cAMP反应元件萤光素酶报告基因载体的构建简

目的：构建含有cAMP反应元件（CRE）的萤光素酶报告基因载体。方法：以含有ga14位点的萤光素酶报告基因质粒为模板,利用PCR方法,在去除ga14位点的同时,连入4个CRE元件得到pCRE-luc;将该载体与G蛋白偶联受体（GPCR）共转染人胚肾细胞HEK293,测定萤光素酶活性;应用蛋白激酶A（PKA）抑制剂确认CRE的活性是否与Gs通路相关。结果：pCRE-luc的活性直接相关于GPCR的激活程度,并依赖Gs信号通路。结论：CRE萤光素酶报告基因载体构建成功,可用于检测Gs偶联GPCR的活性,为基于GPCR的高通量药物筛选奠定了基础。     

雄激素应答元件假冒DNA对PSA基因启动子的抑制作用

研究雄激素应答元件假冒DNA(AREdecoy)对前列腺特异抗原 (PSA)基因启动子的抑制作用 .联合运用报告基因和假冒DNA策略 ,构建了含PSA基因 5′侧启动子区 6 40bpDNA的萤光素酶表达载体pGL3 PSA ,与人工合成的双链硫代ARE假冒DNA共转染前列腺癌细胞株PC3 M并作用不同的时间 (2 4h、4 8h、72h) .应用双萤光素酶测定系统 ,检测萤光素酶的表达活性 .结果显示 :AREdecoyDNA显著抑制报告基因萤光素酶的表达 ,抑制率可达 95 % ,而对照decoyDNA无此作用 .作用不同的时间对萤光素酶活性的抑制无显著性差异     

人p53启动子萤光素酶报告基因的构建及其活性测定

目的：克隆p53基因的启动子,插入萤光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增人p53启动子,插入萤光素酶报告基因载体pGL4．0-empty,将重组质粒转染293T、ZR75-1、HepG2、A549细胞,测定p53启动子的转录活性。结果：构建了p53启动子的萤光素酶报告基因;通过测序及质粒酶切鉴定,所构建的p53启动子正确;活性实验表明,报告基因在多种细胞中显示构建的p53启动子活性,并呈现一定的剂量效应;转录因子USF能以剂量效应方式提高p53报告基因的转录活性。结论：克隆了人p53启动子,为进一步研究调控p53的转录因子奠定了基础。     

高效缺氧诱导表达载体的构建与鉴定

目的：构建缺氧诱导表达载体,以介导报告基因在缺氧环境下的特异、高效表达。方法：通过分子生物学方法,将鼠磷酸甘油酸激酶基因的缺氧应答元件（HRE）和最小CMV（mCMV）启动子重组,构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）或萤光素酶报告基因的可诱导载体;通过酶切鉴定和测序分析,证实载体获得正确的构建;将重组载体转染HeLa细胞,观察EGFP荧光强度并检测萤光素酶活性。结果：HRE／mCMV启动子调控的报告基因载体具有特异和高效的诱导活性。结论：构建了可以进行特异和高效缺氧诱导的报告基因载体,为其进一步的开发和应用奠定了实验基础。     

用于筛选shRNA的新型双萤光素酶报告基因载体的构建及应用

目的:构建一个新型双萤光素酶报告基因载体用于准确高效地筛选有效抑制靶基因表达的shRNA。方法:采用PCR、定向克隆、基因重组等分子生物学方法,将双萤光素酶报告基因系统中需要的报告基因载体、shRNA真核表达载体和内参载体三个功能,整合于一个新型的双萤光素酶报告基因载体pFLuc-C-TK-RLuc-shRNA之中。应用该载体对靶向人PD1基因以及Furin基因的shRNA进行干涉效果比较。结果:应用p FLuc-C-TK-RLuc-shRNA载体进行单质粒转染方法与传统的三质粒转染方法均提示shRNA#1对靶基因PD1的抑制效果最优;但是使用新型双萤光素酶报告基因载体检测结果的标准差数值显著低于传统方法。以pFLuc-C-TK-RLuc-shRNA单质粒转染方法得到的各组样品结果的均一性显著提高,能够准确地反映出shRNA#3较shRNA#2具有更强的Furin基因抑制作用;而传统方法未能有效判断二者的差异。结论:新型双萤光素酶报告基因载体简化了操作步骤,降低了传统三质粒共转染方法所引起的检测结果大幅波动,进一步增强了双萤光素酶报告基因系统的信噪比,提高了筛选抑制靶基因表达shRNA的准确性。     

