中间锦鸡儿CiCHIL克隆及其黄酮代谢功能研究

植物的次生代谢产物能够为植物的果实和花着色、有助于种子的形成、花粉的传播、适应外界逆境及防御害虫的攻击。苯丙烷代谢途径是植物中一个重要的次生代谢途径,苯丙烷代谢通路上有几条主要的分支,分支下游产生了上千种化合物。查耳酮异构酶（chalcone isomerase,CHI）是苯丙烷通路上的一个关键酶,催化查耳酮到黄烷酮的反应,主要作用是帮助底物进行正确的分子内环化反应,生成的黄烷酮类化合物成为苯丙烷代谢途径下游产物的底物。从中间锦鸡儿干旱胁迫抑制性削减杂交文库中克隆得到一个CHI基因家族成员,序列分析和系统进化分析表明,该基因属于CHIL基因亚家族成员,命名为CiCHIL。实时荧光定量PCR检测发现,该基因受UV-B诱导且过表达CiCHIL具有较强的抵御紫外胁迫的能力。对过表达株系进行RNA和蛋白质水平的检测,对挑选出来的过表达株系进行总黄酮含量检测,发现过表达株系总黄酮含量显著高于野生型。     

重组丙酮酸磷酸双激酶与荧光素酶偶联催化ATP-AMP循环反应

丙酮酸磷酸双激酶（pyruvate phosphate dikinase, PPDK; EC 2.7.9.1）能够可逆催化磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate, PEP）、单磷酸腺苷（adenosine monophosphate, AMP）和焦磷酸盐（pyrophosphate, PPi）生成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）、无机磷酸盐（orthophosphate, Pi）和丙酮酸（pyruvate）.以热玫瑰小双孢菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到了编码PPDK的基因,将此基因片段插入表达载体pET24a (+),在大肠杆菌中表达C端融合His-Tag的重组PPDK.与我们先前表达的N端融合His-Tag的PPDK相比,酶的活性提高了20倍,提示该酶的N端对活性十分重要.重组PPDK单体分子量为98 kD.经过镍亲和层析和超滤后,重组PPDK基本达到电泳纯.重组PPDK与荧光素酶偶联能够形成1个ATP-AMP循环反应,在该循环反应中,荧光素酶催化ATP生成的AMP和PPi能够被PPDK重新转化成ATP,产生一个持续稳定的信号.     

节节草黄酮类化合物的提取及抑菌活性研究

目的：研究节节草地上部位黄酮类化合物的提取方法,并对提取物进行了抑菌试验。方法：比较各种提取方法,通过显色反应、沉淀反应和抑菌实验作用于该提取物。结果：索氏提取法总黄酮得率为0．749％,超声波辅助提取法居次。显色反应呈阳性,沉淀反应生成明显的沉淀;在抑菌实验中产生明显的抑菌圈。结论：超声波辅助提取法是提取节节草总黄酮的比较理想的方法,该植物含有较为丰富的黄酮类化合物,节节草黄酮类化合物对大肠杆菌、八叠球菌等具有明显的抑菌作用。     

利用重组大肠杆菌生产双乙酰

大肠杆菌自身代谢特征具有发酵生产双乙酰的天然优势。利用PCR技术,以广泛用于双乙酰生产的Lactococcus lactis基因组DNA为模板,克隆得到α-乙酰乳酸合成酶基因α-als,将其构建在表达载体pET-30 a上。与能够高效表达3种大肠杆菌来源HSP 70家族分子伴侣的pKJE 7质粒共同转化E.coli BL21(DE3)。利用目的蛋白质分子伴侣共表达的方法,首次获得了能够高效表达具有酶活力的α-乙酰乳酸合成酶的重组大肠杆菌。在静置培养条件下,能够在该菌株的培养基中检测到双乙酰的生成。融合蛋白酶在温度为30-40℃和pH在6-7之间时具有较高的酶活,以丙酮酸为底物,该酶最适pH为6.8,最适温度为39℃。     

