全基因组扩增技术及其在法医个体识别中的应用

全基因组扩增(Whole genome amplification,WGA)技术是一种对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术。近几年来,对WGA技术扩增痕量DNA检材的研究日渐深入,这些研究可望用于刑案现场采集到的痕量DNA样品的扩增,为法医个体识别提供足量的DNA模板。然而,对实际案件中复杂检材的扩增偏差问题一直困扰着法医工作者,寻求一个低扩增偏差、高扩增产率的WGA技术是法医工作者的主要目标。文章综述了WGA技术在法医个体识别中的研究进展及应用前景,为法医解决扩增偏差问题提供参考。     

一种新的线粒体基因组DNA捕获探针的制备及初步应用

目的:建立新的线粒体基因组DNA杂交捕获探针制备方法并用进行初步应用。方法:通过PCR技术扩增特异线粒体DNA片段,并与生物素偶联,最后与标记磁珠的亲和素混合获得捕获探针。并自行制备的线粒体基因组DNA文库捕获探针与肝癌全基因组测序文库进行液相杂交。分离捕获产物后PCR扩增并进行测序分析。结果:成功建立了线粒体基因组杂交捕获探针制备方法并成功分离线粒体基因组DNA;对测序数据的分析显示:90%以上测序数据来自线粒体基因组DNA,且覆盖率达到100%,且均一性良好。检测到的同质性变异位点数量和异质性变异位点数量与全基因组测序数据产生的结果接近(P=0.9152,P=0.8409)。结论:新方法制备的线粒体基因组DNA杂交捕获探针可以从全基因组文库中高效捕获线粒体基因组DNA测序文库。     

用于分析土壤微生物结构变化规律的变性梯度凝胶电泳条件研究

研究确定土壤微生物基因组DNA提取方法、PCR扩增条件、DGGE电泳条件,为进一步研究分析土壤中微生物结构变化规律提供理论依据。土壤微生物基因组DNA提取采用直接法和间接法进行比较; PCR扩增条件调整扩增体系、DGGE电泳条件调整变性剂范围,并对其结果进行比较分析。通过对DGGE电泳相关条件的研究,结果显示,土壤中粗基因组DNA采用直接法提取,然后进行纯化; PCR扩增体系中加入BSA,DGGE电泳系统组成中变性剂浓度范围为35%～55%。确定了土壤微生物基因组DNA提取方法、PCR扩增条件、DGGE电泳条件,为后续的相关研究提供理论依据。     

不同单细胞全基因组扩增方法的比较及MALBAC在辅助生殖中的应用

单细胞全基因组扩增(whole genome amplification, WGA)是指在单细胞水平对全基因组进行扩增的新技术,其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增,获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序,用于揭示细胞异质性。目前,WGA方法主要包括引物延伸预扩增(primer extension preamplification PCR, PEP-PCR)、简并寡核苷酸引物PCR (degenerate oligonucleotide primed PCR, DOP-PCR)、多重置换扩增(multiple displacement amplification, MDA)、多次退火环状循环扩增(multiple annealing and looping-based amplification cycles, MALBAC)等。本文对不同的单细胞WGA方法的原理及应用情况分别进行了阐述,并对其扩增效率进行评价和比较,包括基因组覆盖度、均一性、重现性、SNV (single-nucleotide variants)和CNV (copy number variants)检测力等。综合对比不同单细胞WGA方法后发现,MALBAC的扩增均一性最高、等位基因脱扣率最低、重现性最好,且对于CNV和SNV的检测效果最好。本文还阐述了MALBAC技术在人类单精子减数重组、非整倍体分析以及人类卵细胞基因组研究中的应用。     