含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的慢病毒载体的制备与表达分析

目的:制备含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的慢病毒载体,为慢病毒载体的进一步广泛应用奠定基础。方法:克隆构建含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的转基因载体pCS-gluc-2A-eGFP,酶切与序列分析鉴定其正确后,与包装质粒pCMVHR’Δ8.2、包膜质粒pVSV-G共转染293FT细胞,获得含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的重组慢病毒载体;重组慢病毒载体感染A549、Huh7细胞后,用荧光显微镜直接观察报告基因GFP的表达,或取细胞上清实时检测分泌型萤光素酶的表达。结果:制备了含双报告基因的重组慢病毒载体,感染细胞后可以活体观察绿色荧光蛋白的表达,也可以快速灵敏地检测到分泌型萤光素酶的表达。结论:所获含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的重组慢病毒载体感染效率高,表达易于活体实时检测,灵敏度高。本研究为慢病毒载体的广泛应用奠定了基础。     

端粒、端粒酶结合因子hPinxl基因启动子的克隆及活性分析

目的：克隆端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因的启动子,分析并鉴定其活性调控元件。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增出hPinx1启动子,构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在HepG2细胞中检测其活性。结果：克隆了hPinx1基因转录起始位点上游4661bp且序列正确;活性分析表明hPinx1启动子含有多个调控元件,其中核心序列位于530bp内,在1329-2174bp间存在正调控序列,在2174-4661 bp间存在负调控序列。结论：构建的hPinx1启动子具有活性,为hPinx1的功能研究提供了重要基础。     

CYP7A1基因启动子克隆及萤光素酶报告基因载体构建

目的:克隆细胞色素P450 7A1(CYP7A1)基因启动子,构建以CYP7A1基因启动子为启动序列的双萤光素酶报告基因系统并分析其活性,为研究CYP7A1基因转录调控提供有效筛选工具。方法:采用PCR方法克隆CYP7A1基因启动子序列,连接到pUC57载体中,双酶切后连接至萤光素酶报告质粒pGL3-Basic上,构建重组萤光素酶报告质粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc。结果:重组质粒经双酶切和测序,证实构建正确;pGL3-CYP7A1-promoter-luc质粒2、3转染HepG2细胞均具有显著性启动子活性,pGL3-CYP7A1-promoter-luc2转染24和48 h后经检测分别为对照组(pGL3-basic空载体)的13.1±2.8倍(P0.001)和23.3±2.9倍(P0.001);pGL3-CYP7A1-promoter-luc3转染24、48 h后,荧光响应值分别是对照组的8.4±1.6倍(P0.001)和22.1±1.9倍(P0.01),呈现强启动子活性。结论:构建了CYP7A1基因启动子萤光素酶报告基因重组质粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc,为后续深入研究药物对其调控作用机制奠定了基础。     

人免疫缺陷病毒假病毒药物筛选模型的构建及其应用

目的:构建人免疫缺陷病毒(HIV)假病毒模型,用多种HIV逆转录酶和蛋白酶抑制剂作用于该模型,以检测其是否能有效用于HIV抑制药物的筛选。方法:通过载体改造获得最终慢病毒载体puc18-NL4-3-LUC-stop,其中含有萤光素酶基因,将该载体与包膜质粒VSV-G共转染293FT细胞,包装产生HIV假病毒,在假病毒包装和病毒感染293FT细胞的过程中加入蛋白酶和逆转录酶抑制剂,通过检测感染细胞中萤光素酶的表达来检测该模型的有效性,并利用此模型检测药物的抗病毒效果。结果:将HIV逆转录酶和蛋白酶抑制剂作用于该假病毒模型时发现萤光素酶的表达得到很大程度的抑制。结论:建立了HIV假病毒药物筛选模型,该模型以萤光素酶基因作为报告基因,快速灵敏,在抗HIV药物筛选中有一定的应用价值。     