具有高谷胱甘肽合成活性重组大肠杆菌的构建及合成反应过程

以野生型大肠杆菌E.coliⅡ为宿主细胞,转化带有编码谷胱甘肽合成酶系的基因gshⅠ和gshⅡ的质粒pGH501,获得了一株谷胱甘肽合成活性、质粒稳定性和传代稳定性俱佳,并且能够重复使用的重组大肠杆菌E.coliⅡ\|1。该菌株经过甲苯处理后,能够在胞外积累4g/L左右的谷胱甘肽(GSH)。在合成反应体系中,提高L谷氨酸浓度可促进GSH合成,但L半胱氨酸浓度增大到20mmol/L后会抑制GSH的合成。根据GSH合成反应中能量辅因子的变化情况,提出E.coliⅡ\|1细胞控制的GSH合成反应机理：由谷胱甘肽合成酶(GSHⅡ)控制的第二步反应的能量供体是ADP而非ATP,该反应是整个GSH合成反应的限速步骤,高浓度ADP可能会抑制GSHⅡ的活性。在GSH合成反应体系中添加100mmol/L的L丝氨酸-硼酸钾混合物,可以有效地防止GSH的进一步降解,反应3 h后,GSH产量达到230mmol/L(约71g/L)。     

人工合成DNA创造“全新微生物”

<正>英国《自然》杂志1月7日公布的一项合成生物学研究显示,科学家首次将人工合成碱基对插入大肠杆菌的DNA中,且并未影响其生长和复制过程。这一成果向利用合成技术"订制"特定生物组织迈进一步。美国研究人员构建出一种自然界不存在的生物体,它稳定包含一种代号为"X-Y"的人工碱基对。在最新研究中,研究人员合成了一段包含天然碱基对和人工碱基对的DNA,将其插入大肠杆菌细胞中。研究的突破之一是发现了一种特殊的转运分子,这种由一种微藻生成的三磷酸转运蛋白,能够运输人造碱基对进入细胞。结果显示,DNA能以适当的速度和准确度进行复制,被改造的大肠杆菌细胞仍继续生长,人工碱基对也没有被去除。研究负责人、斯克里普     

元素衡算和代谢衡算在类人胶原蛋白表达期的应用研究

应用元素衡算和代谢衡算方法,建立用重组大肠杆菌发酵生产类人胶原蛋白表达期的数学模型,并利用非线性优化法对模型中的未知参数进行估算。结果表明该模型与重组大肠杆菌的生长、代谢动力学模型一致,且模型的关键计算参数αh、αp和mx分别为1.173 molo C-mol-1、293.814 molo C-mol-1和17.878 molo C-mol-1oh-1。该模型能较好地预测重组类人胶原蛋白表达期中的宏观反应速率,且在类人胶原蛋白发酵表达期,必须通过控制葡萄糖的补料速率来控制菌体的生长,当?=0.04 h-1时,类人胶原蛋白的比生成速率达最大值。     

来源于大肠杆菌的NMN转移酶的克隆表达与酶学性质研究

在生物体内,NMN(烟酰胺单核苷酸)转移酶能够催化NMN生成NAD.本研究通过构建重组表达质粒pET30α(+)-Nmnat,成功实现来源于大肠杆菌的NMN转移酶基因(Nmnat)的原核表达.从大肠杆菌基因组中克隆得到的NMN转移酶基因长度为1 245 bp,所编码的重组酶分子量45 kDa.对重组酶的酶学性质进行分析,结果显示该酶最适反应温度和pH分别为37℃和7.5.4℃下,该酶的热失活半衰期可长达990.2 min.Mn2+、Fe2对该酶的酶活的激活作用显著,而EDTA对酶活能造成明显的抑制作用.酶动力学分析结果显示,该酶对底物NMN催化的Km和Vmax分别为16.89 mmol/L和2.46 μmol/(L·min).该NMN转移酶基因在大肠杆菌宿主中的成功表达,为NAD生物合成应用研究奠定了基础.     

乙醇合成途径的计算机重构

目的:用计算机重构乙醇合成途径,为合成生物燃料乙醇提供理论依据。方法:利用KEGG反应、化合物数据提取反应等式,过滤掉42个通用代谢物参与的反应,然后利用剩下的反应构建反应矩阵;利用广度优先搜索算法在反应矩阵中搜索生成乙醇的代谢途径。结果:计算机重构了23 108条乙醇合成途径,以大肠杆菌作为产乙醇基因工程菌为例,通过限制改构菌整合的关键酶数目,分别得到了78条以酒精O-乙酰基转移酶为关键酶的乙醇合成通路和89条以丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶为关键酶的乙醇合成通路,并构建了相应的乙醇合成网络图,标注每个反应的酶及编码该酶的基因。结论:通过计算机方法重构了多种乙醇合成途径,可以为利用微生物工业化生产乙醇提供理论依据。     