烟粉虱全基因组DNA四种提取方法的比较

获得大量、高质量的全基因组DNA是在DNA水平上研究许多生物的分子机制的基本前提。微小昆虫由于其体型微小,单头提取DNA浓度低,无法满足部分试验所需。为寻找一种方便、快捷、高效的全基因组提取方法,参考国内外单头微小昆虫基因组DNA提取常用方法,以烟粉虱为研究材料,选取醋酸钾(KAc)法、盐析法、氯仿-异戊醇法和苯酚提取法四种方法进行多头烟粉虱的全基因组DNA提取。通过微量核酸蛋白分析仪、基因组DNA直接琼脂糖凝胶电泳、甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳对DNA样品进行检测,比较提取DNA的产量、质量,并综合分析各提取方法所需时间及所用试剂的毒性大小。结果表明,盐析法提取的DNA平均浓度为521 ng/μL,纯度能满足分子检测要求,用MSAP引物能得到较好的扩增结果,相比其它方法,盐析法更简便、快速且无毒。因此盐析法是多头烟粉虱全基因组DNA提取的最佳方法。     

猪链球菌2型全基因组DNA芯片的研制及基因表达谱技术平台的建立

目的：研制猪链球菌2型（SS2）全基因组DNA芯片,建立SS2基因表达谱技术平台。方法：利用SS2全基因组序列,挑选出2194条基因,经PCR扩增出2156条基因并将产物纯化,点样制备芯片;将芯片用于表达谱研究,采用实时定量PCR验证表达谱结果,对芯片进行可靠性分析。结果：芯片杂交数据与实时定量PCR验证显示了较高的相关性,二者相关系数r=0.87。结论：研制了一批SS2全基因组DNA芯片,并建立了基于DNA芯片的表达谱技术平台。     

单细胞全基因组扩增技术与应用

同一组织中的细胞往往具有类似的结构和功能,然而通过对单个细胞进行测序分析后,发现每个细胞都具有一定异质性.单细胞全基因组扩增技术是进行单细胞测序的前提,该技术可用于揭示单细胞基因组结构差异,同时在肿瘤研究、发育生物学、微生物学等研究中发挥重要作用,并成为生命科学研究技术的热点之一.单细胞全基因组扩增技术的难点在于单细胞的分离和全基因组的扩增.本文介绍了单细胞全基因组扩增技术中常用的单细胞分离技术和单细胞全基因组扩增技术,并对各技术间的优缺点进行比较,同时着重讨论该技术在肿瘤研究、发育生物学和微生物学研究中的应用.     

基于高通量测序技术检测全基因组DNA甲基化水平的方法

DNA甲基化的研究最近几年一直是表观遗传学研究的重点。有关DNA甲基化水平检测的方法大体上有十几种,随着第二代测序技术的发展,实现了在全基因组水平上对甲基化状态进行检测。目前,基于第二代高通量测序进行全基因组DNA甲基化水平检测的方法主要有BSP-seq(亚硫酸氢盐修饰结合直接测序法)、Me DIP-seq(甲基化DNA免疫共沉淀测序法)、MBD-seq(甲基化DNA富集结合高通量测序法)。就这3种方法在原理、流程、优缺点、优化使用及后期需要用到的部分生物信息学资源等方面的研究进展作一综述,旨在为研究者在采用高通量测序方法研究DNA甲基化模式时提供一些思路。     

滚环扩增技术的原理及其应用的研究

滚环扩增是近年来发展起来的一种恒温核酸扩增方法。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA,还可以实现对靶核酸的信号放大,灵敏度达到一个拷贝的核酸分子,因此,RCA技术在全基因组扩增、单核苷酸多态性、DNA芯片、蛋白质芯片等方面检测中具有很大的应用价值和潜力。     

Bst DNA聚合酶大片段在全基因组扩增中的应用

Bst DNA聚合酶大片段作为一种常用的DNA聚合酶,因其独特的特点:能引发链置换反应、高保真、耐高温等,而成为一种重要的DNA多重置换扩增酶。目的:为减少成本,设计一种高产,方便且扩增活性高的Bst DNA聚合酶大片段表达体系;探究该酶应用于胃癌石蜡包埋组织基因组DNA的扩增条件。方法:采用p TWIN1质粒作为载体克隆表达Bst DNA聚合酶大片段,应用几丁质亲和层析柱纯化该酶,使用该酶对人类基因组DNA进行不同温度下扩增,探究其最适反应温度,并据此对胃癌石蜡包埋组织基因组DNA进行扩增。结果:由此得到的Bst DNA聚合酶大片段能运用于胃癌石蜡包埋组织基因组DNA的扩增,扩增效率可达200倍,并能应用于a CGH芯片。结论:扩增得到保真性高,覆盖基因组范围大的DNA扩增产物。该应用与a CGH结合,使得对少量的癌症石蜡包埋组织DNA样本进行全基因组扩增,并进行其基因拷贝数变异研究成为可能。     