人TANK结合激酶1的基因克隆、表达及生物活性鉴定

目的:克隆人TANK结合激酶1(TBK1)基因,构建其真核表达载体,检测该基因在293细胞中的表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测其生物活性。方法:应用RT-PCR方法,以HeLa细胞RNA为模板,扩增获得TBK1基因,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中,以LipofectAMINE2000转染试剂转染pcDNA-Flag-TBK1至293细胞中进行瞬时表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测诱导β干扰素(IFN-β)转录的情况。结果:测序结果表明,从人HeLa细胞总RNA中克隆到正确的TBK1基因全长编码序列,利用Western印迹检测其在293细胞中获得有效表达,利用萤光素酶报告基因实验检测TBK1可以诱导IFN-β转录激活。结论:真核表达的人TBK1具有相应的生物学活性,为研究其功能奠定了基础。     

GP73及其糖基化修饰对肝癌细胞HepG2炎症相关分子信号通路的影响

目的:通过构建高尔基体膜蛋白73(GP73)氨基酸序列109、144位糖基化位点双突变真核表达质粒,研究GP73及其糖基化修饰对肝癌细胞炎症相关分子信号通路的影响。方法:根据GP73的DNA序列,设计合成2对针对GP73氨基酸序列109、144位糖基化位点突变的PCR引物,以本实验室构建的野生型质粒pc DNA3-Flag-GP73为模板,构建GP73的109、144位糖基化位点双突变质粒pc DNA3-Flag-GP73(DM);用脂质体将此双突变质粒转染293T细胞,用糖蛋白染色和免疫印迹检测该质粒在细胞中的表达情况,用双萤光素酶报告基因实验检测GP73及其糖基化修饰对Hep G2细胞中NF-κB转录激活的影响。结果:糖蛋白染色和免疫印迹结果证实构建的双突变质粒pc DNA3-Flag-GP73(DM)能够表达GP73双糖基化位点突变的蛋白,且糖基化位点的突变使GP73的糖基化修饰完全缺失;双萤光素酶报告基因实验结果表明,野生型GP73能够激活Hep G2细胞中NF-κB的转录活性,而双糖基化位点突变会使GP73失去此激活作用。结论:构建了GP73双糖基化位点突变的真核表达质粒pc DNA3-Flag-GP73(DM)。GP73参与激活肝癌细胞炎症信号通路,糖基化修饰对于GP73发挥此作用是必不可少的。     

水稻幼苗特异应答H2O2的miRNA169b启动子表达载体的构建

目的:研究microRNA169b(miRNA169b)启动子不同长度片段的活性及自身调控。方法:用生物信息学方法分析水稻中miRNA169b前体上游1500 bp序列,并从水稻幼苗基因组DNA中扩增miRNA169b前体上游500、1000和1500 bp启动子片段,分别将3个片段克隆至萤光素酶报告基因载体p5XGal4-LUC上。结果:构建了miRNA169b启动子重组载体,序列分析表明与预期结果一致。结论:miRNA169b启动子调控的萤光素酶报告基因表达载体的构建,为研究水稻中miRNA基因自身的转录奠定了基础。     

端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因启动子的克隆及活性分析

目的：克隆端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因的启动子,分析并鉴定其活性调控元件。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增出hPinx1启动子,构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在HepG2细胞中检测其活性。结果：克隆了hPinx1基因转录起始位点上游4661bp且序列正确;活性分析表明hPinx1启动子含有多个调控元件,其中核心序列位于530bp内,在1329-2174bp间存在正调控序列,在2174-4661 bp间存在负调控序列。结论：构建的hPinx1启动子具有活性,为hPinx1的功能研究提供了重要基础。     