共表达极端菌伴侣蛋白prefoldin提高P450 BM3突变体催化效率

P450 BM3来源于巨大芽孢杆菌,其突变体(A74G、F87V、L188Q、D168H)能够在大肠杆菌细胞内催化吲哚合成靛蓝．然而在常规的培养条件下(37℃,250 r/min),大肠杆菌细胞内靛蓝的生物转化量极低．本文将极端嗜热古菌Pyrococcus furiosus的分子伴侣蛋白与P450 BM3突变体在大肠杆菌进行共表达,以研究分子伴侣蛋白是否能够提高靛蓝的生物转化量．实验结果表明,极端嗜热古菌的分子伴侣蛋白prefoldin能够显著提高靛蓝的产量．同时,实验结果发现prefoldin能够明显提高大肠杆菌细胞内的NADPH/NADP+比率．鉴于NADPH是参与靛蓝生物转化过程的重要因素,靛蓝生物转化量的显著增加可能与该比率的提高有关．     

细胞色素P450蛋白在不对称环丙烷化反应中的研究进展

在过去几十年间,运用手性金属催化剂进行不对称环丙烷化反应,一直是有机化学领域的研究热点,并且取得了令人瞩目的成就。合成生物学方法因其具有环境可持续性以及良好的能量效率等优点,逐渐成为一种新的研究趋势。为了弥补天然酶催化的局限性,将生物体内部的酶反应与工业界的合成反应之间形成无缝对接是当务之急。与传统化学手段相比,利用细胞色素P450催化合成不对称环丙烷具有显著的优势。本文中,笔者综述了近年来细胞色素P450在不对称环丙烷反应的研究状况。     

圈卷产色链霉菌硝基烷类氧化酶的分离纯化及酶学性质

圈卷产色链霉菌硝基烷类氧化酶基因naoA在大肠杆菌中获得了成功表达,从含有重组质粒pNA101(pET23b∷naoA)的工程菌株BL21(DE3)中分离纯化了硝基烷类氧化酶,SDSPAGE检测为均一。对纯酶进行了酶学性质及动力学研究。底物为1硝基丙烷、2硝基丙烷和硝基乙烷时,在04mol/L的磷酸缓冲液中,酶的最适反应pH值为7～8,最适反应温度为48℃～56℃。室温保存6d后,酶的活性保持了43.3%,但对60℃以上的高温敏感。硫醇化合物如巯基乙醇、还原型谷胱甘肽不同程度地抑制酶活性,特别是NADH,其浓度为1mmol/L时,酶活性几乎全部丧失。以1硝基丙烷为底物时,NaoA的Km为357mmol/L,Vmax为0199μmol/(μg.min)。     

人纤溶酶原饼环区5基因的原核表达及活性测定

 人纤溶酶原饼环区 5 (hPgnK5 )是新的血管生成抑制因子 .PCR法改造hPgnK5基因 ,所得hPgnK5基因包括编码人纤溶酶原C4 62 到P54 4共 83个氨基酸残基 ,而且在 5′ ,3′分别引入了EcoRⅠ和BamHⅠ位点 .以pThiohisA构建hPgnK5基因原核表达载体 ,在大肠杆菌TOP10中表达该蛋白 .通过柱层析法获得hPgnK5纯化蛋白 .免疫印迹反应表明该蛋白具有hPgnK5免疫活性 .体外实验表明 ,该蛋白具有抑制血管内皮细胞增殖活性 .提示hPgnK5可能具有良好应用前景     

植物苯丙烷代谢及其对重金属胁迫的响应研究进展

苯丙烷代谢途径是植物中最重要的次生代谢途径之一,在植物抵抗重金属胁迫中直接或间接发挥了抗氧化作用,并能够提高植物对重金属离子的吸收与胁迫耐性。本文就苯丙烷代谢途径核心反应与关键酶系进行了总结,同时分析了木质素、类黄酮及原花青素等关键代谢产物的生物合成过程及相关机制,并以此为基础探讨了苯丙烷代谢途径关键产物响应重金属胁迫的相关机制。此外,结合当前研究现状,就苯丙烷代谢参与植物防御重金属胁迫的相关研究提出展望,以期为重金属污染环境的植物修复提供理论依据。     