SNP与基因检测及表达中的RCA技术

滚环扩增(rollingcircleamplification,RCA)技术是一种新的分子生物学检测方法。该方法不仅可以在体外等温条件下对核酸进行高度特异性的检测,而且还可通过线性或指数扩增来进行信号级联放大,其灵敏度能达到1个拷贝的核酸分子,因此,可用于痕量分子的检测。目前,滚环扩增技术广泛应用于全基因组DNA检测、核酸测序、单核苷酸多态性、DNA芯片及蛋白质芯片分析等领域。     

线粒体基因组的高通量测序策略

综述了高通量测序技术在线粒体全基因组测序中的策略,利用该技术对线粒体全基因组进行序列测定的方法可以归纳为两种,一种是先对目标mt DNA进行富集,包括mt DNA的提取纯化,目标区域PCR扩增法以及特异性探针杂交富集法(可分为基于微阵列和基于PCR探针的杂交富集法),然后对富集出的线粒体DNA进行高通量测序;另一种是先从待测样本的基因组高通量数据中挖掘出线粒体基因组序列信息,之后利用诱饵序列或者近缘物种的线粒体全基因组参考序列,使用软件MITObim对其进行组装。此外,还给出了线粒体高通量测序的优化流程图和介绍了混合样品的线粒体高通量测序策略。     

建立快速、特异检测ApoE4基因型方法

目的:建立快速、特异检测载脂蛋白E(ApoE)基因型的方法.方法:采用碱裂解法抽提漱口水来源的颊粘膜上皮细胞的基因组DNA;优化各种改善高GC含量的的添加剂种类和浓度,包括二甲亚枫、甘油、甲酰胺、甜菜硷等,PCR产物进行HhaI酶切并DNA垂直电泳从而分析个体的ApoE基因型.结果:漱口水来源的基因组DNA能替代外周血DNA进行PCR扩增.甜菜碱、甲酰胺、甘油等对于ApoE4基因的扩增效果并不明显,而5%DMSO能显著提高ApoE4基因的扩增效率,并显著提高PCR扩增的特异性.结论:无创的简单的ApoE4基因分型被建立,极大易化了对ApoE4相关疾病的分子流行病的研究,对于其它基因的基因型研究提供有益的线索.     

霍乱弧菌分型噬菌体VP3基因组序列的测定与分析

测定和分析霍乱弧菌分型噬菌体VP3基因组序列,并为ElTor型霍乱弧菌两类菌株的分型方法原理提供研究基础。鸟枪法构建VP3噬菌体全基因组随机文库;测序拼接成最小重叠群,引物步移法填补缝隙序列,拼接后获得VP3全基因组序列。PCR随机扩增噬菌体DNA片段并酶切鉴定;预测可能存在的开放读码框(ORF);对VP3和相关噬菌体的DNA聚合酶基因作进化树分析,协助判定VP3的分类;对预测的部分启动子区利用报道基因进行活性分析。VP3全基因组为环状双链DNA,长度39504bp;酶切鉴定结果与序列一致。确定了49个ORF,注释了27个ORF的编码产物,其中有20个基因产物与T7样噬菌体同源,包括RNA聚合酶(RNAP)、参与DNA复制的蛋白、衣壳蛋白、尾管及尾丝蛋白、DNA包装蛋白等。DNA聚合酶(DNAP)进化树分析表明VP3与T7样噬菌体有同源性。将预测的10个启动子序列克隆到lacZ融合质粒pRS1274上,经检测均具有启动子活性。测定和分析VP3的基因组序列,基因组结构与进化树分析提示VP3属于T7噬菌体家族。     