呼吸道黏蛋白5AC基因转录表达的顺式调控元件分析

目的：探讨呼吸道黏蛋白（mucin,MUC）5AC基因5'上游序列顺式调控元件在中性粒细胞弹力酶(neutrophil elastase , NE)诱导MUC5AC基因转录表达的调控机制。方法：应用DNA重组技术,构建含萤光素酶报告基因和MUC5AC启动子不同长度片段的嵌合质粒。采用定点突变技术,在嵌合质粒的基础上构建MUC5AC启动子区特殊蛋白（specificity protein）-1和核因子(nuclear factor, NF)-κB结合位点单独突变体,并测定NE刺激的转染细胞荧光素酶相对活性。结果：成功构建了4种含有不同长度MUC5AC基因启动子序列的荧光索酶报告基因质粒。含有启动子序列-1330bp、-689bp、-324bp的嵌合质粒荧光素酶相对光强度较对照组均显著增加,而含有启动子序列-64bp的嵌合质粒荧光素酶相对光强度与对照组相比差异无统计学意义。NE可诱导含有MUC5AC启动子区NF-кB结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-NF-кB-MU）荧光素酶相对光强度增加,而NE不能诱导Sp-l结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-SP-1-MU）荧光素酶表达增加。结论：MUC5AC 5'上游序列中-324～-64位点存在参与NE诱导MUC5AC基因表达的重要调控元件,位于此区域的顺式作用元件Sp-1位点在NE诱导MUC5AC基因表达机制中起重要作用,该位点可能作为靶向性基因治疗的关键调控元件。     

血管内皮细胞生长因子启动子突变体萤光素酶报告基因载体的构建

目的：构建含有不同片段血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因的启动子的萤光素酶报告基因载体,并定位缺氧诱导因子1a（HIF-1d）结合VEGF启动子的区域。方法：以VEGF全长启动子为模板,PCR扩增VEGF启动子的不同片段,插入萤光素酶报告基因载体pGL4-basic,确定所扩增的DNA序列后,将其与HIF-1a表达载体共转染293T细胞,定位HIF-1a结合VEGF启动子的区域。结果：测序结果表明扩增的不同片段的VEGF启动子序列正确;萤光素酶活性实验表明,-1128～-728bp片段是HIF-1a与VEGF相互作用激活VEGF启动子转录活性的区域。结论：克隆了VEGF启动子5’端缺失突变体报告基因表达载体,为调控VEGF表达的转录因子的筛选及功能研究打下了良好基础。     

骨形成蛋白诱导型真核载体的构建及其表达

成骨分化相关基因骨钙素 (OC)等的启动子内均含有成骨特异性转录因子Cbfa1特异性作用元件 ,而骨形成蛋白 (bonemorphogeneticprotein ,BMP)的促成骨分化作用正是通过其首先引起Cbfa1的升高 ,而后Cbfa1激活这些基因的表达 ,最终出现成骨分化表型 .为解决BMP没有理想的活性测定方法的问题 ,在RT PCR结果证实BMP 2可促进NIH3T3和C2C12细胞Cbfa1表达后 ,构建了串联6个Cbfa1作用元件的小鼠OC部分启动子 (6OCP)控制萤光素酶 (luciferase)报告基因的真核表达质粒 ,以期来放大BMP诱导报告基因表达的作用效果 .即通过细胞转染、rhBMP 2刺激后检测萤光素酶活性变化 ,从而间接定量测定rhBMP 2的生物学活性 .结果表明 ,pcDNA3 6OCP Luc转染细胞后其报告基因的基础活性较pcDNA3 Luc大为降低 ;而且在一定剂量范围内 ,转染细胞的萤光素酶活性 (荧光值 )随rhBMP 2剂量增加而升高 ,并呈线性正相关 ,为建立BMP活性定量测定的方法打下基础     

TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体的构建、表达及生物活性鉴定

目的:构建TANK结合激酶1(TBK1)相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体真核表达载体,检测该基因相关突变体在293细胞中的表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测其生物活性。方法:根据文献报道的突变序列及QuickChange Site-Directed Mutagenesis实验设计手册,设计合成2条针对TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体的引物,以实验室之前构建的TBK1野生型真核表达载体为模板,构建TBK1激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体真核表达载体,分别命名为pcDNA3-Flag-TBK1(KD)、pcDNA3-Flag-TBK1(ΔULD)。以LipofactAMINE2000转染试剂转染至293细胞中进行瞬时表达,利用萤光素酶实验检测2种TBK1突变体诱导β干扰素(IFN-β)转录的情况。结果:测序结果表明,TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域缺失突变体真核表达载体构建成功,Western印迹检测表明其在293细胞中获得有效表达;用萤光素酶报告基因实验检测,与野生型TBK1相比,其相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域缺失突变体诱导IFN-β转录激活的作用明显降低。结论:真核表达的TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体具有相应的生物学活性,为研究其功能奠定了基础。     

表达萤光素酶的HIV药物筛选细胞模型的建立

目的:构建基于萤光素酶的单次复制人免疫缺陷病毒(HIV)细胞模型,用于抗HIV药物的筛选。方法:构建含萤光素酶报告基因的假型慢病毒质粒,将疱疹性口炎病毒外膜糖蛋白(VSV-G)的表达质粒、HIV-1 Rev蛋白表达质粒、HIV Gag-Pol蛋白表达质粒和含萤光素酶报告基因的重组慢病毒质粒共转染HEK 293FT细胞,制备假型慢病毒;在假型慢病毒生产和再感染新鲜HEK 293FT细胞的过程中加入逆转录酶和蛋白酶抑制剂(如AZT),检测再感染的细胞中萤光素酶的表达水平,从而判断药物对HIV的抑制作用。结果:构建了含萤光素酶报告基因的重组慢病毒质粒pLenti-Luc;利用已知抗HIV药物AZT进行测试,发现HIV药物处理组细胞中萤光素酶活性远低于对照组。结论:建立了基于萤光素酶的HIV药物筛选细胞模型,该系统使用单次复制的报告病毒,具有良好的安全性,而使用萤光素酶基因作为报告基因使该系统具备极高的敏感性,该系统适合于进行高通量药物筛选。     

TBK1通过增强雌激素受体α的转录活性参与乳腺癌发生的分子机制

目的:研究乳腺癌细胞中TANK结合激酶1(TBK1)的功能及分子机制。方法:利用含有雌激素应答元件(ERE)的萤光素酶报告基因检测TBK1对雌激素受体α(ERα)转录活性的影响;将TBK1参与激活先天免疫途径的关键位点突变,使其丧失激活先天免疫的功能,再用同样方法检测TBK1突变体对ERα转录活性的影响;采用RT-PCR检测TBK1通过磷酸化修饰对ERα下游基因表达水平的影响。结果:TBK1增强ERα的转录活性,从而增强其下游基因的表达。结论:TBK1能以不依赖于其激活先天免疫途径功能的方式增强ERα的转录活性。     

斑马鱼tnfb启动子的克隆和报告基因载体的活性分析

本研究通过采用生物信息学软件预测细胞因子tnfb基因5'上游2 000 bp左右的序列,并预测其相关的转录因子,克隆启动子,构建双荧光素酶报告基因表达载体,经双酶切和测序鉴定,最后通过双荧光素酶报告基因系统检测重组载体的活性。研究发现tnfb的转录因子结合位点为:Oct-1、TBP、GATA-1、RSRFC4、GLO、C/EBPα、NF-资B、ER、Pit-1a、Oct-2、Oct-2.1、RAP1。tnfb的启动子区没有发现Cp G岛,其5'侧翼序列含有与转录密切相关的TATA Box和CAAT Box转录元件。将tnfb的启动子片段插入p GL3-enhancer构建p GL3-tnfb-promoter-enhancer质粒后,质粒经酶切测序显示酶切片段大小一致,序列正确;转染了p GL3-tnfbpromoter的Raw264.7细胞的相对荧光素酶活性高于对照组细胞,双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的p GL3-tnfb-promoter-enhancer具有启动子活性。为研究tnfb参与的免疫相关的信号通路之间的调控提供了有力的研究工具。