一种基于代谢网络分析最小化基因组的方法及其在大肠杆菌中的应用

最小生命体的合成是合成生物学研究的重要方向。最小化基因组的同时而又不对细胞生长产生影响是代谢工程研究的一个重要目标。文中提出了一种从基因组尺度代谢网络模型出发,通过零通量反应删除及对非必需基因组合删除计算获得基因组最小化代谢网络模型的方法,利用该方法简化了大肠杆菌经典代谢网络模型iAF1260,由起始的1 260个基因简化得到了312个基因,而最优生物质生成速率保持不变。基因组最小化代谢网络模型预测了在细胞正常生长的前提下包含最少基因的代谢途径,为大肠杆菌获得最小基因组的湿实验设计提供了重要参考。     

大肠杆菌鞭毛调控基因flhDC与生物材料植入感染的研究进展

随着生物材料被广泛应用于临床,生物材料植入感染成为令人棘手的常见医院内感染,有报道占院内感染的50%,大肠杆菌是临床以生物材料为中心感染的优势菌种。生物材料表面的细菌生物膜使其膜内细菌能有效抵御抗生素治疗和机体的防御反应,是导致生物材料为中心感染难以控制的根源。大肠杆菌的运动性与细菌生物膜形成密切相关,鞭毛是大肠杆菌的运动器官,鞭毛的生成需要三级基因的表达,操纵子flh DC编码鞭毛生成的一级主调控基因。我们推测:"鞭毛调控基因flh DC的表达→鞭毛的生成→细菌的运动性→细菌生物膜形成"之间存在着一一对应的关系,这为临床防治生物材料植入感染提供新思路。本文就以大肠杆菌鞭毛调控基因flh DC与生物材料植入感染做一简要综述。     

大肠杆菌中高效表达rhBMP-4的探讨及初步活性测定

目的 在大肠杆菌中表达具有生物活性的rhBMP-4。方法 在不改变氨基酸序列的前提下,以全基因合成的方式对人BMP-4成熟肽基因全长进行定点突变,将之重组入pET-3c表达载体并转化至大肠杆菌BL21(DE)plysS。IPTG诱导和包涵体复性后,利用C2C12细胞横向成骨细胞分化实验以及小鼠肌袋异位骨形成实验检测其活性。 结果 获得0.348 kb的BMP-4 DNA序列,表达的目的蛋白主要以包涵体的形式存在。经纯化及复性后,体内与体外的活性检测表明rhBMP-4有良好的诱骨生成活性。结论 该方案能够实现rhBMP-4在大肠杆菌中的高效表达。     

极端耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的高效表达

以海栖热袍菌 (Thermotoga maritima) MSB8菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增出木聚糖酶（XylanaseB）基因, 将此基因克隆至大肠杆菌表达载体pET_28a（+）和毕赤酵母表达载体pPIC9K,并分别转化大肠杆菌 BL21和毕赤酵母GS115。该木聚糖酶在大肠杆菌细胞中表达量高, 但不能分泌; 而在毕赤酵母细胞的表达产物可分泌至胞外。酶学性质分析表明,此酶分子量约为40kD,其最适反应温度为90℃, 最适反应pH值为6.65,且在碱性条件下稳定,具有重要的工业应用前景。     

控制番茄果实成熟的基因工程

乙烯是植物的一种催熟激素,其合成前体是蛋氨酸(Met),它通过三步反应形成乙烯: 乙烯通过分子克隆与异源系统表达,已鉴定了腺苷甲硫氨酸(AdoMet)合成酶[反应(1)],1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合成酶[反应(2)]与ACC氧化酶[反应(3)]的编码基因。该途径的限制步骤是ACC合成酶催化的反应(2)。应用基因工程的方法已将ACC合成酶、Acc     

Met对渗透胁迫下小麦幼苗内源多胺含量和乙烯产生的影响

渗透胁迫下,小麦幼苗内源多胺含量和乙烯产生均明显增加,再用0．4mmoL甲硫氨酸掺人处理后,乙烯释出加速,精胺含量进一步增多,亚精胺含量变化不大,腐胺的含量几乎减少到胁迫前的水平。可见,渗透胁迫下,甲硫氨酸既可以在Met循环中以甲硫氨酸与腐胺联合生成亚精胺,进而再与亚精胺联合生成精胺,又可以S-腺苷甲硫氨酸分解生成5’-甲硫基腺苷和氨基环丙烷羧酸,最后由氨基环丙烷羧酸加氧生成乙烯。