单细胞测序技术及应用进展

同一组织中的细胞往往被认为是具有相同状态的功能单位,传统的检测手段分析的是细胞群体的总体平均反应。然而通过对单个细胞的DNA或RNA进行测序,表明组织系统层面的功能是由异质性细胞构成的。单细胞测序以单个细胞为单位,通过全基因组或转录组扩增,进行高通量测序,能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态,反映细胞间的异质性,在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等领域发挥重要作用,正成为生命科学研究的焦点。单细胞测序的难点是单个细胞的分离、单细胞基因组和转录组的扩增。本文主要介绍和分析了单细胞测序技术中常用的单细胞分离技术、单细胞基因组扩增技术和转录组扩增技术及其优缺点,并对当前已经取得成果的应用领域进行了阐述,为单细胞测序技术的研究与应用提供参考。     

一种结合单张芯片序列捕获和高通量测序技术测序外显子组的方法

随着高通量测序技术的发展,全外显子测序已经成为一种研究人类疾病的重要方法.本文展示了一种通过Nimblegen2.1M芯片进行外显子DNA序列捕获和高通量测序的方法,包括两步法文库制备.测序的平均覆盖深度达33倍时,95.6%的34M目标区域得到均衡覆盖,特异性达到80%.对比全基因组鸟枪法测序的结果,此方法在检测SNP时的假阳性率为0.97%,假阴性率为6.27%.本方法对于全基因组扩增的DNA也适用.结果显示,全外显子测序技术可以在大规模的群体研究和医学研究中起到重要作用.     

鸭圆环病毒全基因组克隆与序列分析

为研究鸭圆环病毒全基因组的分子生物学特性,运用重叠PCR技术从鸭组织脏器提取的DNA中扩增出2条核苷酸序列,拼接后对其核酸组成、基因组结构及病毒的遗传变异进行分析.结果表明所获病毒核酸为大小1 995nt的环型DNA,包含6个ORF,与登录在GenBank中克隆株MuDCV(AY228555)的同源性高达97.4%,可见所扩增的核酸序列为鸭圆环病毒基因组序列.     

细菌分型方法研究进展

细菌分型是用于研究不同菌株之间关系的一种手段。对细菌进行分型,有助于病原菌和污染菌的定性和溯源,从而有助于监测传染病的暴发及监控食品污染的发生。近年来各种分型技术取得了长足发展,本文对目前常用的基于脉冲场凝胶电泳(PFGE)、限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、规律成簇的间隔回文重复序列分型(CRISPR)、多位点序列分型(MLST)、全基因组测序分型(WGS)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)等技术的细菌分型方法的原理、应用及优缺点进行了综述。     

斜带髭鲷高质量DNA提取及AFLP分析体系建立

目的:提取斜带髭鲷高质量基因组DNA并建立适用于AFLP分析的体系。方法:以斜带髭鲷(Hapalogenys nitens)为材料提取高质量基因组DNA,并进行AFLP扩增。对AFLP分析体系中几个关键环节(基因组双酶切、连接、预扩增及选择性扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染)做了优化。结果:提取的斜带髭鲷全基因组DNA纯度高,无拖尾。采用9组选择性引物共检测出350个不同的扩增位点,其中多态位点为175个,多态性比例为49.58%。聚丙烯酰胺凝胶电泳图像染色均匀,条带清晰且无背景干扰。结论:该分析体系的建立为斜带髭鲷的群体遗传多态性、种质资源、遗传图谱、遗传育种等研究奠定基础。     

全基因组扩增策略在基因芯片分析SARS冠状病毒实验中的应用

针对SARS冠状病毒的分子生物学检测是控制SARS流行的关键环节。为评价全基因组扩增对SARS微量样本检测的影响 ,采用 6 mer随机引物反转录 ,用加接头的随机引物合成第二链 ,再以接头序列为引物扩增并掺入荧光标记 ,最后与带有 70 mer探针的基因芯片杂交。此非特异方法基本覆盖了样本中的全部DNA ,结果发现SARS冠状病毒全基因组的扩增效果对基因芯片杂交结果的均匀性有较大影响 ,PCR循环次数增多会导致扩增均匀性的降低。分析了不同的引物对全基因组扩增均匀性的影响 ,探讨了全基因组扩增策略的缺陷。