bpS1基因片段,该片段被亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)得到重组质粒pcDNA3.1(+)/S1;转染Hela细胞,SDS-PAGE、Western-Blotting鉴定蛋白表达;肌注免疫BALB/c小鼠,利用ELISA法检测免疫后小鼠的抗SARS/CoVIgG及IFN-γ水平,MTT法检测T细胞增殖活性.结果显示,重组质粒pcDNA3.1(+)/S1可在Hela细胞内表达S1蛋白,免疫后小鼠的T细胞增殖活性增强,抗SARS-CoVIgG与IFN-γ水平升高.本实验说明pcDNA3.1(+)/S1可诱导小鼠产生一定的体液免疫和细胞免疫应答.     

HBV PreS2+S/IFN-α融合基因真核表达载体的构建及其表达

构建含HBV PrdS2+S和IFN-α融合基因的真核表达载体pcDNA3.1.S2S/IFN-α并在真核细胞中进行表达.应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension,简称SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段S2S/IFN-α,回收后直接克隆到pcDNA3.1 V5/His TOPO TA克隆载体,得到真核重组载体pcDNA3.1.S2S/IFN-α.然后用脂质体法转染Vero E6细胞.对重组载体进行了限制性酶切及PCR鉴定,证明连接正确;经间接免疫荧光检测证实该重组载体能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白.真核表达载体pcDNA3.1.S2S/IFN-α的成功构建及在Vero E6细胞中的有效表达,为进一步探讨HBV感染的特异性免疫治疗提供了实验依据.     

转基因小鼠模型的载体构建和在人肝癌HepG2细胞中的表达

目的:构建转基因小鼠模型的载体并检测在人肝癌HepG2中的表达效果.方法:将n-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因fat-1插入到真核表达载体(pcDNA3.1(+)myc-HisA)中,构建重组表达载体pcDNA3.1(+)myc-His A-fat-1,用脂质体介导的方法转染到人肝癌HepG2细胞中,RT-PCR检测fat-l基因的表达,MTT法分析fat-l基因对HepG2细胞增殖的影响,气相色谱分析检测fat-l基因对HepG2细胞n-6/n-3多聚不饱和脂肪酸(PUFAs)比例的影响.结果:成功地构建了真核表达裁体peDNA3.1(+)myc-HisA-fat-1,并能在HepG2细胞内有效异源表达.48h后可检测到fat-l mRMA的条带.与对照细胞相比,fat-l基因有效地抑制了人肝癌细胞HepG2细胞的增殖(70%,p＜0.01),降低了n-6/n-3 PUFAs比例.结论:pcDNA3.1(+)myc-His A-fat-l重组载体构建成功并能在肝癌细胞中有效的表达,可以作为下一步转基因小鼠的合适载体.     

人自噬相关基因5真核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建带Flag标签的自噬相关基因5(ATG5)的真核表达载体,获得Flag-ATG5融合蛋白。方法:以人乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增人ATG5编码序列,将其插入pc DNA3-Flag载体,转染人胚肾293T细胞后,Western印迹检测其表达情况;将该重组质粒与ATG12表达质粒共转染293T细胞,通过免疫共沉淀法检测2个蛋白的相互作用。结果:Flag-ATG5真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后融合蛋白获得表达,其相对分子质量约33×103;Flag-ATG5可与Myc-ATG12结合。结论:构建了带Flag标签的人ATG5真核表达载体,为进一步研究ATG5在自噬中的功能奠定了基础。